Summary
שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.
Abstract
דג הזברה הוא מודל חשוב להבין את התא וביולוגיה מולקולרית של איבר והתחדשות סרח. עם זאת, אסטרטגיות מולקולריות להעסיק גנטיקה הפוכה עדיין לא פותחו במידה מספקת כדי להעריך את תפקוד גן בהתחדשות או הומאוסטזיס רקמות בשלבי זחל אחרי עובר דג הזברה, וכמה רקמות בתוך זחל דג הזברה הן קשות להתמקד. זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי להציע שיטה חלופית לחוסר היכולת הנוכחית למקד genomically גנים דג הזברה באופן temporally מבוקר בשלבים האלה. שיטה זו מאפשרת לפיזור מלא ושילוב הבא של morpholino לרקמות שונות בגוף, כוללים מבנים שהיו בעבר בלתי אפשריים להגיע כגון אלה בסנפיר הזנב הזחל, מבנה המשמש לעתים קרובות כדי לחקור התחדשות רקמות noninvasively. מספר גנים מופעלים במהלך רגנרציה finfold זחל גם presenלא בהתחדשות רקמות חוליות מבוגרים, ולכן הזחל הוא מודל שימושי כדי להבין התחדשות במבוגרים. שיטת פיזור morpholino זה מאפשרת זיהוי קל ומהיר של גנים הנדרשים להתחדשות של רקמות זחל כמו גם תופעות פיסיולוגיות אחרות המסדירות הומאוסטזיס רקמות אחרי העובר. לכן, שיטת מסירה זו מספקת אסטרטגיה דרושה כעת לשליטה זמנית להערכה של תפקוד גן אחרי העובר.
Introduction
התחדשות של איברים ואיברים חשובה ביסודו להישרדות ולכושר; עם זאת, כמה בעלי חוליות, כולל אדם יש יכולת מוגבלת רגנרטיבית. בעוד כמה מודלים של בעלי החיים קיימים שיש להם יכולת התחדשות נרחבת, להפוך טכניקות גנטיות על מנת להעריך את תפקוד גן באיברים והתחדשות סרח יישאר מוגבל מאוד או לא קיימים. לכן, גישות חדשות נדרשות כדי לנתח את הביולוגיה המולקולרית של התחדשות באורגניזמים המודל הבאים.
דג הזברה היא מודל מבוסס היטב להבנת התא וביולוגיה מולקולרית של איבר ואיבר התחדשות 1, לא רק בגלל היכולת שלו המשמעותית להתחדש איברים מרובים, רקמות ואיברים, אלא גם משום שכמה קווי דגים מהונדסים קיימים כדי לעקוב אחר תאים ו לביטוי יתר גן בונה 2, 3. עם זאת, עיכוב גן בדג זברת זחל מוגבל בעיקר לoverexpression של מבנים דומיננטיים שליליים, שאינם זמינים לכל הגנים של עניין או transgene שהמוצר יכול לרכוש השפעות לזכות-of-פונקציה שאינו משקפות את פעילות אנדוגני של הגן. לפיכך, יש צורך בשיטה חלופית כדי להסיר ביטוי גנים ספציפי בנוקאאוט או מציאה כדי להתגבר על בעיות אלה.
