Summary
Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.
Abstract
Lo zebrafish è un modello importante per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice. Tuttavia, le strategie molecolari di impiegare genetica inversa non sono ancora stati adeguatamente sviluppati per valutare la funzione del gene nella rigenerazione o omeostasi dei tessuti durante le fasi larvali dopo embriogenesi zebrafish, e diversi tessuti all'interno della larva zebrafish sono difficili da colpire. Iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici offrono un metodo alternativo per l'attuale incapacità di indirizzare genomically geni di zebrafish in modo controllato temporalmente in queste fasi. Questo metodo consente la completa dispersione e successiva incorporazione del morfolino in vari tessuti dell'organismo, comprese le strutture che prima erano impossibili da raggiungere come quelli nella pinna caudale larvale, una struttura spesso usato per ricercare in modo non invasivo rigenerazione tissutale. Diversi geni attivati durante la rigenerazione finfold larvale sono anche Present nella rigenerazione dei tessuti vertebrati adulti, in modo che la larva è un modello utile per capire la rigenerazione negli adulti. Questo metodo dispersione morfolino consente l'identificazione rapida e facile di geni necessari per la rigenerazione di tessuti larvali nonché altri fenomeni fisiologici che regolano l'omeostasi del tessuto dopo l'embriogenesi. Pertanto, questo metodo di consegna fornisce una strategia attualmente necessari per il controllo temporale per la valutazione della funzione genica dopo embriogenesi.
Introduction
Rigenerazione di organi e appendici è di fondamentale importanza per la sopravvivenza e fitness; Tuttavia, alcuni vertebrati compreso l'uomo hanno limitato la capacità rigenerative. Mentre diversi modelli animali esistere che hanno ampia capacità rigenerativa, invertire tecniche genetiche per valutare la funzione del gene durante organo e la rigenerazione appendice rimangono molto limitato o inesistente. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per sezionare la biologia molecolare di rigenerazione in questi organismi modello.
Il zebrafish è un modello ben consolidato per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice 1, non solo per la sua notevole capacità di rigenerare più organi, tessuti e appendici, ma anche perché diverse linee transgeniche di pesce esistono per monitorare le cellule e di iperespressione del gene costruisce 2, 3. Tuttavia, l'inibizione del gene in zebrafish larvale è limitata principalmente al overexpreSsion di costrutti dominanti negativi, che non sono a disposizione di tutti i geni di interesse o il cui prodotto del transgene in grado di acquisire il guadagno-di-funzione degli effetti che non riflettono l'attività endogena del gene. Pertanto, è necessario un metodo alternativo per rimuovere specificamente espressione genica per KO o smontabile per superare questi problemi.
Gene-specifica il targeting utilizzando TALENS esiste come un mezzo genetica inversa per knockout funzione del gene; Tuttavia, questa strategia knockout è molto spesso limitata a valutazioni funzionali durante embriogenesi precoce, perché i requisiti iniziali del gene impedire ulteriore progressione dello sviluppo embrionale. Così, studiando i fenomeni successivi come la rigenerazione o organo omeostasi dopo di sviluppo utilizzando TALENS è preclusa 4, 5. Pertanto, è necessaria una strategia di rimozione gene supplente che gli obiettivi di funzione del gene dopo lo sviluppo presto per valutare i requisiti del gene in organi e strutture completamente formate. Morfolino iniezione ha dimostrato di essere efficace nel rivolti geni in alcuni organi adulti e l'adulto rigenerante pinna 6-8, ma questi metodi richiedono elettroporazione e molti organi interni sono difficili da elettroporazione sia a causa della loro posizione o per la loro sensibilità elettrica interruzioni. Inoltre, alcuni tessuti del larva sono difficili da iniettare direttamente, perché l'iniezione diretta può compromettere la loro integrità strutturale o perché la loro dimensione è limitante. La pinna caudale della larva è una tale struttura, in quanto l'iniezione diretta nel finfold non è possibile. Così, alternativa alla elettroporazione e iniezione diretta era necessaria per indirizzare geni nei tessuti che sono o troppo piccolo per iniettare o non possono essere elettroporate.
