Summary
そのような遺伝子特異モルホリノの脳室内注射を用いた組織再生などの開発および生理学的恒常性の後期段階の間に遺伝子機能を評価するためのゼブラフィッシュに適応逆遺伝学的方法。
Abstract
ゼブラフィッシュは、細胞や臓器や付属物再生の分子生物学を理解するための重要なモデルである。しかしながら、逆遺伝学を採用する分子戦略はまだ十分にゼブラフィッシュ胚形成後の幼虫の段階の間に再生または組織の恒常性における遺伝子機能を評価するために開発されておらず、ゼブラフィッシュの幼生内のいくつかの組織が標的とすることは困難である。遺伝子特異的モルフォリノの脳室内注射は、ゲノムこれらの段階で、時間的に制御された方法でゼブラフィッシュの遺伝子を標的とする現在の無力のための別の方法を提供します。この方法は、以前はこのような幼虫尾鰭、多くの場合、非侵襲的に組織再生を研究するために使用される構造のものと到達することは不可能だった構造を含む全身の様々な組織、に完全に分散し、モルホリノのその後の取り込みが可能になります。幼虫finfold再生中に活性化されるいくつかの遺伝子も、プレゼンしている大人の脊椎動物の組織を再生中のTは、その幼虫は成人で再生を理解するための有用なモデルである。このモルホリノ分散法は、幼虫組織の再生だけでなく、胚発生後の組織恒常性を調節する他の生理現象に必要な遺伝子の迅速かつ容易な同定を可能にする。したがって、この配送方法は胚発生の後、遺伝子機能の評価に時間的制御のために現在必要な戦略を提供しています。
Introduction
臓器や付属の再生は、生存と健康のために根本的に重要である。しかし、ヒトを含むいくつかの脊椎動物は、再生能力が限られている。いくつかの動物モデルは大規模な再生能力を持っている存在するが、臓器及び付属器再生中に遺伝子機能を評価するために、遺伝子技術を逆に非常に限られたまたは存在しないままである。したがって、新たなアプローチがこれらのモデル生物において再生の分子生物学を分析する必要がある。
ゼブラフィッシュは、いくつかのトランスジェニックフィッシュ系統が細胞を追跡するために存在しているため、セルと、その重要な複数の臓器、組織、および付属の再生する能力だけでなく、だけでなく、臓器及び付属器の再生1、の分子生物学を理解するための十分に確立されたモデルであり、遺伝子構築物2、3を過剰発現する。しかし、幼虫ゼブラフィッシュにおける遺伝子阻害は主にoverexpreに制限されていますその導入遺伝子産物の遺伝子の内因性活性を反映していない機能獲得効果を得ることができ、すべての関心のある遺伝子または使用できませんドミナントネガティブ構築物のssion。したがって、具体的ノックアウトまたはノックダウンすることにより遺伝子発現を除去するための代替方法は、これらの問題を克服するために必要とされる。
遺伝子特異的TALENSを用いて標的遺伝子機能をノックアウトするための逆遺伝学的手段として存在する;遺伝子の最初の要件は、胚発生のさらなる進行を防ぐため、しかしながら、このノックアウト戦略は、非常に頻繁に初期の胚発生の間の機能的評価に限定されるものである。したがって、そのようなTALENSを使用して、現像後の再生または臓器の恒常性として、後の現象を研究することは5,4を妨げている。したがって、代替の遺伝子除去戦略は、完全に形成され器官および構造遺伝子の要件を評価するために開発初期に遺伝子機能を標的とすることが必要である。 モルホリノ注射は、いくつかの成体器官において遺伝子を標的と大人のフィン6-8の再生に有効であることが示されているが、これらの方法は、エレクトロポレーションを必要とし、多くの内臓が、それらの場所またはによる電気に対する感受性のいずれかに電気穿孔することが困難である混乱。直接注入は、それらの構造的完全性を破壊する可能性があるため、又はそれらの大きさが制限されているのでさらに、幼虫の一部の組織は、直接注入することが困難である。 finfoldへの直接注入ができないため、幼虫の尾鰭は、そのような構造です。従って、エレクトロポレーションおよび直接注入する代わりどちらかを注入するには小さすぎる、またはエレクトロポレーションすることができない組織における遺伝子を標的化するために必要であった。
