Summary
En tilpasningsdygtig reverse genetisk metode til zebrafisk til at vurdere gen funktion under senere stadier af udvikling og fysiologiske homeostase såsom væv regenerering hjælp intraventrikulære injektioner af gen-specifikke morpholinos.
Abstract
Zebrafisk er en vigtig model for at forstå cellen og molekylærbiologi orgel og vedhæng regenerering. Men molekylære strategier til at ansætte revers genetik er endnu ikke blevet tilstrækkeligt udviklet til at vurdere genfunktion i regenerering eller vævshomeostase under larvestadier efter zebrafisk embryogenese, og flere væv i zebrafisk larve er vanskelige at målrette. Intraventrikulære indsprøjtninger af genspecifikke morpholinos tilbyder en alternativ metode til den nuværende manglende evne til at genomically målrette zebrafisk gener i en tidsmæssigt kontrolleret måde på disse stadier. Denne fremgangsmåde giver mulighed for fuldstændig dispergering og efterfølgende inkorporering af morpholino i forskellige væv i hele kroppen, herunder strukturer, der tidligere var umuligt at nå som de i larvestadiet halefinnen en struktur, der ofte anvendes til ikke-invasivt at forske vævsregeneration. Flere gener aktiveres under larvestadiet finfold regenerering også præsent regenerere voksen hvirveldyr væv, så larven er en nyttig model til at forstå regenerering hos voksne. Denne morpholino dispersion metode giver mulighed for hurtig og nem identifikation af gener, der er nødvendige for regenerering af larvernes væv samt andre fysiologiske fænomener, der regulerer vævshomeostase efter embryogenese. Derfor er denne leverance metode giver et aktuelt behov for strategi for tidsmæssig kontrol til evaluering af gen-funktion efter embryogenese.
Introduction
Regeneration af organer og lemmer er fundamentalt vigtig for overlevelse og fitness; Imidlertid har flere hvirveldyr, herunder mennesket begrænset regenerative evner. Mens flere dyremodeller findes, der har omfattende regenerationsevne, reverse genetiske teknikker til at vurdere gen funktion under orgel og vedhæng regenerering fortsat er meget begrænset eller ikke-eksisterende. Derfor er nye metoder påkrævet for at dissekere molekylærbiologi regenerering i disse modelorganismer.
Zebrafisken er en veletableret model for forståelse af cellen og molekylær biologi orgel og vedhæng regenerering 1, ikke kun på grund af sin betydelige evne til at regenerere flere organer, væv og vedhæng, men også fordi flere transgene fisk linjer eksisterer for at spore celler og at overudtrykke genkonstruktioner 2, 3. Dog er gen hæmning i larvernes zebrafisk hovedsagelig begrænset til overexpression af dominerende-negative konstruktioner, som ikke er tilgængelige for alle gener af interesse, eller hvis transgen produkt kan erhverve gain-of-funktion effekter, der ikke afspejler den endogene aktivitet af genet. Således er der behov for en alternativ metode til specifikt at fjerne genekspression ved knockout eller knockdown at overvinde disse problemer.
Gene målretning hjælp TALENS eksisterer som en omvendt genetiske middel til knockout-gen funktion; men denne knockout strategi er meget ofte begrænset til funktionelle vurderinger under tidlig embryogenese, da de oprindelige krav af genet forhindre yderligere progression af fosterudviklingen. Således studere senere fænomener som regenerering eller orgel homeostase efter udvikling ved hjælp TALENS er udelukket 4, 5. Derfor er der behov for en alternativ gen fjernelse strategi, der er målrettet gen funktion efter tidlig udvikling for at vurdere gen krav fuldt dannede organer og strukturer. Morpholino injektion har vist sig at være effektiv i at målrette gener i et par voksne organer, og den voksne regenererende fin 6-8, men disse metoder kræver elektroporering og mange indre organer er vanskelige at elektroporere enten på grund af deres placering eller på grund af deres følsomhed over for elektrisk forstyrrelser. Desuden er det vanskeligt at injicere direkte nogle væv i larve, fordi direkte injektion kan forstyrre deres strukturelle integritet eller fordi deres størrelse er begrænsende. Halefinnen af larve er en sådan struktur, fordi direkte injektion i finfold er ikke mulig. Blev således behov for et alternativ til elektroporation og direkte indsprøjtning til at målrette gener i væv, der enten er for lille til at injicere eller ikke kan elektroporeret.