גן ספציפי מיקוד באמצעות TALENS קיים כאמצעי גנטי הפוך למפסיד יוצא, תפקוד גן; עם זאת, אסטרטגית נוקאאוט הזה היא לעתים קרובות מאוד מוגבל להערכות תפקודיות בעובר מוקדם, כי דרישות ראשוניות של הגן למנוע התקדמות נוספת של התפתחות עוברית. לפיכך, חקר תופעות מאוחר יותר כגון התחדשות או הומאוסטזיס איברים לאחר פיתוח באמצעות TALENS מנועה 4, 5. לכן, יש צורך באסטרטגית הסרת גן חלופית, כי מטרות תפקוד גן אחרי התפתחות מוקדמת להעריך את הדרישות של גנים באיברים ומבנים שהוקמו באופן מלא. Morpholino הזרקה הוכח כיעילה במיקוד גנים בכמה איברים בוגרים והמבוגרים התחדשות 6-8 סנפיר, אך שיטות אלו דורשות electroporation ורבים איברים פנימיים קשים electroporate או בשל מיקומם או בשל רגישותם לחשמלית הפרעה. יתר על כן, כמה רקמות בזחל קשות להזריק ישירות, כי הזרקה ישירה עלולה לשבש את השלמות המבנית שלהם או בגלל הגודל שלהם הוא מגבילה. סנפיר הזנב של הזחל הוא מבנה אחד כזה, כי הזרקה ישירה לתוך finfold אינה אפשרית. לפיכך, חלופה לelectroporation והזרקה ישירה הייתה צורך למקד גנים ברקמות שגם הם קטנים מדי כדי להזריק או שלא ניתן electroporated.
על מנת למקד ומעכבים את הפונקציה של גנים ספציפיים במהלך ההתחדשות של סנפיר הזנב הזחל, יש לנו שונה בטכנולוגיות קיימות מאפשר morpholinossessment של תפקוד הגן במהלך רגנרציה של סנפיר הזנב בזחל מבוים המאוחר. שיטה זו מעסיקה משלוח תוך חדרי 9 של morpholinos העמסה-מתויג יחד עם מגיב transfection Endo-פורטר 10. פעם אחת בחדר, את תערובת morpholino-Endo-פורטר מתפשטת במהירות ברחבי הזחל דרך כלי הדם ונכנסה רקמות שהיו בלתי אפשרי בעבר להתמקד. שיטת הזרקה זו עשויה להיות שונה כדי למקד גנים ברקמות ספציפיות וייתכן בהחלט ניתן ליישם במודלים של בעלי חיים אחרים, כי כרגע אין לי שיטות גנטיות הפוכה כדי לעכב את תפקוד גן. לכן, היא מציעה שיטה מהירה וקלה עם הפוטנציאל לשימוש מגוון רחב ללמוד באופן מיידי את תפקוד גן במהלך הומאוסטזיס כללי איבר והתחדשות בשלבי זחל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מחטי הזכוכית (איור 1)
- השתמש בנימי זכוכית בקוטר 0.75 מ"מ להכין מחטי הזרקה (איור 1 א).
- הנח את נימי הזכוכית לתוך חולץ מחט ולמשוך את המחט עם הפרמטר הבא: ערך מחזור חימום: 463; משיכת ערך מחזור: 230; מהירות: 150 אלפיות השניים; זמן: 150 אלפיות שני (איור 1).
- לשבור את זכוכית משך נימים עם פינצטה שען כדי לייצר מחט בקוטר 20 מיקרומטר תחת stereoscope עם עינית מיקרומטר.
- השתמש מחרטה עם גלגל מסתובב גומי רטוב כדי לחדד את המחט ולייצר 20 מיקרומטר הטיה (1C דמויות ו1D). הערה: שארפ, מחטים משופעות לשפר את הקלות של כניסה לתוך החדר ובכך למזער את הנזק לרקמות ולאפשר לשרירים המחוררים כדי לחתום מחדש לאחר הסרת המחט (איורים 1E-G).
2. Preparע פתרון morpholino
- הכן את מניית morpholino ידי המסת morpholino lyophilized ב1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) לריכוז סופי של 7.5 מ"מ. [ראה את הוראות יצרן לפרטים (טבלת חומרים)].
- הכן את פתרון הזרקת morpholino על ידי ערבוב של פתרון מניות morpholino 2.5 μl (7.5 מ"מ) עם פתרון 2.8 μl Endo-פורטר המניה (1 מ"מ) (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 3.5 morpholino מ"מ ו0.5 מ"מ Endo-פורטר.
3. הכנת הזרקת morpholino (איור 2)
- טען את מחט זכוכית המשופעת עם 5 μl של פתרון זה באמצעות micropipette עם קצה פיפטה microloader 10 μl.
- הכנס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק המחט של micromanipulator מחובר למשאבת פיק פנאומטי (איורים 2A-C).