Al fine di indirizzare e inibire la funzione dei geni specifici durante la rigenerazione della pinna caudale larvale, abbiamo modificato morpholino tecnologie esistenti consentendo unVALUTAZIONE della funzione del gene durante la rigenerazione pinna caudale in larva tardo-messa in scena. Questo metodo impiega consegna intraventricolare 9 del Morpholinos fluoresceina-tagged con Endo-Porter trasfezione reagente 10. Una volta nel ventricolo, la miscela morfolino-Endo-Porter diffonde rapidamente in tutto il larva attraverso il sistema vascolare ed entra tessuti che sono stati precedentemente impossibile bersaglio. Questo metodo di iniezione può essere modificato per geni bersaglio in tessuti specifici e molto probabilmente può essere applicato in altri modelli animali che attualmente mancano metodi genetici inverso per inibire la funzione del gene. Così, offre un metodo rapido e facile con la possibilità di ampio utilizzo gamma di studiare immediatamente la funzione del gene durante l'omeostasi organo generale e rigenerazione nelle fasi larvali.
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Protocol
1. Preparazione degli aghi di vetro (Figura 1)
- Utilizzare capillari di vetro con diametro 0,75 millimetri per preparare aghi per iniezione (Figura 1A).
- Posizionare il capillare di vetro in un estrattore ago e tirare l'ago con il seguente parametro: valore del ciclo di riscaldamento: 463; tirando valore del ciclo: 230; Velocità: 150 msec; Tempo: 150 msec (Figura 1B).
- Rompere il capillare di vetro tirato con le pinzette da orologiaio per produrre un diametro ago 20 micron sotto uno stereoscopio con un micrometro.
- Utilizzare un tornio con una ruota che gira gomma bagnata per affinare l'ago e produrre un 20 micron smusso (figure 1C e 1D). Nota: Sharp, aghi smussati migliorare la facilità di inserimento nel ventricolo e quindi ridurre al minimo il danno al tessuto e consentono il muscolo forata per richiudere dopo la rimozione dell'ago (Figure 1E-G).
2. Preparzione della soluzione Morpholino
- Preparare il morpholino magazzino sciogliendo la morpholino liofilizzato in 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) ad una concentrazione finale di 7,5 mm. [Riferimento alle istruzioni del produttore per i dettagli (tabella materiali)].
- Preparare la soluzione iniettabile morfolino mescolando soluzione 2,5 microlitri morfolino magazzino (7,5 mm) con 2,8 ml soluzione Endo-Porter magazzino (1 mm) (vedere la tabella dei materiali) per una concentrazione finale di morfolino 3,5 mm e 0,5 mM Endo-Porter.
3. Preparazione dell'iniezione Morpholino (Figura 2)
- Caricare l'ago di vetro smussato con 5 ml di questa soluzione utilizzando una micropipetta con 10 microlitri punta microloader pipetta.
- Inserire l'ago di vetro nel supporto dell'ago del micromanipolatore collegato alla pompa pico pneumatico (figure 2A-C).
- Posizionare il supporto dell'ago accanto al microscopio in modo che solo le esigenze agodi essere spostati in una direzione planare per inserirla nel ventricolo cardiaco della larva (Figura 2A).
- Regolare l'angolo per le iniezioni a circa 45 °.
- Impostare i valori microinjector come segue: pressione di mantenimento: 20 libbre per pollice quadrato (psi); Pressione di espulsione: 15 psi; 100 msec gamma di gating, valore di periodo di 1,9 (corrisponde a 10,9 msec).
- Sciogliere agarosio in 1x PBS utilizzando un forno standard per produrre 20 ml di 1,5% (w / v) di gel. Versare gel fuso in una capsula Petri 10 centimetri. Posizionare una forma di iniezione scanalato in agarosio caldo in modo che, una volta indurito, il agarosio avrà solchi in cui la larva sedato sarà posto 11 (figure 2D e 2E).
4. Iniezioni (Figura 3)
- Anestetizzare larva in 100 ml di acqua dell'acquario con 20 mg / L tricaine (L-etil-m-amino-benzoato-metano solfonato) finché smettono di rispondere al tatto.
- Utilizzare un Pasteur pipett plasticae di trasferire accuratamente la larva sedato in una scanalatura dello stampo agarosio bagnato in modo che il lato ventrale è rivolto contro la parete agarosio verticale della scanalatura (Figura 3A).