For at målrette og inhibere funktionen af specifikke gener under regenerering af larvestadiet halefinnen, har vi modificeret eksisterende morpholino teknologier gør det muligt for enURDERING af gen-funktion under halefinne regenerering i sen-iscenesat larve. Denne metode anvender intraventrikulær levering 9 i fluorescein-mærkede morpholinos sammen med Endo-Porter-transfektionsreagens 10. Når i ventrikel, morpholino-Endo-Porter-blanding hurtigt breder sig i hele larve via karrene og går væv, der tidligere har været umuligt at målrette. Denne injektion metode kan ændres til at målrette gener i specifikke væv og muligvis kan anvendes i andre dyremodeller, der i øjeblikket mangler reverse genetiske metoder til at hæmme genfunktion. Således, det giver en hurtig og nem metode med potentiale for bred vifte brug for straks at studere gen funktion under generel orgel homeostase og regenerering ved larvestadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Glass Needles (figur 1)
- Brug glaskapillarer med en diameter 0,75 mm for at forberede injektionsnåle (figur 1a).
- Placer glaskapillar ind i en nål aftrækker og træk nålen med følgende parameter: opvarmning cyklus værdi: 463; trække cyklus værdi: 230; hastighed: 150 msek; tid: 150 ms (figur 1b).
- Bryd trukket glas kapillar med urmager pincet til at producere en 20 um diameter nål under et stereoskop med en mikrometer okular.
- Brug en drejebænk med en fugtet gummi spinderok at skærpe nålen og producere en 20 um bevel (figur 1C og 1D). Bemærk: Sharp, affasede nåle forbedre lettere indføring i ventriklen og dermed minimere skade på vævet og tillade den perforerede muskler til at genlukke efter fjernelse af nålen (figur 1E-G).
2.. Preparsættelse af Morpholino Solution
- Forbered morpholino lager ved at opløse det lyofiliserede morpholino 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 7,5 mM. [Se fabrikantens anvisninger for detaljer (Materialer bord)].
- Morpholino injektion løsning klargøres ved at blande 2,5 ul morpholino stamopløsning (7,5 mm) med 2,8 pi Endo-Porter stamopløsning (1 mM) (Se Materialer tabel) for en endelig koncentration på 3,5 mM morpholino og 0,5 mM Endo-Porter.
3.. Fremstilling af Morpholino injektion (figur 2)
- Læg den facetslebne glas nål med 5 mikroliter af denne opløsning ved hjælp af en mikropipette med en 10 ul microloader pipettespids.
- Sæt glasset nålen i nåleholderen af mikromanipulator tilsluttet pneumatiske pico pumpen (figur 2A-C).
- Placer nåleholderen ved siden af mikroskop, så nålen kun behovskal flyttes i den ene plane retning for at indsætte det i hjertets ventrikel larve (figur 2A).
- Juster vinklen for injektioner på omkring 45 °.
- Indstil mikroinjektor værdier som følger: hold pres: 20 pounds per kvadrattomme (psi); udslyngning tryk: 15 psi; 100 msek række gating, periode-værdi på 1,9 (svarer til 10,9 msek).
- Smelt agarose i 1x PBS ved hjælp af en standard mikrobølge at fremstille 20 ml af en 1,5% (w / v) gel. Hæld smeltet gelen i en 10 cm petriskål. Placer en rillet indsprøjtning formular i det varme agarose så når hærdet, vil agarose have furer, hvor bedøvet larve vil blive placeret 11 (figur 2D og 2E).
4.. Injektioner (figur 3)
- Bedøver larve i 100 ml akvariet vand med 20 mg / L tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoat methan sulfonat), indtil de stopper med at svare at røre ved.
