Summary
이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.
Abstract
제브라 피쉬는 세포와 기관 및 부속 기관 재생의 분자 생물학을 이해하는 중요한 모델입니다. 그러나, 역 유전학을 사용하는 분자 전략은 아직 충분히 제브라 피쉬 배아 후 유생 단계 동안 재생 또는 조직의 항상성의 유전자 기능을 평가하기 위해 개발되지 않은, 그리고 제브라 피쉬의 유충 내에서 여러 조직을 대상으로하기 어렵다. 유전자 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사는 유 전적으로 이러한 단계에서 일시적으로 통제 된 방식으로 zebrafish의 유전자를 표적으로하는 현재의 무능력에 대한 대체 방법을 제공합니다. 이 방법은 이전과 같은 유생의 꼬리 지느러미, 종종 비 침습적 조직 재생을 연구하는 데 사용되는 구조에서와 도달하기 불가능했던 구조 등 신체 전반에 걸쳐 다양한 조직에 완전 분산 모르 폴리 노의 연속 편입 할 수 있습니다. 애벌레 finfold 재생하는 동안 활성화 몇 가지 유전자는 프리젠됩니다성인 척추 조직의 재생에 t, 그래서 애벌레는 성인의 재생을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 이 모르 폴리 노 분산 방법은 애벌레 조직의 재생뿐만 아니라 배아 후 조직의 항상성을 조절하는 다른 생리 현상에 필요한 유전자를 빠르고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 전달 방법은 배아 발생 후의 유전자 기능의 평가에 시간적 제어에 대한 현재 필요한 전략을 제공한다.
Introduction
장기와 부속의 재생은 생존과 피트니스에 대한 근본적으로 중요하다 그러나, 사람 등 여러 가지 척추 동물은 재생 능력을 제한했다. 여러 동물 모델은 광범위한 재생 능력을 가지고 존재하지만, 기관 및 부속 기관 재생하는 동안 유전자 기능을 평가하기 위해 유전자 기술을 반전은 매우 제한적이거나 존재하지 않는 남아 있습니다. 따라서 새로운 접근 방식은 이러한 모델 생물에서 중생의 분자 생물학을 해부하는 데 필요합니다.
제브라 피쉬는 여러 유전자 변형 물고기 라인이 세포를 추적하기 위해 존재하기 때문에 셀 때문에 중요한 여러 장기, 조직 및 부속을 다시 생성 할 수있는 능력뿐만 아니라,의뿐만 아니라 기관 및 부속 기관 재생 1, 분자 생물학을 이해하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다 유전자를 과발현하는 것은 2, 3를 구성한다. 그러나, 유생 지브라 피쉬의 유전자 억제는 주로 overexpre에 한정누구의 유전자 제품 유전자의 내인성 활성을 반영하지 않습니다 이득의 기능 효과를 얻을 수있는 모든 관심의 유전자 또는 사용할 수없는 지배적 인 음성 구조의 (투약) 소지. 따라서, 구체적으로 녹아웃 또는 넉다운하여 유전자 발현을 제거하는 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요하다.
TALENS은 유전자 기능을 녹아웃 역방향 유전자 수단으로서 존재하여 표적 유전자 특이; 유전자의 초기 요구 사항이 배아 발달의 추가 진행을 방지하기 때문에,이 녹아웃 전략은 매우 자주 초기 배 발생 중에 기능 평가로 제한됩니다. 따라서, 이러한 TALENS를 사용하여 개발 한 후 재생 또는 기관의 항상성 등의 이상 현상을 연구하는 5 4를 배제한다. 따라서 대체 유전자 제거 전략은 완전히 형성 장기 및 구조 유전자 요건을 평가하는 초기 현상 후 유전자 기능을 대상으로하는 필요가있다. 모르 폴리 노를 주사 몇 성인 장기에 유전자를 대상으로하고, 성인이 핀 6-8의 재생에 효과를 볼되었습니다, 그러나이 방법은 전기 충격이 필요하고 많은 내부 장기로 인해 자신의 위치 나 때문에 전기에 대한 민감성에 하나 electroporate하기 어려운 중단. 직접 분사가 구조적 무결성을 방해 할 수 있기 때문에 또는 크기가 제한되어 있기 때문에 또한, 유충의 일부 조직에 직접 주사하기가 어렵습니다. finfold에 직접 분사 할 수 없기 때문에 유충의 꼬리 지느러미는 하나의 구조입니다. 따라서, 전기 천공 및 직접 분사에 대한 대안은 어느 주입 너무 작아서 또는 일렉트로 수없는 조직에서의 유전자를 표적으로 필요했다.