- הנח את בעל המחט ליד מיקרוסקופ כך מחט הצרכים רקכדי להתרגש בכיוון מישוריים אחד להכניס אותו לתוך חדר הלב של הזחל (איור 2 א).
- כוון את הזווית לזריקות ב-45 °.
- הגדר את ערכי microinjector כדלקמן: לחץ אחיזה: 20 פאונד לאינץ' המרובע (psi); לחץ פליטה: 15 psi; 100 מגוון אלפיות של gating, ערך תקופה של 1.9 (מתאים ל10.9 אלפית שני).
- להמס agarose ב 1x PBS באמצעות מיקרוגל סטנדרטי לייצר 20 מיליליטר של 1.5% (w / v) ג'ל. יוצקים ג'ל נמס לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר. הנח צורת הזרקת מחורץ לagarose החם, כך שפעם אחת קשוח, agarose יהיה תלמים שבזחל המסוממים יוצב 11 (2D דמויות ו2E).
4. זריקות (איור 3)
- הרדימי זחל במי אקווריום 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ"ג / ליטר (sulfonate L-אתיל-M-אמינו-נזואט מתאן), עד שהם יפסיקו להגיב למגע.
- השתמש pipett פסטר מפלסטיקדואר להעביר בזהירות את הזחל מסומם לתוך חריץ של עובש agarose הרטוב, כך שהצד הגחוני פונה אל קיר agarose האנכי של הגרוב (איור 3 א).
- מניחים את צלחת agarose תחת סטראו כך שהחדר הוא מול מן מחט הזריקה (איור 3 א).
- מנמיכים את המחט להכניס אותו לתוך חדר הלב. הכנס את המחט רק 1-2 מיקרומטר לתוך החדר נזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי (3B דמויות ו3 ג).
- ברגע שהמחט מוחדרת, להזריק את פתרון morpholino לתוך החדר עם 4-6 קטניות, כל 3 NL אספקת של הפתרון, עם מחכה מרווחים כדי לאפשר סליקה של הלב (3D דמויות ו3E).
- לאחר הזרקה, להוציא את המחט (במקביל למישור של הכנסה) ולאחר מכן להעביר בזהירות את הזחל בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק מלא בbac הבינוני E3k לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני E3 טרי.
- מניחים את המחט לתוך צלחת פטרי המכילה 1x PBS כדי למנוע הייבוש של המחט בעת העברת הזחל המוזרק.
- חזור על שלבים 4.1-4.6 כל שעה 12-24 לתקופת הניסוי. הערה: חזרה על הזריקות מבטיחה הספיגה ותחזוקה של morpholino בתאים.
5. ניתוח של זריקות (איור 4)
- להרדים את הדגים באקווריום של מים 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ"ג / ליטר עד שהם יפסיקו להגיב למגע.
- מניחים את הזחל רוחבי על 1.5% רטובים שטוחים (w / v) agarose צלחת מכוסה במדיום E3.
- זחלי תמונה באמצעות סטראו עם brightfield ודימות פלואורסצנטי. הערה: כפי שהזחלים הם שקופים, morpholino מתויג והעמסת צריך להיות גלוי כמו ירוק ניאון בכלי דם בכל בעלי החיים באופן ישיר לאחר הזרקה. הקרינה זו תתפזר יותר לתוך רקמות vascularized ידי15 דקות (איורים 4 א-4C).
6. הערכת הרגנרציה תולדה
- להעריך תמונות שנתפסו באמצעות תוכנת פיג'י תמונת J בחינם (http://fiji.sc/Fiji). לחקירת התחדשות, השתמש בכלי מעקב אונליין כדי לקבוע את הכמות של צמיחת התחדשות שחלה על שליטה וזחל הזריק morpholino.
- לכייל תמונות, פתח את אחד קבצי תמונה המקוריים בפיג'י על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון פיג'י הראשי.
- כדי להגדיר את קנה המידה לכל התמונות הבאות, ללכת על "נתח" בתפריט הראשי.
- בנפתח לחץ על תפריט "סולם הגדר".