幼虫の尾びれの再生中に特定の遺伝子の機能を標的とし、阻害するために、我々は既存の許可モルホリノ技術を修正したA後期段階の幼虫での尾びれ再生中の遺伝子機能のssessment。この方法は、一緒に遠藤·ポータートランスフェクション試薬10とフルオレセインタグ付きモルフォリノの脳室内配達9を採用しています。一度心室内、モルホリノ - エンド - ポーター混合物を速やかに血管系を経由して幼虫全体に広がり、ターゲットに、以前には不可能だった組織に入る。この注入方法は、特定の組織中の遺伝子を標的とするように修飾することができ、恐らく、現在、遺伝子機能を阻害するために逆遺伝学的方法を欠いている他の動物モデルに適用することができる。このように、すぐに幼虫の段階で一般的な臓器の恒常性と再生の間に遺伝子機能を研究するため、広範な用途の可能性を迅速かつ簡単な方法を提供しています。
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Protocol
1。ガラス針の作製（図1）
- 注射針（ 図1A）を調製するために直径0.75mmのガラスキャピラリーを使用する。
- ニードルプラーにガラスキャピラリーを置き、次のパラメータを指定して針を引く：加熱サイクル値：463;サイクル値を引っ張っ：230;速度：150ミリ秒;時間：150ミリ秒（ 図1B）。
- マイクロメータ接眼レンズでステレオスコープの下に直径20μmの針を生産する時計メーカーピンセットで引っ張らガラスキャピラリーを破る。
- 針をシャープにし、20μmのベベル（ 図1Cおよび1D）を生成するために湿ったゴム製の糸車で旋盤を使用してください。注：シャープ、面取りされた針は、心室への挿入の容易さを改善し、したがって、組織への損傷を最小限にし、有孔筋肉針（ 図1E-G）を除去した後に再シールすることを可能にする。
2。た準備モルホリノソリューションのATION
- 7.5mmの最終濃度に1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）中で凍結乾燥されたモルホリノを溶解することによってモルホリノの在庫を準備します。 [詳細については、メーカーの説明書（材料表）を参照してください]。
- の3.5mmモルホリノおよび0.5 mMの遠藤ポーターの最終濃度は2.8μL遠藤ポーター原液（1 mM）を（材料表を参照）2.5μlのホリノストック溶液（7.5 mm）を混合することにより、モルホリノ注射液を準備します。
3。モルホリノ注射の調製（図2）
- 10μLmicroloaderピペットチップをマイクロピペットを用いて、この溶液5μlと面取りガラス針をロードします。
- 空気圧ピコポンプ（ 図2A-C）に接続されているマイクロマニピュレータの針ホルダーにガラス針を挿入します。
- 針のみが必要となるよう顕微鏡の隣に針ホルダを配置幼虫（ 図2A）の心室に挿入する1つの平面方向に移動させることができる。
- 約45℃で注射の角度を調整します。
- 保持圧力：次のようにマイクロインジェクター値を設定平方インチあたり20ポンド（PSI）を;吐出圧：15 PSI;ゲーティング、1.9の周期値（10.9ミリ秒に相当）の100ミリ秒の範囲。
- 1.5％（w / v）のゲルを20mlを生成するために、標準的なマイクロ波を用いて1×PBS中でアガロース融解する。 10センチメートルペトリ皿に融解したゲルを注ぐ。一度硬化、アガロースが鎮静幼虫が11（ 図2D及び2E）に配置されている畝を有するように、暖かいアガロースに溝付きの注射フォームを配置します。
4。注射（図3）
- 彼らは触れないように応答を停止するまで、20 mg / Lのトリカイン（1 - エチルM-アミノ安息香酸エチルメタンスルホネート）で水槽の水100mlに幼虫を麻酔。