유생 꼬리 지느러미 재생시 특정 유전자의 기능을 대상으로 억제하기 위해, 우리는 모르 폴리 있도록 기존 기술을 수정 한늦은 무대 애벌레 꼬리 지느러미 재생하는 동안 유전자 기능의 ssessment. 이 방법은 함께 엔도 - 포터의 형질 전환 시약 (10)과 형광 태그가 morpholinos와의 심실 전달 9를 사용한다. 일단 심실에, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 혼합물을 신속하게 혈관을 통해 유충에 걸쳐 퍼져 대상으로 이전에 불가능했을 조직을 입력합니다. 이 주입법은 특정 조직에서의 유전자를 표적으로하도록 변경 될 수 있으며, 아마도 현재의 유전자의 기능을 억제하는 역 유전 방법 부족한 다른 동물 모델에 적용 할 수있다. 따라서, 즉시 유충 단계에서 일반적으로 기관의 항상성 및 재생하는 동안 유전자의 기능을 연구하는 넓은 범위의 사용 가능성이있는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.
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Protocol
1. 유리 바늘의 준비 (그림 1)
- 주사 바늘 (그림 1A)를 준비하기 위해 825 ㎜의 유리 모세관을 사용합니다.
- 바늘 풀러에 유리 모세관을 놓고 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 바늘을 당겨 : 난방 사이클 값 : 463; 사이클 값 당기는 : 230; 속도 : 150 밀리 초; 시간 : 150 밀리 초 (그림 1B).
- 마이크로 미터의 접안 렌즈와 입체경에서 20 μm의 직경 바늘을 생산하는 시계 제조 핀셋 뽑아 유리 모세관 휴식.
- 바늘을 날카롭게하고 20 μm의 경사 (그림 1C 및 1D)를 생산하기 위해 젖은 고무 물레와 선반을 사용합니다. 참고 : 샤프 빗면 바늘 뇌실에 삽입의 용이성을 향상시키고, 따라서 조직에 손상을 최소화하고 천공 근육 바늘 (도 1E-G)의 제거 후에 다시 봉인하는 것을 허용한다.
2. Prepar모르 폴리 솔루션의 ATION
- 7.5 mM의 최종 농도로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 동결 건조 된 모르 폴리 용해시켜 모르 폴리 콘텐츠를 준비한다. [자세한 내용은 제조업체의 지침 (재료 표)를 참조].
- 3.5 MM의 모르 폴리 노 0.5 mM의 엔도 - 포터의 최종 농도 2.8 ㎕의 엔도 - 포터 원액 (1 ㎜) (재료 표 참조) 2.5 μL의 모르 폴리 노 원액 (7.5 mm)를 혼합하여 모르 폴리 노 주입 솔루션을 준비합니다.
3. 모르 폴리 노 주입의 준비 (그림 2)
- 10 μL microloader 피펫 팁과 마이크로 피펫을 사용하여이 솔루션의 5 μL와 경 사진 유리 바늘을 넣습니다.
- 압축 공기를 넣은 피코 펌프 (그림 2A-C)에 연결된 미세 조작기의 바늘 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다.
- 다음 현미경으로 바늘 홀더를 놓고 바늘 만 요구되도록유충 (그림 2A)의 심실에 삽입 한 평면 방향으로 이동합니다.