- בחלון זה, להפעיל את האפשרות "הגלובלית" על ידי לחיצה על תיבת הסימון.
- עכשיו לפתוח את התמונה כדי למדוד את הכמות של צמיחת משובי שוב על ידי גרירה ושחרור (ראה שלב 6.1).
- בחר באפשרות "בחירות חופשי" בסרגל הכלים.
- מקיף את האזור כדי להימדד (Figures 4J-4L).
- לחץ על Ctrl + M. הפעולה זו תפתח חלון חדש "תוצאות" המציג את ערכו של השטח מוקף בפיקסלים מרובעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המחט החדה, משופעת ההזרקה ממוקמת בקלות בחדר הלב של זחל דג הזברה כאשר ניגש dorsally (איור 3 א). הלב ממשיך לשאוב ונשמרת זרימת דם למרות נוכחותם של המחט (3B דמויות ו3 ג). זריקות להיזהר לא לשבש את המורפולוגיה של החדר או התכווצויות לב (איור 3D) למרות הזרקה של morpholino ללב (איור 3E).
בתוך דקות, פתרון morpholino-Endo-פורטר מפיץ בכל הגוף באמצעות כלי הדם (איורים 4 א ו -4 ב). Morpholino מכן יחולק מכלי הדם לרקמות שונות כגון finfold והמוח לפחות 12 שעה או יותר כפי שנצפה מהקרינה (איור 4C).
בגישה זו, אנו מסירים את הקצה הדיסטלי של הfinfold דואר, הקצה הדיסטלי של חוט השדרה, שרירים תא מטען דיסטלי, notochord דיסטלי ותאי פיגמנט (4D דמויות ו4H); כל אלה הם קשים במיוחד למטרה על ידי הזרקה ישירה בשל קומפקטיות (שריר), גודל קטן (חוט השדרה וnotochord) ורזון (finfold), אבל מופיע לשלב morpholino לאחר זריקות חדרית סדרתי, אשר נתפסו על ידי הקרינה בתוך אלה רקמות (איור 4E) בהשוואה לבעלי החיים uninjected (4F דמויות ו4G). לכן, שיטה זו בקלות יחסית מקדמת מסירה של morpholino לרקמות שקשה למקד בנפרד, והוא מאפשר הערכה של תפקוד גן בכמה רקמות בסנפיר ההתחדשות בבת אחת. כדי להעריך את חשיבותם של גנים ספציפיים המעורבים בהתחדשות, אחד בניתוח חלקי קוטם סנפיר זחל הזנב (איור 4H), resecting כל הרקמות שיש לי Incorp נאם morpholino (איור 4I). Finfold הזחל מחדש את המבנה שלה בתוך כמה ימים לאחר קטיעה (DPA) (איור 4J). מיקוד morpholino גן דרושים לרגנרציה (נתונים שלא פורסמו) תוצאות בתגובת התחדשות מוטרדת (איור 4K) בהשוואה לuninjected (איור 4J) ופקדי morpholino חוסר התאמה (איור 4L). ההשפעה הכוללת של ניסויי morpholino אלה בתולדת משובי ניתן למדוד באמצעות כלים morphometric סטנדרטיים בתוכניות פיג'י הזמינות בפומבי 12 על ידי התחקות הרקמות מחדש והשוואת האזורים (איורים 4J-4L). לפיכך, שיטת מיקוד הגן הזה מספק assay מהיר וקל יחסית כדי לבדוק את החשיבות של גנים בתהליך ההתחדשות.
"Width =" 5fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1. הכנת מחטי זכוכית נימים להזרקה. א) צינור נימי זכוכית לפני משיכת (לעיל) ומשך את המחט (בהמשך). ב ') מכשירי משיכת מחט. C) מחרטה לbeveling וחידוד מחט הזכוכית. מוצגת המחט דרך המשקפת. ד) המחרטה היא דיסק מסתובב גומי רטוב. המחט היא הורידה באיטיות על גבי התקליטור. מחט E) חדדה חייבת להיות פוע קצר כי הוא כבר לא (20 מיקרומטר) מרוחבו (20 מיקרומטר) כדי לצמצם את המרחב הדרוש כדי להכניס את כל סוף את המחט לתוך לב הזחל חדר. F) תמונה בהגדלה גבוהה מראה את קצה המחט. בתצוגה סכמטית של קצה המחט המראה את הצורה של פוע לאחר חידוד G).