- プラスチックパスツールpipettを使用腹側の溝（ 図3A）の垂直アガロース壁に直面しているように、慎重に、ウェットアガロース金型の溝に鎮静幼虫を転送するE。
- 心室が離れて注射針（ 図3A）から向くように実体顕微鏡下でアガロースプレートを置きます。
- 心臓の心室に挿入し、針を下げます。わずか1〜2ミクロン深く針（ 図3Bおよび3C）を挿入しないように注意しながら心室に針を挿入します。
- 針が挿入されると、心臓（ 図3Dと3E）のクリアを可能にするために間隔を待っていると、4〜6パルス、溶液の各提供3 NLと心室にホリノソリューションを注入する。
- 注射後、針（挿入の平面に平行）を削除してから、慎重に、E3媒体BACで満たされたプラスチック製パスツールピペットを用いて幼虫を転送新鮮E3培地を含むペトリ皿にkである。
- 注入された幼虫を転送する際に、針の乾燥を防ぐために、1X PBSを含むペトリ皿に針を入れます。
- 繰り返して実験期間中4.1から4.6毎に12から24時間を繰り返します。注：注射を繰り返すこと、細胞内のモルホリノの取り込みと維持を確実にします。
5。注射の分析（図4）
- 彼らは触れないように応答を停止するまで、20 mg / Lのトリカインで水槽の水100mlに魚を麻酔。
- 平坦なウェット1.5％横方向に幼虫を置きE3培地で覆われ（w / v）アガロースプレート。
- 明視野および蛍光イメージングと実体顕微鏡を用いた画像の幼虫。注意：幼虫が透明であるため、フルオレセインタグ付きモルホリノ直接注射した後、動物を通して血管内に蛍光グリーンなどの表示されるはずです。この蛍光は、さらにによって血管組織に分散する15分（ 図4A〜4C）。
回生伸長の6。評価
- フィジー画像Jフリーソフトウェア（http://fiji.sc/Fiji）を使用して撮影した画像を評価する。再生を調査するための、制御、およびモルホリノを注射幼虫で発生した回生成長の量を決定するために、ライントレースツールを使用します。
- メインフィジーウィンドウにファイルをドラッグ＆ドロップで画像、フィジーで元の画像ファイルのオープン1をキャリブレーションする。
- 以下のすべての画像の縮尺を設定するには、メインメニューの「分析」に進みます。
- 「設定スケール」メニューをクリックしてドロップダウン。
- このウィンドウでは、チェックボックスをクリックして「グローバル」オプションをオンにします。
- 今（ステップ6.1を参照）ドラッグ＆ドロップで再び再生成長量を測定するために画像を開く。
- ツールバーの「フリーハンドの選択」ツールを選択します。
- 測定部位（FIを取り囲むgures 4J-4L）。
- Ctrlキーを押しながら+ Mこれは、正方形ピクセルで囲まれた領域の値を示す新たな「結果」ウィンドウが開きます。
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Representative Results
背側（ 図3A）に近づいたときに鋭く、ベベル注射針を簡単にゼブラフィッシュ幼生の心臓の心室に配置されます。心臓がポンピング続け、血流が針（ 図3Bおよび3C）の存在にもかかわらず維持される。慎重な注射は心臓（ 図3E）へのモルホリノの注入にもかかわらず、心室や心臓の収縮（ 図3D）の形態を妨げることはありません。
数分以内に、モルホリノ-エンド-ポーター溶液は、脈管構造（ 図4Aおよび図4B）を介して体全体に分配する。蛍光（ 図4C）から見たモルホリノは、その後、少なくとも12時間以上finfoldや脳などの様々な組織への血管系から配布されています。