- 약 45 °에서 주사의 각도를 조정합니다.
- 대기 압력 : 다음과 같이 microinjector 값을 설정 평방 인치 (PSI) 당 20 파운드; 토출 압력 : 15 PSI; 게이트의 100 밀리 초 범위는 1.9의 기간 값 (10.9 밀리 초에 해당).
- 1.5 %의 20 ㎖ (w / v) 겔을 생산하는 표준 마이크로 웨이브를 이용하여 1X PBS에서 융해. 10cm 페트리 접시에 녹은 젤을 붓는다. 일단 경화, 아가로 오스가 진정 유충 (11) (그림 2D 및 2E)을 배치 할 수있는 고랑이되도록 따뜻한 아가로 오스에 홈이 분사 형태를 놓습니다.
4. 주사 (그림 3)
- 20 ㎎ / L의 tricaine (L-에틸-m-아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트)가 터치 응답을 중지 할 때까지 수족관 물 100 ㎖에 애벌레를 마취.
- 플라스틱 파스퇴르 pipett를 사용복부 측면은 홈 (그림 3A)의 수직 아가 벽에 향하도록 전자 신중하게 젖은 아가로 오스 금형의 홈에 진정 유충을 전송합니다.
- 심실 멀리 주사 바늘 (그림 3A)에서 향하도록 실체 현미경 아가로 오스 플레이트를 놓습니다.
- 심장 심실에 삽입 바늘을 낮 춥니 다. 만 1 ~ 2 μm의 너무 깊이 바늘 (그림 3B 및 3C)를 삽입되지 않도록주의 심실에 바늘을 삽입합니다.
- 바늘이 삽입되면, 하트 (도 3D 및 3E)의 소거를 허용하도록 간격을 기다리고, 4-6 펄스, 용액의 각 전달 3 NL과 심실로 모르 폴리 용액을 주입.
- 주사 후 바늘 (삽입의 평면에 평행)를 제거하고 조심스럽게 E3 매체의 혈중 알코올 농도로 채워진 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 유충을 전송E3 신선한 배지를 포함하는 페트리 접시로 케이.
- 주입 된 유충을 전송할 때 바늘의 건조를 막기 위해, 1X PBS를 함유하는 페트리 접시로 바늘을 배치.
- 반복 4.1-4.6에게 실험 기간 동안 매일 12 ~ 24 시간을 반복합니다. 참고 : 주사를 반복하는 세포의 모르 폴리 노의 흡수 및 유지 보수를 보장합니다.
5. 주사의 분석 (그림 4)
- 그들은 터치 응답을 중지 할 때까지 20 ㎎ / L의 tricaine과 수족관 물 100 ㎖에 물고기를 마취.
- 평면 젖은 1.5 %에 옆으로 유충을 배치 E3 매체로 덮여 (w / v) 아가로 오스 플레이트.
- 시야 및 형광 이미징과 실체 현미경을 사용하여 이미지의 애벌레. 참고 : 유충이 투명으로, 플루 오레 태그 모르 폴리 노를 직접 주사 후 동물에 걸쳐 혈관에 형광 녹색으로 표시되어야합니다. 이 형광 추가하여 혈관 조직으로 분산됩니다15 분 (도 4A-4C).
재생 파생물의 6. 평가
- 피지 이미지 J 무료 소프트웨어 (http://fiji.sc/Fiji)를 사용하여 촬영 한 이미지를 평가합니다. 재생을 조사하는, 제어 및 모르 폴리 주입 유충에 발생한 회생 성장의 양을 결정하기 위해 라인 추적 툴을 사용한다.
- 이미지를 보정하기 위해, 끌어 주 피지 창에 파일을 드롭하여 피지에있는 원본 이미지 파일 중 하나를 엽니 다.
- 다음의 모든 이미지의 배율을 설정하려면 주 메뉴에서 "분석"로 이동합니다.
- "설정 규모"에 대한 메뉴를 클릭 드롭 다운.