"Width =" s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2. מנגנון הזרקה להגדיר.) מנגנון שלם להזרקה של morpholino לזחל דג הזברה. ב ') יעמוד ללשלוט במיקום של המחט במהלך זריקות. C) משאבת פיקו שמווסת את הלחץ פנאומטי לזריקות עיתונות טופס. ד') בשימוש עובש Agarose ליצור עובש agarose. E) המשמש לייצוב זחל להזרקה.
איור 3. הזרקה של זחל דגים. הקרינה קלטי) מיקום המחט ביחס לזחל דג הזברה. ב ') לחדר לב. C) של morpholino במחט אבל נעדר בחדר לפני injectiב. ד ') תמונת Brightfield מציגה את יחסי הגודל בין מחט הזכוכית וחדר הזחל) הזרקה. ה' לmorpholino הניאון לתוך חדר הלב. סולם ברים שווים 100 מיקרומטר.
איור 4. פיזור של morpholino ברחבי דגים. א) הקרינה זחל ישן 3 יום דג הזברה. ב) morpholino לאורך כל כלי הדם בגוף נפיצה (v) ההודעה חדרית 5 דקות הזרקה. C) של morpholino לאורך כל בעלי החיים כוללים finfold (ואילך), מתויגת והעמסת, מוח (ב) במבוגרים זחל לאחר זריקות של morpholino כל 12 שעה D רקמות) בסנפיר הזנב הזחל ותא מטען:.. notochord (n), חוט השדרה (sc), פיגמנט (עמ '), וfinfold (ואילך) E) מפוזר morpholinoכמה דקות לאחר הזרקה לרקמות תא מטען זחל כוללים finfold. תמונת Brightfield של תא מטען זחל uninjected וסנפיר הזנב F). קו מקווקו מציין את סנפיר מטוס קטיעה הפוטנציאלי. G) uninjected צילם עם מסנן ה-GFP מראה autofluorescence בירוק (ראשי חץ). צורת הדנדריטים של מבני fluorescing עולה כי אלה הם תאי פיגמנט. H) תמונת Brightfield של סנפיר הזנב זחל נקטע בניתוח דרך notochord, השרירים ועמוד השדרה. אני) תמונת פלורסנט מראה הפצת morpholino ברקמות הגדם. התאגדות morpholino לתוך שרירים, חוט השדרה, notochord וfinfold. J) מחדש מבני finfold הזנב של זחל wild-type. קו שחור משרטט את הרקמות מחדש לניתוח כימות העיכוב. K) בתיווך morpholino של התחדשות. מעקב קו שחור מדגיש בבירור מופחתת ההתחדשות מחדשsponse לאחר מציאה morpholino. L) מחדש finfold הזנב של זחל הוזרק morpholino שליטת חוסר התאמה מראה תגובת התחדשות דומה כמו בזחל uninjected (J). סולם ברים שווים 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההזרקה תוך חדרי מספקת שיטת הערכה מהירה ואמינה לבדיקת תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או של הומאוסטזיס גוף מבלי להשפיע על תפקוד הגן בעובר. כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, אחד צריכה להיות מודע לארבע נקודות קריטיות: 1) גודל מחט,) ייבוש 2 מ המחט, 3) צמצום נפח, ו4) זמן חשיפה מינימאלית בפתרון הרגעה. מחטים כי הם קטנים מדי תסתומנה