この手法では、目の遠位先端部を除去するEのfinfold、脊髄、遠位体幹筋、遠位脊索と色素細胞（ 図4Dおよび4H）の先端;特に原因コンパクト（筋肉）、Sサイズ（脊髄と脊索）と薄さ（finfold）に直接注入することにより、ターゲットが、これらの内の蛍光によって見られるシリアル心室注射後にモルホリノを組み込むように見えるのが困難であるすべてが注射していない動物（ 図4Fおよび4G）と比較した組織（ 図4E）。したがって、この方法は、比較的容易に個々に標的化することが困難である組織へのモルホリノの送達を促進し、それが一度に再生するフィンのいくつかの組織における遺伝子機能の評価を可能にする。再生に関与する特定の遺伝子の重要性を評価するためには、外科的に部分的にincorpを持っているすべての組織を切除、幼虫尾鰭（ 図4H）を amputatesモルホリノ（ 図4I）を orated。幼虫finfoldは数日後に切断（DPA）（ 図4J）内でその構造を再生成します。ターゲットモルホリノ 注射していない（ 図4J）およびミスマッチモルホリノコントロール（ 図4L）と比較した摂動再生応答（ 図4K）での再生（未発表データ）の結果を得るために必要とされる遺伝子。回生伸長に対するこれらのモルホリノ実験の全体効果は、再生された組織をトレースした領域（ 図4J-4L）を比較することにより公的に利用可能なフィジープログラム12は標準形態計測ツールを用いて測定することができる。このように、この遺伝子標的法は、再生過程における遺伝子の重要性をテストするための迅速かつ比較的容易なアッセイを提供する。
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図1：注射用ガラスキャピラリ針の調製。 A）ガラス毛細管）上記（引上げ前に、針を引っ張って（下記）。B）針を面取りするための装置。C）旋盤を引っ張るとガラス針をシャープ。針は双眼鏡を通して観察されている。D）旋盤が濡れたゴム製の回転ディスクである。針はゆっくりとディスク上に降下されており、E）尖った針が幼虫の心臓に針の端部全体を挿入するために必要なスペースを最小限に抑えるために）20ミクロン（幅よりも、もはや短かさ（20μm）を持っている必要があります針の先端。G）鮮鋭化後のベベル形状を示す針の先端の概略図を示す心室。F）より高い倍率画像。
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図2。射出装置は、設置しました。A）ゼブラフィッシュの幼虫へのモルホリノの注入のための完全な装置が。B）注射の注射に使用するD）フォーマットプレス用の空気圧を調整する。C）ピコポンプの間、針の配置を制御するためにスタンド注射用幼虫を安定化するために使用アガロースモールドを作成する。E）アガロースモールド。
図3。魚の幼虫の注入。 A）ゼブラフィッシュの幼虫との関係で、針の配置。B）心室への挿入。C）の針でのモルホリノの蛍光が、injecti前に心室には存在しない、D）で明視野画像は、ガラス針と幼虫心室心室への蛍光モルホリノの、E）インジェクションとの大小関係を示しています。スケールバーは、100μmに等しい。
図4。魚全体モルホリノの分散。 A）ゼブラフィッシュ3日齢の幼虫。古いの体血管系（V）5分後に心室注入。C）finfold（FF）を含む動物全体モルホリノの分散、脳（B）を通じてフルオレセインタグ付きモルホリノのB）の蛍光モルホリノの注射の後、幼虫は12時間D）幼虫尾びれやトランク内の組織：脊索（N）、脊髄（SC）、顔料（P）、およびfinfold（FF）E）が分散モルホリノ数分finfold。F）注射していない幼虫体幹と尾びれの明視野画像を含む幼虫トランク組織への注入後。破線は将来の切断面を示している。、G（緑矢印での自家蛍光を示すGFPフィルターで画像化）非注射FIN）。脊索、筋肉と脊髄を通じて外科的に切断された幼虫尾鰭の蛍光構造の樹枝状形状は、これらの色素細胞であることを示唆している。H）明視野像。切り株組織におけるモルホリノ分布を示すI）蛍光画像。筋肉へのモルホリノ取り込み、脊髄、脊索とfinfold。、J）は、野生型幼虫の尾finfold構造を再生した。黒い線は、定量分析のために再生組織をトレースします。再生のK）モルホリノ媒介阻害。黒線のトレースは明らかに低下し、再生再強調して注射していない幼虫（J）と同様の再生応答を示すミスマッチ対照モルホリノを注射された幼虫のホリノノックダウン後の応答。、L）再生した尾finfold。スケールバーは、100μmに等しい。