- 이 창에서 체크 박스를 클릭하여 "글로벌"옵션을 설정합니다.
- 이제 드래그 앤 드롭 (단계 6.1 참조)에 의해 다시 회생 성장의 양을 측정하기 위해 화상을 연다.
- 도구 모음에서 "프리 핸드 선택"도구를 선택합니다.
- 측정 할 영역 (FI 둘러싸gures 4J-4L).
- Ctrl 키를 누르면 + M. 이 정사각형 픽셀에 둘러싸인 영역의 값을 보여주는 새로운 "결과"창을 엽니 다.
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Representative Results
(그림 3A) 등쪽으로 접근하면 날카로운, 경 주사 바늘을 쉽게 제브라 피쉬의 유충의 심장 심실에 배치됩니다. 마음은 바늘 (그림 3B 및 3C)의 존재에도 불구하고 펌핑을 계속하고 혈액의 흐름이 유지됩니다. 조심 주사는 심장 (그림 3E)에 모르 폴리 노의 분사에도 불구하고 심실 또는 심장 수축 (그림 3D)의 형태를 방해하지 않습니다.
분 이내, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 솔루션은 혈관 (그림 4a 및도 4b)를 통해 몸 전체에 배포합니다. 모르가 다음과 같은 최소 12 시간 또는 형광 (그림 4C)에서 관찰 더의 finfold 뇌와 같은 다른 조직으로 혈관에서 배포됩니다.
이 방법에서는, 우리는 일의 원위 팁을 제거전자 finfold, 척수, 말초 트렁크 근육, 말초 척색과 색소 세포 (그림 4D 및 4H)의 말단 팁; 이는 모두 구체적으로 인해 소형 (근육)에 직접 분사하여 대상으로 어려운 작은 크기 (척수 및 척색)와 두께 (finfold),하지만 이러한 내에서 형광으로 볼 시리얼 심실 주사, 후 모르 폴리 노를 통합하는 표시 조직 (그림 4E)는 uninjected 동물 (그림 4 층과 4G)에 비해. 따라서,이 방법은 비교적 쉽게 개별적으로 타겟팅하기 어려운 조직에 모르 폴리 노의 전달을 촉진하고, 한번에 회생 핀의 여러 조직에서의 유전자 기능의 평가를 허용한다. 재생에 관련된 특정 유전자의 중요성을 평가하기 위해, 하나는 수술 부분적으로 incorp이있는 모든 조직을 절제, 애벌레 꼬리 지느러미 (그림 4H)을 amputates 모르 폴리 노 (그림 4I를) orated. 애벌레 finfold 며칠 포스트 절단 (DPA) (그림 4 J) 내에서 그 구조를 다시 생성합니다. 모르 폴리 노 타겟팅 재생 (게시되지 않은 데이터)에 필요한 유전자 (그림 4 J)와 불일치 모르 폴리 노 컨트롤 (그림 4 L) uninjected에 비해 교란 재생 응답 (그림 4K)가 발생합니다. 회생 파생물 이러한 모르 폴리 실험의 전체 효과는 재생 조직을 추적 및 공간 (도 4J-4L)를 비교함으로써, 공개적으로 사용 가능한 피지 프로그램 (12)에 표준 형태 계측 도구를 사용하여 측정 할 수있다. 따라서,이 유전자를 표적으로하는 방법은 재생 과정에서의 유전자의 중요성을 테스트하는 빠르고 비교적 쉽게 분석을 제공한다.
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주입 유리 모세관 바늘의 그림 1. 준비. 당기 (위)와 전) 유리 모세관 튜브) 아래 (바늘을 뽑아. B) 니들 당기는 장치. C) 선반 베벨과 유리 바늘을 날카롭게. 바늘은 쌍안경을 통해 볼 수 있습니다. D) 선반은 젖은 고무 회전 디스크입니다. 바늘이 천천히 디스크에 저하된다. E) 날카롭게 바늘이 더 이상 (20 μm의없는 짧은 베벨이 있어야합니다) 애벌레 심장에 바늘의 전체 끝을 삽입하는 데 필요한 공간을 최소화하기 위해) 20 μm의 (폭보다 바늘의 팁. G) 선명 후에 베벨의 형상을 도시 니들 팁의 개략도를 도시 뇌실. F) 고배율 이미지.