- Brug en plastik Pasteur pipette omhyggeligt overføre bedøvet larve ind i en rille af den våde agarose formen, således at den ventrale side vender mod den lodrette agarose væg af rillen (figur 3A).
- Placer agarose plade under stereomikroskop så ventriklen vender væk fra kanylen (figur 3A).
- Sænk nålen for at indsætte det ind i hjertet ventrikel. Stik nålen kun 1-2 um i ventriklen pas på ikke at indsætte nålen for dybt (figur 3B og 3C).
- Når nålen er indsat, injicere morpholino opløsningen i ventriklen med 4-6 pulser, der hver leverer 3 nl af løsningen, med venter mellemrum for at tillade rydning af hjertet (figur 3D og 3E).
- Efter injektion, fjernes kanylen (parallelt med planet for indsættelse) og derefter forsigtigt overføre larve med en plastik Pasteur pipette fyldt med E3 medium back i en petriskål indeholdende frisk E3 medium.
- Anbring kanylen i en petriskål indeholdende 1x PBS for at forhindre udtørring af nålen ved overdragelse af injiceret larve.
- Gentag trin 4,1-4,6 hver 12-24 timer for varigheden af eksperimentet. Bemærk: Gentagelse injektionerne sikrer optagelsen og vedligeholdelse af morpholino i cellerne.
5.. Analyser af injektioner (Figur 4)
- Bedøver fiskene i 100 ml akvariet vand med 20 mg / L tricaine indtil de stopper med at svare at røre ved.
- Placer larve sideværts på en flad våd 1,5% (w / v) agarose tallerken dækket med E3 medium.
- Billede larver anvendelse af et stereomikroskop med lysfelt-og fluorescens-billeddannelse. Bemærk: Når larverne er gennemsigtige, bør fluorescein-mærkede morpholino være synlig som fluorescerende grønt i blodkarrene hele dyrets umiddelbart efter injektion. Denne fluorescens vil yderligere dispergere ind i vaskulariserede væv ved15 minutter (figur 4A-4C).
6.. Vurdering af regenerativ Udvækst
- Vurdere optagne billeder ved hjælp Fiji Billede J gratis software (http://fiji.sc/Fiji). For at efterforske regenerering bruge line-opsporing værktøj til at bestemme mængden af regenerativ vækst, som har fundet sted om kontrol og morpholino-indsprøjtning larve.
- For at kalibrere billeder, åbne en af de originale billedfiler i Fiji ved at trække og slippe filen i de vigtigste Fiji vinduet.
- For at indstille skalaen for alle følgende billeder, gå til "Analyze" i hovedmenuen.
- I drop down menu klik på "Set skala".
- I dette vindue tænde "Global" valgmulighed ved at klikke på afkrydsningsfeltet.
- Nu åbne billedet for at måle mængden af regenerativ vækst igen med træk og slip (se trin 6.1).
- Vælg "Freehand valg" værktøjet i baren.
- Omkranser området, der skal måles (Figures 4J-4L).
- Tryk på Ctrl + M. Dette vil åbne en ny "Results" vindue, der viser værdien af den omringede område i firkantede pixels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skarpe, skrå kanyle placeres nemt i hjertets ventrikel zebrafisk larve når nærmede sig dorsalt (figur 3A). Hjertet fortsætter pumpe og blodgennemstrømningen opretholdes på trods af tilstedeværelsen af nålen (figur 3B og 3C). Omhyggelige injektioner ikke forstyrre morfologi ventriklen eller hjerte sammentrækninger (Figur 3D) på trods af injektion af morpholino ind i hjertet (figur 3E).
Inden for få minutter, morpholino-Endo-Porter-opløsning fordeles i hele kroppen via vaskulaturen (figur 4A og 4B). Morpholino fordeles derefter fra vaskulaturen i forskellige væv, såsom finfold og hjerne i mindst 12 timer eller mere, som observeret fra fluorescens (figur 4C).