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Discussion
脳室内注射は、胚発生の間の遺伝子機能に影響を与えることなく、現像または身体の恒常性の後期段階での遺伝子機能を試験するための迅速かつ信頼性のある評価方法を提供する。この技術の成功を確実にするためには、4つの重要な点に注意する必要があります。針のうち1）針のサイズ、2）乾燥、3）音量を最小にし、鎮静溶液中の4）最小限の露光時間。大きすぎる針が心室に損傷を与え、過度の出血の原因になりますしながら、小さすぎる針は、頻繁に詰まります。 20程度が推奨されている間、針は心室以上の五分の一のサイズであってはなりません。第2の臨界点は、乾燥して目詰まり針を維持することです。針のサイズが小さく、必然的な、頻繁に一時停止落ち着いた、転送や位置に幼虫が針先端のモルホリノが乾燥し、針を詰まらせることを可能にする十分な時間を提供することができます。防ぐためにこれは、一方は1×PBSのペトリ皿に針を浸すことができる。第三の重要な点は、ボリュームが高すぎることで心室の肥大化を最小限に抑えることである。投与量は、針のサイズによって制限される場合、注射の回数を増加させることは常に体積を増加することが好ましい：より大きな体積は、心臓へのストレッチ損傷を引き起こす可能性がある。第四の重要な点は、鎮静の程度である。鎮静時間は、手順に必要な時間の長さに基づいている。幼虫は鎮静溶液中に残り、彼らはむしろ、簡単ではなく、堅牢で蘇生されているため、数分間鎮静残ることができる。しかし、麻酔薬には長すぎる魚を維持することは、その回復が損なわれるか、または短すぎる彼らは、注入中に復活させることになります。したがって、1は1が4分の期間内に注入することができ、幼虫の数だけを鎮静する必要があります。
この現在の方法の一つの限界は、モルホリノ、組織における遺伝子機能を標的としないことである固有の方法。二つの異なる変更は組織特異性を提供することができます。一修正は、ケージモルフォリノを使用することです。共焦点顕微鏡からのレーザ光による活性化後、これらのモルホリノので時限共焦点露光モルホリノ活動に時間的および空間的制御を提供することができ、それらの遺伝子標的を阻害する。ケージドモルフォリノは、一細胞期胚に注入した後の初期発生中の遺伝子を標的とするために使用されている。単一細胞段階での受け渡しは胚発生時の遺伝子をターゲットに作業することができますが、モルホリノの濃度は、おそらくのため開発が幼虫期13に進むにつれて連続した細胞分裂の数に後で幼虫の段階では低すぎることになります。ひとつ細胞期に注入することができるモルホリノ量も13-15毒性によって制限される。第2の可能な修正は、直接サイズと撮影を許可した場合に研究される器官または組織にモルホリノを注入することである。ゼブラフィッシュの幼虫は半透明なので、閲覧モス彼らが開発した後に内臓をトンと、問題になることはありません。フルオレセインタグ付きモルフォリノは、このプロトコルで動作します。従って、蛍光はモルホリノの分布および組織特異的な局在化を追跡するために使用することができる。組織細胞内へのフルオレセインタグ化モルホリノの取り込みはエンド-ポーター試薬の存在を必要とするので、別の修飾は、直接標的組織中に低い量でそれを注入することにより、エンド-ポーター試薬の空間分布を制限することである。このため、空間分解能は、この技術で可能にする必要があります。