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그림 2. 사출 장치를 설정할 수 있습니다.) 제브라 피쉬의 유충에 모르 폴리 노의 주입을위한 완벽한 장치. B) 주사 주사를 사용했다. D) 양식 언론에 대한 공기 압력을 조절한다. C) 피코 펌프 동안 바늘의 위치를 제어하는 스탠드 주사 유충을 안정화하는 데 사용 아가로 오스 금형을 만들 수 있습니다. E) 아가로 오스 금형.
물고기 유충의 그림 3. 사출. 심장 심실에 A) 제브라 피쉬의 유충과 관련하여 바늘의 위치. B) 삽입. C) 바늘의 모르 폴리 노의 형광하지만 심실 결석 이전의 성형. D)에 브라이트 이미지는 유리 바늘과 애벌레 심실 심장 심실에 형광 모르 폴리 노의. E) 주입 사이의 크기 관계를 보여줍니다. 스케일 바는 100 μm의와 동일.
물고기에 걸쳐 모르 폴리 노의 그림 4. 분산. 의 A) Zebrafish의 삼일 오래된 유충. B) 형광 형광 - 태그 몸 혈관 finfold (FF)을 포함하여 동물에 걸쳐 모르 폴리 노의 (V) 5 분 후 심실 주입. C) 분산을 통해 모르 폴리 노, 뇌 (B) 이전에 . 유충 모르 폴리 노의 주사 유충의 꼬리 지느러미와 트렁크에있는 모든 12 시간 D) 조직 후 :. 척색 (N), 척수 (SC), 색소 (P), 및 finfold (FF) E) 모르 폴리 노 분산몇 분 finfold. F) uninjected 애벌레 몸통과 꼬리 지느러미의 명 시야 이미지 등의 유충 트렁크 조직에 주입 후. 점선은 녹색 (화살촉)에서 형광도를 보여주는 GFP 필터를 이미지 한 미래의 절단 평면. G) Uninjected 핀을 나타냅니다. 형광 구조의 돌기 형상은 이러한 색소 세포 척색, 근육과 척수를 통해 수술 절단 유생의 꼬리 지느러미. H) 브라이트 이미지 것을 제안합니다. I) 그루터기 조직의 모르 폴리 노의 분포를 나타내는 형광 이미지. 근육에 모르 폴리 내장, 척수, 척색과 finfold. J) 야생형 유충의 꼬리 finfold 구조 재생성. 블랙 라인은 정량 분석을위한 재생 조직 재생의. K)의 모르 폴리 노 - 매개 억제를 추적합니다. 블랙 라인 추적은 분명히 감소 재생 재 강조모르 폴리 노의 최저. L)이 uninjected 유충 (J)에서와 유사한 재생 반응을 보여주는 불일치 제어 모르 폴리 노를 주사 유충의 꼬리 finfold을 회생 후 sponse. 스케일 바는 100 μm의와 동일.