I denne tilgang, fjerner vi den distale spids af the finfold den distale spids af rygmarven distale trunk muskel, den distale rygstrengen og pigment celler (figur 4D og 4H); som alle er vanskelige at målrette ved direkte injektion på grund af kompakthed (muskel), lille størrelse (rygmarv og notochord) og tynde (finfold), men synes at indarbejde morpholino efter serielle ventrikulære injektioner, som er set af fluorescens inden for disse væv (Figur 4E) i forhold til ikke-injicerede dyr (figur 4F og 4G). Således er denne metode relativt let fremmer levering af morpholino til væv, der er vanskelige for individuelt at målrette og den tillader vurdering af genfunktion i flere væv i regenererende finne på en gang. For at vurdere betydningen af specifikke gener involveret i regenerering, en kirurgisk delvist amputates larve halefinnen (Figur 4H), resecting alle de væv, der er incorp orated morpholino (fig. 4I). Larve finfold regenererer sin struktur inden for et par dage efter amputation (DPA) (figur 4J). Morpholino målretning et gen, der kræves for regenerering (upublicerede data) resulterer i en urolig regenerering respons (Figur 4K) i forhold til ikke-injicerede (figur 4J) og mismatch morpholinogrupper kontrol (figur 4L). Den samlede effekt af disse morpholino eksperimenter på regenerative udvækst kan måles under anvendelse af standard morfometriske værktøjer i offentligt tilgængelige Fiji programmer 12 ved at spore de regenererede væv og sammenligning af de områder (fig. 4J-4L). Således dette gen-targeting metode giver en hurtig og forholdsvis let assay til at teste betydningen af gener i regenereringsprocessen.
5fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Fig. 1. Fremstilling af glas kanylerne til injektion. A) glaskapillarrør inden du trækker (ovenfor) og trak nålen (nedenfor). B) Nål trække apparatet. C) drejebænk for beveling og slibning af glas nål. Nålen er set gennem kikkerten. D) Den drejebænk er en fugtet gummi spinning disk. Nålen er langsomt sænket ned på disken. E) Sharpened nålen skal have en kort facet, der ikke længere (20 mM), end det er bredt (20 um) for at minimere den nødvendige plads til at indsætte hele ende af kanylen ind i larvernes hjertets ventrikel. F) Højere forstørrelse billede, der viser spidsen af nålen. G) Skematisk billede af nålespidsen viser formen af den skrå kant efter slibning.
s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Injektion apparat fig. 2. oprettet. A) Komplet apparatur til injektion af morpholino i zebrafisk larve. B) Stand til at styre placeringen af nålen under injektion. C) Pico pumpe, der regulerer pneumatisk tryk til injektioner. D) Form presse anvendes at skabe agarose mug. E) Agarose skimmel bruges til at stabilisere larve til injektion.
Fig. 3. Injektion af fisk larve. A) placering af nålen i forhold til zebrafisk larve. B) Indsættelse i hjertets ventrikel. C) Fluorescens af morpholino i nålen, men fraværende i ventriklen før injectipå. D) Brightfield billede viser størrelsen forholdet mellem glasset nålen og larvernes ventrikel. E) til injektion af det fluorescerende morpholino i hjertekammer. Skalapanelerne lig 100 um.