組織を使用することにより現像の後の段階で、または特定の組織における遺伝子機能の分析を可能にする熱ショックまたはタモキシフェン誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターとを組み合わせることにより、外来遺伝子発現の時間的および空間的制御を提供するためのトランスジェニック過剰発現の方法がある特異的プロモーター16〜19。これはtransgeが含まれてい内因性遺伝子を負かすことができる製品を作成するために設計されたドミナントネガティブコンストラクトのNIC式。導入遺伝子は、遺伝子に組み込まれ、遺伝子の内因性機能21、22を破壊したときの機能獲得効果20かを取得ジェニック製品の不均衡な発現レベルを生成する際に、このノックダウン戦略は、オフターゲット効果を受けやすい。モルホリノはまた、オフターゲット効果を生成することができるが、一方がより容易に制御し、内の異なる配列を標的とする複数のアンチセンスモルホリノを用いて、標的mRNAに結合しない類似しているがわずかに変化した標的配列とミスマッチ対照モルホリノを使用して、これらの効果を制限することができ同じmRNAと異なるモルホリノ濃度を13〜15をテストし。また、モルフォリノが生成され、より速く、より安く、設計向上と異なるドミナントネガティブトランスジェニック系統のテストよりもテストすることができます。そのため、中モルフォリノのtraventricular注入はドミナントネガティブ遺伝子導入が不可能な場合には、開発の後期段階で遺伝子をノックダウンするための有用なツールを提供しています。ドミナントネガティブトランスジェニック戦略が可能である場合には、脳室内注射は、モルホリノ、過剰発現、ドミナントネガティブ導入遺伝子の特異性を確認するための代替アプローチである。
これらは胚形成13,15の間に遺伝子ノックダウンのためにそれらを使用してない場合のように、それは、異なるモルホリノ間の効果的な濃度が変化する可能性がある。この研究において標的遺伝子について、我々は3.5 mMより低い用量での再生に対する効果を観察しなかった、非特異的な効果がミスマッチでは観察されなかったが、このモルホリノ濃度で制御する。
脳室内注射は、有効性がpenetによって制限される場合に、即座に全動物系における活性及び有効性を評価するために小分子の分布を可能にする皮膚や消化器系を介して、または利用可能な化合物の量によって配給。それらは、直接注射によって標的化することができない場合にfinfoldの場合のように、それはまた、組織のターゲティングを可能にする。このメソッドは、幼虫の段階でフィンの再生中に、遺伝子の機能を研究するためのツールを提供していません。モルホリノは間葉細胞および表皮を含む幼虫finfoldに統合されるので、それはまた、創傷治癒または皮膚癌の発生の過程で役割を演じる遺伝子の役割を調査するための適切な技術を提供するかもしれない。一緒に遠藤·ポーターとのモルホリノの注入は、手術と半透明の大人のゼブラフィッシュラインに適している利用可能な大人のゼブラフィッシュにおける臓器や組織を、ターゲットに適用することができる。さらに、この方法は、ゼブラフィッシュに限定されるものではない。脳室内注射による分散体は、依然として有効劣性遺伝子法を欠く、特にそれらのモデル、並びに他の脊椎動物モデルで使用することができまた、再生の研究のための重要なモデルであるアフリカツメガエル 、ウーパールーパーやイモリ、など。
このように、ゼブラフィッシュにおける脳室内注射は、時間的に複数の組織を対象とする比較的迅速なプロトコルを使用して遺伝子発現を制御する能力を提供しており、この方法の汎用性は、ゼブラフィッシュトランスジェニック系統との使用のためだけでなく、機能的な遺伝子導入が不足しているか、他の生物のために可能にする遺伝子ノックアウト戦略。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、私たちは技術的なサポートのためにAyele Tsedeke Taddeseに感謝したい、ドイツ学術振興（DFG）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
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