לעתים קרובות, בעוד מחטים כי הם גדולים מדי יפגעו בחדר ולגרום לדימום יתר. בעוד 20 מיקרומטר מומלץ, המחט אף פעם לא צריכה להיות יותר מחמישית בגודל של החדר של החדר. נקודה קריטית שנייה היא לשמור את המחט מהתייבשות וסתימה. גדליו הקטנים של המחט וההפסקות התכופות בלתי נמנעות לשקטה ורגועה, והעברת עמדת הזחל יכולים לספק מספיק זמן כדי לאפשר morpholino בקצה המחט להתייבש ולסתום את המחט. כדי למנועזה, אפשר לטבול את המחט בצלחת פטרי של 1x PBS. נקודה קריטית שלישית היא למזער נפיחות של החדר על ידי גבוה מדי של עוצמת קול. אם המינון הוא מוגבל על ידי הגודל של המחט, ולאחר מכן להגדיל את מספר הזריקות הוא תמיד עדיף על הגדלת הנפח: נפחים גדולים יותר יכולים לגרום לפציעת מתיחה ללב. נקודה קריטית רביעית היא המידה של הרגעה. זמן הרגעה מבוסס על משך הזמן הדרוש להליך. זחלים יכולים להישאר בפתרון הרגעה ולהישאר מסומם במשך כמה דקות, בגלל שהם לא חזקים ולהחיות די בקלות. עם זאת, שמירה על הדגים יותר מדי זמן בהרדמה תפגע בהתאוששות שלה או קצר מדי יגרום להם להחיות במהלך ההזרקה. לכן, יש להרדים רק את המספר של זחל שאפשר להזריק תוך פרק 4 דקות.
מגבלה אחת של השיטה הנוכחית היא שmorpholino אינו מכוון את תפקוד גן ברקמותספציפי לאופן. שני שינויים שונים יכולים לספק סגוליות רקמה: שינוי אחד הוא להשתמש morpholinos בכלוב. לאחר הפעלה על ידי אור הלייזר ממיקרוסקופ confocal, morpholinos אלה מעכב את יעד הגן שלהם, חשיפת confocal כך מתוזמן יכולה לספק שליטה של זמן ומרחב לפעילות morpholino. morpholinos בכלוב היה בשימוש למקד גנים במהלך ההתפתחות מוקדמת לאחר ההזרקה לתוך העובר אחד התאים. בעוד מסירה בשלב תא בודד יכולה לעבוד למקד גנים בעובר, הריכוז של morpholino צפוי להיות נמוך מדי בשלבי זחל מאוחר יותר בשל מספר חלוקות תא רצופים כפיתוח מתקדם לשלב זחל 13. כמות morpholino אחד יכול להזריק באחד התאים בשלב מוגבל גם על ידי רעילות 13-15. שינוי אפשרי שני הוא להזריק ישירות morpholino לתוך האיבר או הרקמה להיחקר כאשר גודל והדמיה מאפשרים. זחל דג הזברה הוא שקוף, כך שחודש צפייהt איברים פנימיים אחרי שהם פיתחו לא צריך להיות בעיה. Morpholinos מתויג והעמסת לעבוד עם פרוטוקול זה; לכן, הקרינה יכולה לשמש כדי לעקוב אחר ההפצה ולוקליזציה רקמות הספציפיות של morpholino. השילוב של morpholino מתויג והעמסת לתאי רקמה דורש הנוכחות של מגיב Endo-פורטר, ולכן שינוי נוסף יהיה להגביל את הפריסה המרחבית של מגיב Endo-פורטר על ידי הזרקתו בכמויות נמוכות ישירות לתוך רקמת המטרה. לפיכך, ברזולוציה מרחבית צריכה להיות אפשרית עם טכניקה זו.