- Posizionare la piastra di agarosio allo stereomicroscopio in modo che il ventricolo è rivolto verso l'ago di iniezione (figura 3A).
- Abbassare l'ago per inserirlo nel ventricolo del cuore. Inserire l'ago solo 1-2 micron nel ventricolo avendo cura di non inserire l'ago troppo in profondità (Figure 3B e 3C).
- Una volta inserito l'ago, iniettare la soluzione morfolino nel ventricolo con 4-6 impulsi, ciascuno consegna 3 nl della soluzione, con intervalli di attesa per consentire compensazione del cuore (figure 3D e 3E).
- Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago (parallelo al piano di inserimento) e poi trasferire accuratamente la larva con una pipetta Pasteur plastica riempito di E3 medio BACk in una capsula di Petri contenente mezzo E3 fresco.
- Posizionare l'ago in una capsula di Petri contenente PBS 1x per impedire l'essiccamento dell'ago quando si trasferisce la larva iniettata.
- Ripetere i passaggi 4,1-4,6 ogni 12-24 ore per la durata dell'esperimento. Nota: Ripetendo le iniezioni assicura l'assorbimento e la manutenzione del morfolino nelle cellule.
5. Analisi di iniezioni (figura 4)
- Anestetizzare il pesce in 100 ml di acqua dell'acquario con 20 mg / L tricaine fino a che non smettono di rispondere al tatto.
- Posizionare la larva lateralmente su un piatto bagnato 1,5% (w / v) piastra di agarosio coperto con E3 medie.
- Larve di immagine utilizzando uno stereomicroscopio con campo chiaro e imaging di fluorescenza. Nota: Poiché le larve sono trasparenti, il morfolino fluoresceina-tag dovrebbe essere visibile come verde fluorescente nei vasi sanguigni in tutto l'animale immediatamente dopo l'iniezione. Questa fluorescenza ulteriormente disperdere nei tessuti vascolarizzati da15 min (Figure 4A-4C).
6. Valutazione della Regenerative escrescenza
- Valutare le immagini catturate utilizzando Fiji Immagine software libero J (http://fiji.sc/Fiji). Per indagare la rigenerazione, utilizzare lo strumento di line-analisi per determinare la quantità di crescita rigenerativa che si è verificato sul controllo e la larva morfolino-iniettato.
- Per calibrare le immagini, aprire uno dei file di immagine originali in Fiji trascinando e rilasciando il file nella finestra principale di Fiji.
- Per impostare la scala per tutte le immagini che seguono, andare su "Analizza" nel menu principale.
- Nel menu a discesa fare clic su "Imposta scala".
- In questa finestra, attivare l'opzione "Global" facendo clic sulla casella di controllo.
- Ora aprite l'immagine per misurare la quantità di crescita rigenerativa di nuovo con il drag and drop (vedi punto 6.1).
- Scegliere lo strumento "selezione a mano libera" nella barra degli strumenti.
- Circondare la zona da misurare (Figure 4J-4L).
- Premere Ctrl + M. Si aprirà una nuova finestra "Risultati" che mostra il valore dell'area circondata in pixel quadrati.
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Representative Results
Il forte, smussato ago per l'iniezione è facilmente inserito nel ventricolo cardiaco della larva zebrafish quando si avvicinò dorsale (Figura 3A). Il cuore continua a pompare e il flusso di sangue viene mantenuta nonostante la presenza dell'ago (Figure 3B e 3C). Iniezioni attente non perturbare la morfologia del ventricolo o contrazioni cardiache (Figura 3D) nonostante iniezione del morfolino nel cuore (Figura 3E).
In pochi minuti, la soluzione morfolino-Endo-Porter distribuisce in tutto il corpo attraverso il sistema vascolare (Figure 4A e 4B). Il morfolino viene quindi distribuito dal sistema vascolare nei tessuti diversi come il finfold e cervello per almeno 12 ore o più, come osservato dalla fluorescenza (Figura 4C).