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Discussion
뇌 실내 주입은 배아 발생 동안 유전자 기능에 영향을주지 않고 전개 또는 신체 항상성의 나중 단계에서 유전자 기능을 테스트하기위한 신속하고 신뢰성있는 평가 방법을 제공한다. 이 기술의 성공을 보장하기 위해, 하나는 네 가지 중요한 점을 알고 있어야합니다 바늘의 중 1) 바늘 크기, 2) 건조, 3) 양을 최소화하고, 진정 솔루션 4) 최소한의 노출 시간. 너무 큰 바늘 심실 손상과 과다 출혈의 원인이됩니다 동안 너무 작은 바늘은 자주 막히게됩니다. 20 μm의 권장하지만, 바늘 이상 5 분의 1 심실 챔버의 크기 않을 것입니다. 두 번째 중요한 점은 건조하고 막히는 바늘을 유지하는 것입니다. 진정, 전송 및 위치 유충에 바늘과 피할 수없는 자주 일시 정지의 작은 크기는 바늘 끝에서 모르가 건조하고 바늘을 방해 할 수있는 충분한 시간을 제공 할 수 있습니다. 방지하기 위해이것은, 하나의 1X PBS의 페트리 접시에 바늘 젖어있다. 세 번째 중요한 점은 볼륨이 너무 높은 의해 심실의 팽만감을 최소화하는 것입니다. 투약은 바늘의 크기에 의해 제한되는 경우, 주사 수를 증가시키는 것은 항상 부피를 증가시키는 것이 바람직하다 : 큰 볼륨은 심장 스트레치 부상을 초래할 수있다. 네 번째 중요한 점은 진정 작용의 정도입니다. 진정 작용 시간은 절차에 필요한 시간의 길이를 기반으로합니다. 그들은 오히려 강력하고 오히려 쉽게 소생하기 때문에 유충은 진정 솔루션에 남아있을 수있는 몇 분 동안 마취 상태로 유지됩니다. 그러나, 마취에 너무 오래 물고기를 유지하는 것은 그것의 회복을 손상되거나 너무 짧은들을 주입하는 동안 부활하게됩니다. 따라서, 하나는 하나가 4 분 기간 내에 삽입 할 수 유충의 수만큼 마취를해야합니다.
이 현재의 방법 중 하나 제한은 모르가 조직에서 유전자 기능을 대상으로하지 않는다는 것입니다특정 방식. 두 개의 다른 변형은 조직 특이성을 제공 할 수있다 : 하나의 변형은 갇힌 morpholinos와를 사용하는 것이다. 공 초점 현미경 레이저 광에 의해 활성화 한 후,이 morpholinos와 자신의 유전자 표적을 억제하는, 그래서 일정 시간 공 촛점 노출 모르 폴리 노의 활동에 시간과 공간 제어를 제공 할 수 있습니다. 갇힌 morpholinos와는 하나의 세포 배아에 주입 후 초기 개발 단계에서 유전자를 대상으로 사용되어왔다. 단일 셀 단계에서 배달 배아 동안 유전자를 대상으로 작업 할 수 있지만, 모르 폴리 노의 농도는 가능성으로 인해 개발이 애벌레 단계 (13)로 진행됨에 따라 연속적인 세포 분열의 수를 나중에 유생 단계에서 너무 낮은 것입니다. 하나는 한 세포 단계에서 주입 할 수 모르 폴리 노의 양을 13 ~ 15도 독성에 의해 제한됩니다. 두 번째 수정 가능한 직접 크기와 영상을 허용 할 때 연구 할 수있는 기관이나 조직에 모르 폴리 노를 주사하는 것입니다. 제브라 피쉬의 유충은 반투명이기 때문에 보는 달그들이 개발 한 후 내부 장기를 t 것은 문제가되지 않습니다. 형광 - 태그 morpholinos와이 프로토콜에서 작동; 따라서 형광의 모르 폴리 분포 및 조직 특이 지역화를 추적하기 위해 사용될 수있다. 조직 세포로 플루오 레세 태그 모르의 혼입 그래서 다른 변형은 표적 조직에 직접 하부 양에서도 주입하여 내향 포터 시약의 공간 분포를 제한하는 것, 내향 포터 시약의 존재를 필요로한다. 따라서, 공간 해상도는이 기술을 할 수 있어야한다.