Figur 4.. Spredning af morpholinogruppe hele fisk. A) zebrafisk tre dage gamle larver. B) Fluorescens fluorescein-mærkede morpholino hele kroppen vaskulatur (v) 5 min efter ventrikulær injektion. C) Spredning af morpholino hele dyret, inklusive finfold (ff), hjerne (b) ældre larve efter injektioner af morpholino hver 12 timer D) væv i larvernes halefinnen og krop:.. notochord (n), rygmarven (sc), pigment (p), og finfold (ff) E) dispergerede morpholinoflere minutter efter injektion i larvernes trunk væv, herunder finfold. F) Brightfield billede af uinjicerede larve bagagerum og halefinnen. Stiplede linje angiver den potentielle amputation flyet. G) uninjected finne filmede med GFP filter viser autofluorescens i grøn (pilespidser). Dendritiske form af fluorescerende strukturer antyder, at disse er pigment celler. H) Brightfield billedet af et kirurgisk amputeret larvestadium halefinnen gennem rygstrengen, muskler og rygmarven. I) Fluorescerende billede, der viser morpholino udbredelse i de stump væv. Morpholino inkorporering i muskler, rygmarv, notochord og finfold. J) folier caudale finfold strukturer af vildtype larve. Sort linie sporer regenererede væv til kvantificering analyse. K) Morpholino-medieret hæmning af regenerering. Sort linie sporing fremhæver tydeligt den reducerede regenerering respons efter morpholino knockdown. L) folier kaudal finfold af larve injiceret med en fejlparringskontrol morpholino viser en lignende regenerering respons som i ikke-injicerede larve (J). Skalapanelerne lig 100 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intraventrikulær indsprøjtning giver en hurtig og pålidelig vurdering metode til afprøvning af gen funktion på senere stadier af udvikling eller af kroppens homeostase uden at påvirke gen-funktionen under embryogenese. For at sikre succes af denne teknik, skal man være opmærksom på fire kritiske punkter: 1) pinde, 2) udtørring af nålen, 3) at minimere volumen, og 4) minimal eksponering tid i sedation løsning. Nåle, der er for lille, vil tilstoppe hyppigt, idet nåle, der er for store, vil beskadige ventrikel og forårsage overdreven blødning. Mens 20 um anbefales skal nålen aldrig være mere end en femtedel af størrelsen af den ventrikulære kammer. Et andet kritisk punkt er at holde nålen fra udtørring og tilstopning. Den lille størrelse af nålen, og de uundgåelige hyppige pauser til adstadige, overførsel og position larve kan give tid nok til, at morpholino på nålens spids til at tørre ud og blokere nålen. For at forhindredette, kan man fordybe nålen i en petriskål i 1x PBS. En tredje kritiske punkt er at minimere oppustethed i ventriklen ved for høj en lydstyrke. Hvis dosis er begrænset af størrelsen af nålen, derefter øge antallet af injektioner er altid at foretrække at øge volumen: større mængder kan forårsage strækning skade på hjertet. En fjerde kritiske punkt er omfanget af sedation. Den sedation tid er baseret på længden af tid, der kræves til proceduren. Larver kan forblive i sedation løsning og forblive bedøvet i flere minutter, fordi de er temmelig robust og genoplive temmelig nemt. Dog vil bevare fisken for længe i narkose forringe dets nyttiggørelse eller for kort, vil få dem til at genoplive under injektionen. Derfor bør man bedøve kun antallet af larver, som man kan injicere inden for en 4 minutters periode.
En begrænsning ved denne aktuelle fremgangsmåde er, at morpholino ikke genfunktion målrette i et væv-Specifik måde. To forskellige modifikationer kan give vævsspecificitet: Én ændring er at bruge bur morpholinos. Efter aktivering af laserlys fra en konfokal mikroskop, disse morpholinos hæmmer deres gen mål, kan så timed konfokal eksponering giver tidsmæssige og rumlige styring til morfolino aktivitet. Caged morpholinos er blevet anvendt til at målrette gener under den tidlige udvikling efter injektion i en celle foster. Mens levering på encellede fase kan arbejde til at målrette gener under embryogenese, vil koncentrationen af morpholino sandsynligvis være for lav ved senere larvestadier på grund af antallet af successive celledelinger som udviklingen skrider frem til larvestadiet 13. Mængden af morpholino man kan injicere på ene-celle-stadie er også begrænset af toksicitet 13-15. En anden mulig modifikation er direkte at indsprøjte en morpholino i organet eller vævet, der skal undersøges, når størrelse og billeddannelse tillader. Zebrafisk Larven er gennemsigtigt, så visning MOSt indre organer, efter at de har udviklet bør ikke være et problem. Fluorescein-mærket morpholinos arbejder med denne protokol; derfor kan fluorescens bruges til at spore distribution og vævsspecifik lokalisering af morpholino. Indarbejdelsen af fluorescein-mærket morpholino i væv celler kræver tilstedeværelse af Endo-Porter reagens, så en anden ændring ville være at begrænse den rumlige fordeling af Endo-Porter reagens ved at indsprøjte det ved lavere beløb direkte ind i målet væv. Således bør rumlig opløsning være muligt med denne teknik.