In questo approccio, togliamo la punta distale del secoloe finfold, la punta distale del midollo spinale, distale muscolare tronco, la notocorda distale e cellule pigmentate (Figure 4D e 4H); che sono tutti difficili da indirizzare specificamente per iniezione diretta a causa di compattezza (muscolo), di piccola dimensione (midollo spinale e notocorda) e magrezza (finfold), ma sembrano incorporare il morpholino dopo le iniezioni ventricolari seriali, che è visto da fluorescenza all'interno di questi tessuti (Figura 4E) rispetto agli animali uninjected (figure 4F e 4G). Così, questo metodo promuove relativamente facile la consegna di morfolino ai tessuti che sono difficili da indirizzare individualmente, e permette la valutazione della funzione genica in diversi tessuti nella pinna rigenerante in una volta. Per valutare l'importanza di specifici geni coinvolti nella rigenerazione, una amputa chirurgicamente parzialmente la pinna caudale larvale (Figura 4H), resezione tutti i tessuti che hanno incorp orated il morfolino (Figura 4I). Il finfold larvale rigenera la struttura entro pochi giorni dopo l'amputazione (dpa) (Figura 4J). Morpholino il targeting un gene necessario per la rigenerazione (dati non pubblicati) si traduce in una risposta rigenerazione perturbato (Figura 4K) rispetto al non iniettato (figura 4J) ei controlli morpholino di mismatch (Figura 4L). L'effetto complessivo di questi esperimenti morpholino su escrescenza rigenerativa può essere misurato utilizzando strumenti standard di morfometriche nei programmi Figi pubblicamente disponibili 12 tracciando i tessuti rigenerati e confrontando i settori (figure 4J-4L). Così, questo metodo gene-targeting fornisce un saggio rapido e relativamente facile testare l'importanza dei geni nel processo di rigenerazione.
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Figura 1. Preparazione di aghi capillari di vetro per l'iniezione. A) Vetro capillare prima di tirare (sopra) e ha tirato ago (sotto). B) Ago apparato di trazione. C) Tornio per smussare e affilare l'ago di vetro. L'ago viene visto attraverso il binocolo. D) Il tornio è un disco rotante in gomma bagnata. L'ago viene lentamente abbassato sul disco. E) ad ago deve avere un breve smussatura che non è più (20 micron) rispetto alla larghezza (20 micron) per ridurre al minimo lo spazio necessario per inserire l'intera estremità dell'ago nella cardiaca larvale ventricolo. F) immagine Maggiore ingrandimento che mostra la punta dell'ago. G) Rappresentazione schematica della punta dell'ago che mostra la forma dello smusso dopo l'affilatura.
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Apparato iniezione Figura 2. Impostato. A) Attrezzatura completa per iniezione di morfolino in larva zebrafish. B) del basamento per controllare il posizionamento dell'ago durante le iniezioni. C) La pompa pico che regola la pressione pneumatica per iniezioni. D) Forma stampa usata per creare stampo agarosio. E) stampo agarosio per stabilizzare larva iniettabile.
Figura 3. Iniezione della larva pesce. A) Posizionamento dell'ago rispetto alla larva zebrafish. B) Inserimento nel ventricolo cardiaco. C) fluorescenza del morfolino nell'ago ma assente nel ventricolo prima injection. D) immagine Brightfield mostra la relazione tra la dimensione ago di vetro e il ventricolo larvale. E) Iniezione del morfolino fluorescente nel ventricolo del cuore. Barre di scala uguale a 100 micron.
Figura 4. Dispersione di morfolino tutto il pesce. A) Zebrafish 3 giorni vecchio larva. B) fluorescenza della fluoresceina-tag morfolino tutto il corpo vascolare (v) 5 min postale ventricolare iniezione. C) Dispersione della morfolino tutto l'animale, compreso finfold (FF), cervello (b) negli anziani larva dopo iniezioni di morpholino ogni 12 ore D) I tessuti nella pinna caudale larvale e del tronco:.. notochord (n), midollo spinale (sc), pigmento (p), e finfold (ss) E) Dispersi morpholinoalcuni minuti dopo l'iniezione nei tessuti larvali tronco compreso il finfold. F) immagine Brightfield di non iniettato tronco larvale e pinna caudale. Linea tratteggiata indica il piano amputazione futuro. G) fin uninjected ripreso con il filtro GFP mostra autofluorescenza in verde (punte di freccia). La forma dendritica delle strutture fluorescenti suggerisce che si tratta di cellule del pigmento. H) Brightfield immagine di un larvale pinna caudale chirurgicamente amputata attraverso la notocorda, muscolo e del midollo spinale. I) immagine fluorescente che mostra la distribuzione morpholino nei tessuti del moncone. Morpholino incorporazione in muscoli, midollo spinale, notocorda e finfold. J) rigenerata strutture finfold caudali di wild-type larva. La linea nera ripercorre i tessuti rigenerati per l'analisi quantificazione. K) inibizione Morpholino-mediata della rigenerazione. La linea nera tracing evidenzia chiaramente la ridotta rigenerazione rerisposta accettabili dopo knockdown morfolino. L) rigenerato finfold caudale di larva iniettato con un morfolino controllo disadattamento che mostra una risposta simile rigenerazione come in larva non iniettato (J). Barre di scala uguale a 100 micron.