ישנן שיטות ביטוי יתר מהונדסים המספקות לבקרת זמן ומרחב של ביטוי גנים אקסוגניים על ידי שילוב של יזמים רקמות ספציפיות עם חום הלם או מקדמי טמוקסיפן מושרה המאפשר הניתוח של תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או ברקמות מסוימות באמצעות רקמה יזמים ספציפיים 16-19. זה כולל את transgeביטוי NIC של מבנים דומיננטיים שליליים שנועדו ליצור מוצר שיכול לגבור על גן אנדוגני. אסטרטגית מציאה זו היא רגישה להשפעות מחוץ היעד כאשר transgene מייצר רמות ביטוי לא פרופורציונליות של מוצר מהונדס שרוכש השפעות 20 לזכות-of-פונקציה, או כשהוא משתלב בגן ומשבש את תפקודו של הגן אנדוגני 21, 22. בעוד morpholinos גם יכול ליצור השפעות מחוץ היעד, אפשר בקלות רבה יותר לשלוט ולהגביל את ההשפעות אלה על ידי שימוש בmorpholinos שליטת חוסר התאמה עם רצפי היעד דומים אך שונים מעט, שאינו מחייבים את ה-mRNA היעד, באמצעות morpholinos antisense מרובה כי יעד רצפים שונים בתוך אותו mRNA ועל ידי בדיקת ריכוזי morpholino שונים 13-15. יתר על כן, ניתן לייצר morpholinos ונבדק מהר יותר והרבה יותר זול מאשר בעיצוב, העלאה ובדיקת קווים מהונדסים דומיננטיים שליליים שונים. לכן, בהזרקת traventricular של morpholinos מספקת כלי שימושי למציאת גנים בשלבים מאוחר יותר של התפתחות, כאשר transgenesis הדומיננטית שלילית אינה אפשרית. כאשר אסטרטגיה מהונדס דומיננטית שלילית אפשרית, הזרקת morpholino תוך חדרי היא גישה חלופית כדי לאשר את הספציפיות של transgene הדומיננטי שלילי ביטוי היתר.
סביר להניח כי ריכוזים יעילים בין morpholinos שונה ישתנו, כפי שהם עושים כאשר משתמשים בהם למציאת גן בעובר 13, 15. לגן הממוקד במחקר זה, אנו לא צופים השפעה על התחדשות במינונים נמוכים יותר מאשר 3.5 מ"מ, ותופעות בלתי ספציפיות לא נצפו בחוסר התאמה שולט עם ריכוז morpholino זה.
הזרקה תוך חדרי מאפשרת ההפצה של מולקולות קטנות כדי להעריך את הפעילות ויעילות במערכת חיה כולה בזמן אמת, כאשר יעילות מוגבלת על ידי penetלקצוב דרך מערכת עיכול העור או או על ידי הכמויות של מתחם הזמינות. זה גם מאפשר מיקוד של רקמות כשהם לא יכולים להיות ממוקדים על ידי הזרקות ישירות, כמו במקרה של לfinfold. שיטה זו אינה רק לספק כלי ללמוד תפקוד גן במהלך רגנרציה של סנפיר בשלבי זחל. מאז morpholino משתלב finfold הזחל הכולל תאי mesenchymal והאפידרמיס, זה יכול גם לספק טכניקה מתאימה כדי לחקור את תפקידם של גנים שמשחקים תפקיד בתהליך של ריפוי פצע או ההתרחשות של סרטן העור. ההזרקה של morpholino יחד עם Endo-פורטר יכולה להיות מיושמת גם כדי למקד את האיברים או רקמות בדג זברה מבוגר, שהן ניתנות לניתוח וקווי דג הזברה המבוגר שקופים זמינים. יתר על כן, שיטה זו אינה מוגבלת לדג זברה; פיזור על ידי הזרקה תוך חדרי ניתן להשתמש במודלים של בעלי חוליות אחרים, כמו גם, במיוחד בדגמים אלה שעדיין חסרי שיטות גן רצסיבי יעילותכגון Xenopus, האמביסטומה וסלמנדרה, שהם גם דגמים חשובים למחקרי התחדשות.
כך, הזרקה תוך חדרי בדג הזברה מציעה את היכולת לשלוט temporally ביטוי גנים בפרוטוקול מהיר יחסית למקד רקמות רבות, ואת הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת את השימוש בו עם קווים מהונדסים דג הזברה, כמו גם לאורגניזמים אחרים שחסרים transgenesis או תפקודיות אסטרטגיות נוקאאוט הגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי (DFG), ברצוננו להודות Ayele Tsedeke Taddese לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