Der er transgene overekspression metoder, der giver mulighed for tidsmæssige og rumlige styring af exogent genekspression ved at kombinere vævsspecifikke promotorer med varmechok eller tamoxifen-inducerbare promotorer, der muliggør analyse af genfunktioner på senere stadier af udvikling eller i visse væv ved hjælp af væv specifikke promotorer 16-19. Dette omfatter transgenic ekspression af dominant negative konstruktioner designet til at skabe et produkt, der kan udkonkurrere det endogene gen. Denne knockdown strategi er modtagelige for off-target effekter, når et transgen producerer uforholdsmæssige ekspressionsniveauer af et transgent produkt, der erhverver gain-of-funktion virkninger 20, eller når den integreres i et gen og ødelægger genet endogene funktion 21, 22. Mens morpholinos også kan generere ikke-tilsigtede effekter, kan man lettere styre og begrænse disse virkninger ved hjælp fejlparringskontrol morpholinos med lignende, men lidt ændrede målsekvenser, der ikke binder målet mRNA ved hjælp af flere antisense morpholinos, der er målrettet forskellige sekvenser inden for samme mRNA og ved at teste forskellige morpholino koncentrationer 13-15. Desuden kan morpholinos fremstilles og testes meget hurtigere og billigere end at designe, hæve og teste forskellige dominant negativ transgene linier. Derfor itraventricular injektion af morpholinos giver et nyttigt værktøj til at Knockdown gener ved senere stadier af udvikling, når dominant-negative transgenese er ikke mulig. Når en dominant negativ transgene strategi er mulig, intraventrikulær morpholino injektion er en alternativ tilgang til at bekræfte specificiteten af det overudtrykte dominant-negative transgen.
Det er sandsynligt, at effektive koncentrationer mellem forskellige morpholinos vil variere, som de gør, når du bruger dem til gen knockdown under embryogenese 13, 15. For genet målrettet i dette studie, havde vi ikke observere en effekt på regeneration ved lavere doser end 3,5 mm, og ikke-specifikke virkninger blev ikke observeret i misforhold styrer med denne morpholino koncentration.
Intraventrikulær injektion giver mulighed for fordeling af små molekyler til at vurdere aktivitet og effektivitet i et helt dyr i realtid, når effekten er begrænset af Penetrationere gennem huden eller fordøjelsessystemet eller af mængden af stof til rådighed. Det giver også mulighed målretning af væv, når de ikke kan målrettes ved direkte indsprøjtninger, som det er tilfældet for finfold. Denne metode giver ikke kun et værktøj til at studere gen funktion under fin regenerering ved larvestadier. Da morpholino integreres i larvestadiet finfold omfattende mesenchymal-celler og epidermis, kan det også tilvejebringe en passende teknik til at undersøge, hvilken rolle af gener, der spiller rolle i processen af sårheling eller forekomsten af hudkræft. Injektion af morpholino sammen med Endo-Porter kan også anvendes til at målrette organer eller væv i voksne zebrafisk, som er egnet til operation og gennemskinnelige voksen zebrafisk linjer er tilgængelige. Desuden er denne metode ikke begrænset til zebrafisk; dispersion ved intraventrikulær injektion kan bruges på andre hvirveldyr modeller så godt, især de modeller, der stadig mangler effektive recessivt gen metodersåsom Xenopus, Axolotl og Newt, der er også vigtige modeller til regenerering studier.
Således intraventrikulær injektion i zebrafisk giver evnen til tidsmæssigt at styre genekspression med en relativt hurtig protokol til at målrette multiple væv og alsidigheden af denne metode tillader dets anvendelse med zebrafisk transgene linier samt andre organismer, der mangler funktionelle transgenese eller gen knockout strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), ønsker vi at takke Ayele Tsedeke Taddese for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