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Discussion
L'iniezione intraventricolare fornisce un metodo di valutazione rapida e affidabile per analizzare la funzione genica nelle fasi successive di sviluppo o di omeostasi del corpo senza alterare la funzione del gene durante l'embriogenesi. Per assicurare il successo di questa tecnica, si deve essere consapevoli di quattro punti critici: 1) dimensioni dell'ago, 2) essiccazione dell'ago, 3) minimizzare il volume, e 4) tempo di esposizione minima nella soluzione sedazione. Aghi che sono troppo piccoli saranno intasare frequentemente, mentre gli aghi che sono troppo grandi per non danneggiare il ventricolo e causare sanguinamento eccessivo. Mentre 20 micron è consigliato, l'ago deve mai essere più di un quinto delle dimensioni della camera ventricolare. Un secondo punto critico è quello di mantenere l'ago si secchi e intasamento. Le piccole dimensioni dell'ago e le inevitabili pause frequenti per sedare, il trasferimento e la posizione della larva può fornire tempo sufficiente per consentire al morpholino sulla punta dell'ago asciugare e intasare l'ago. Per impedirequesto, si può immergere l'ago in una capsula di Petri di 1x PBS. Un terzo punto critico è quello di minimizzare gonfiore del ventricolo troppo alto di un volume. Se il dosaggio è limitata dalle dimensioni dell'ago, poi aumentando il numero di iniezioni è sempre preferibile aumentare il volume: volumi maggiori possono causare lesioni tratto al cuore. Un quarto punto critico è l'estensione della sedazione. Il tempo sedazione è basato sulla lunghezza del tempo necessario per la procedura. Le larve può rimanere nella soluzione sedazione e rimanere sedato per diversi minuti, perché sono piuttosto robusti e resuscitare piuttosto facilmente. Tuttavia, mantenendo il pesce troppo a lungo in anestesia ne comprometterebbe il recupero o troppo breve li farà rivivere durante l'iniezione. Pertanto, si dovrebbe sedare solo il numero di larve che si può iniettare in un periodo di 4 min.
Una limitazione di questo metodo è che la corrente morfolino non bersaglia funzione genica in un tessutoModo specifico. Due diverse modifiche possono fornire specificità del tessuto: Una modifica è di utilizzare Morpholinos gabbia. Dopo l'attivazione dalla luce laser da un microscopio confocale, questi Morpholinos inibiscono il loro obiettivo gene, l'esposizione confocale in modo temporizzato può fornire un controllo temporale e spaziale all'attività morpholino. Morpholinos gabbia sono stati utilizzati per indirizzare geni durante lo sviluppo iniziale dopo l'iniezione in embrione unicellulare. Mentre consegna allo stadio unicellulare può lavorare a bersaglio geni durante l'embriogenesi, la concentrazione del morfolino sarà probabilmente troppo bassa stadi larvali successive a causa del numero di divisioni cellulari successive progredire dello sviluppo allo stadio larvale 13. La quantità di morfolino si può iniettare nella unicellulare stadio è anche limitato dalla tossicità 13-15. Una seconda modifica è possibile iniettare direttamente un morfolino nell'organo o tessuto da studiare quando dimensioni e di imaging consentono. La larva zebrafish è trasparente, così mos di visualizzazionet organi interni dopo che hanno sviluppato non dovrebbe essere un problema. Le Morpholinos fluoresceina-tagged lavorano con questo protocollo; Pertanto, fluorescenza può essere utilizzato per tenere traccia della distribuzione e localizzazione tessuto-specifica del morfolino. L'incorporazione del morfolino fluoresceina-tag nelle cellule dei tessuti richiede la presenza del reagente Endo-Porter, così un'altra modifica consisterebbe nel limitare la distribuzione spaziale del reagente Endo-Porter per iniezione a valori inferiori direttamente nel tessuto bersaglio. Così, la risoluzione spaziale dovrebbe essere possibile con questa tecnica.