조직을 사용하여 개발 후기 단계에서 또는 특정 조직에서의 유전자 기능의 분석을 가능하게 열 충격 또는 타목시펜 - 유도 성 프로모터로 조직 특이 적 프로모터를 조합하여 외래 유전자 발현의 시공간적 통제를 제공 트랜스 제닉 과발현 방법이있다 특정 발기인 16-19. 이 transge을 포함내생 유전자를 outcompete 수있는 제품을 만들 수 있도록 설계 지배적 음 구조의 NIC 식입니다. 형질 전환 유전자는 그것이 유전자로 통합하여 유전자의 내생 함수 (21), (22)을 방해 할 때 기능 획득 효과 (20) 또는 취득 형질 상품의 과도한 발현 수준을 생성 할 때이 넉다운 전략은 오프 - 타겟 효과에 민감하다. morpholinos와는 또한 오프 - 타겟 효과를 생성 할 수 있지만, 하나는보다 쉽게 제어하고 내의 상이한 서열을 표적 체류 안티센스 morpholinos와을 사용하여, 표적 mRNA에 결합하지 않는 유사하지만 약간 변경된 표적 서열과 불일치 제어 morpholinos와을 사용하여 이러한 영향을 제한 할 수있다 같은 mRNA와 다른 모르 폴리 노 농도에게 13-15을 테스트하여. 또한, morpholinos와 생산 및 훨씬 빠르고 저렴 설계 올리고 다른 지배적 인 음성 유전자 변형 라인을 테스트보다 테스트 할 수 있습니다. 따라서 소재morpholinos와의 traventricular 주입은 지배적 인 음성 형질 전환 할 수없는 경우, 개발 이후 단계에서 유전자를 녹다운 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 지배적 인 음성 형질 전환 전략이 가능한 경우 뇌 실내 모르 폴리 노 주입 과잉 발현 지배적 인 음성 유전자의 특이성을 확인하는 다른 방법입니다.
그것은 배아 13 일 15시 유전자 최저 그들을 사용할 때 그들이으로 다른 morpholinos와 사이의 효과적인 농도가 다를 가능성이 높습니다. 이 연구에서 표적 유전자를 들어, 3.5 mM의보다 낮은 투여 량에서의 재생 효과를 관찰되지 않았고, 비특이적 효과가 불일치에서 관찰되지 않았다이 모르 폴리 농도로 제어한다.
뇌 실내 주입은 효능 penet 의해 제한 될 때 실시간으로 전체 동물계의 활성 및 효능을 평가하기 위해 작은 분자의 유통을 허용피부 나 소화 시스템을 통해 또는 사용 가능한 화합물의 양에 의해 배급. 그들이 직접 주사 대상이 될 수 없을 때 finfold 대한 경우와 같이 또한, 조직의 타겟팅을 허용한다. 이 방법은 유충 단계에서 지느러미 재생하는 동안 유전자의 기능을 연구 할 수있는 도구를 제공하지 않습니다 만. 모르가 간충직 세포 및 표피를 포함 유생 finfold에 통합되어 있기 때문에, 또한 상처 치유 또는 피부암의 발생 과정에서 역할을하는 유전자의 역할을 조사하기 위해 적합한 기술을 제공 할 수 있습니다. 함께 엔도 - 포터와 모르 폴리 노의 주입은 수술과 반투명 성인 zebrafish의 줄 의무가 있습니다 사용할 수 있습니다 성인 제브라 피쉬의 장기 나 조직을 대상으로 적용 할 수있다. 또한,이 방법은 제브라 피쉬에 한정되지 않는다; 심 실내 주사에 의한 분산액은 특히 모델이 여전히 유효 열성 유전자의 방법이 부족하다는 같은 다른 척추 동물 모델에서 사용될 수있다또한 재생 연구에 중요한 모델입니다 Xenopus의, Axolotl의와 도롱뇽, 등.
따라서, 제브라 피쉬의 뇌 실내 주입은 시간적으로 여러 조직을 대상으로 비교적 빠른 프로토콜로 유전자 발현을 제어 할 수있는 기능을 제공하며,이 방법의 범용성 기능적 형질 전환 또는 부족한 다른 유기체뿐만 아니라 제브라 트랜스 제닉 라인의 사용을 허용 유전자 녹아웃 전략.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다, 우리는 기술 지원을 Ayele Tsedeke Taddese을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
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