Ci sono metodi iperespressione transgenici che prevedono il controllo temporale e spaziale dell'espressione genica esogeno combinando promotori tessuto-specifici con heat-shock o promotori di tamoxifene-inducibile che permette l'analisi della funzione genica nelle fasi successive di sviluppo o in alcuni tessuti utilizzando tessuti specifici promotori 16-19. Ciò include la transgenic espressione di costrutti dominanti negativi progettate per creare un prodotto che può outcompete il gene endogeno. Questa strategia knockdown è suscettibile agli effetti fuori bersaglio quando un transgene produce livelli di espressione sproporzionati di un prodotto transgenico che acquisisce guadagno di funzione effetti 20 o quando si integra in un gene endogeno e distrugge la funzionalità del gene 21, 22. Mentre Morpholinos possono anche generare effetti off-target, si può più facilmente controllare e limitare questi effetti utilizzando Morpholinos controllo di mismatch con simili ma leggermente alterati sequenze bersaglio che non vincolano l'mRNA bersaglio, utilizzando più Morpholinos antisenso che colpiscono diverse sequenze all'interno della stesso mRNA e testando differenti concentrazioni morpholino 13-15. Inoltre, Morpholinos possono essere prodotti e testati molto più veloce e più economico di progettazione, alzando e testando diverse linee transgeniche dominanti-negativi. Pertanto, l'ininiezione traventricular di Morpholinos fornisce uno strumento utile per atterramento geni nelle successive fasi di sviluppo, quando la transgenesi dominante negativo non è possibile. Quando una strategia transgenico dominante-negativa è possibile, morfolino iniezione intraventricolare è un approccio alternativo per confermare la specificità del transgene dominante negativo overexpressed.
È probabile che le concentrazioni efficaci fra diversi Morpholinos variano, come fanno quando li utilizzano per gene knockdown durante l'embriogenesi 13, 15. Per il gene bersaglio in questo studio, non abbiamo osservato un effetto sulla rigenerazione a dosi inferiori a 3,5 mm, e gli effetti non specifici non sono stati osservati in corrispondenza mancata controlla con questa concentrazione morfolino.
Iniezione intraventricolare consente la distribuzione di piccole molecole per valutare l'attività e l'efficacia in un sistema animale intero in tempo reale quando efficacia è limitata dalla Penetrazionare attraverso la pelle o il sistema digerente o dalla quantità di composto disponibili. Permette anche l'orientamento dei tessuti quando non possono essere bersaglio di iniezioni dirette, come è il caso per il finfold. Questo metodo non fornisce non solo uno strumento per studiare la funzione del gene durante la rigenerazione fin nelle fasi larvali. Poiché il morfolino integra nella finfold larvale comprendente cellule mesenchimali e dell'epidermide, potrebbe anche fornire una tecnica adatta per studiare il ruolo di geni che svolgono parte al processo di guarigione della ferita o l'insorgenza del cancro della pelle. L'iniezione di morfolino con Endo-Porter può essere applicato anche ad organi o tessuti in zebrafish adulto, che sono suscettibili di intervento chirurgico e traslucide linee di zebrafish adulto sono disponibili bersaglio. Inoltre, questo metodo non è limitato a zebrafish; dispersione mediante iniezione intraventricolare può essere utilizzato su altri modelli vertebrati e, soprattutto quei modelli che mancano ancora efficaci metodi gene recessivocome Xenopus, Axolotl e Newt, che sono anche importanti modelli per gli studi di rigenerazione.
Così, l'iniezione intraventricolare nel zebrafish offre la possibilità di controllare l'espressione genica temporalmente con un protocollo relativamente breve di indirizzare diversi tessuti, e la versatilità di questo metodo permette all'impiego con linee transgeniche zebrafish nonché per altri organismi che mancano transgenesi funzionale o strategie gene knockout.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), desideriamo ringraziare Ayele Tsedeke Taddese per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
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