Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

Summary

Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.

Abstract

El pez cebra es un modelo importante para comprender la biología celular y molecular de la regeneración de órganos y apéndice. Sin embargo, las estrategias moleculares para emplear genética inversa todavía no se han desarrollado adecuadamente para evaluar la función del gen en la regeneración o la homeostasis del tejido durante las etapas de larvas de pez cebra después de la embriogénesis, y varios tejidos dentro de la larva de pez cebra son difíciles de orientar. Inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos ofrecen un método alternativo para la incapacidad actual para apuntar genómicamente genes de pez cebra de una manera controlada temporalmente en estas etapas. Este método permite la dispersión completa y la posterior incorporación de la morfolino en varios tejidos de todo el cuerpo, incluyendo estructuras que antes eran imposibles de alcanzar, tales como los de la aleta caudal de larvas, una estructura a menudo utilizado para investigar de forma no invasiva la regeneración de tejidos. Varios genes activados durante la regeneración pliegue de la aleta larval también se Present en la regeneración de tejidos de vertebrados adultos, por lo que la larva es un modelo útil para entender la regeneración en adultos. Este método de dispersión morfolino permite la identificación rápida y fácil de los genes necesarios para la regeneración de los tejidos de las larvas, así como otros fenómenos fisiológicos que regulan la homeostasis del tejido después de la embriogénesis. Por lo tanto, este método de entrega proporciona una estrategia necesaria en la actualidad para el control temporal de la evaluación de la función de genes después de la embriogénesis.

Introduction

La regeneración de órganos y apéndices es de fundamental importancia para la supervivencia y la aptitud; sin embargo, varios vertebrados, incluido el hombre han limitado las capacidades regenerativas. Aunque existen varios modelos animales que tienen una amplia capacidad de regeneración, las técnicas de genética inversa para evaluar la función de genes durante la regeneración de órganos y apéndices siguen siendo muy limitada o inexistente. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques para diseccionar la biología molecular de la regeneración en estos organismos modelo.

El pez cebra es un modelo bien establecido para la comprensión de la biología celular y molecular de la regeneración de órganos y apéndice ^1, no sólo debido a su capacidad significativa para regenerar múltiples órganos, tejidos y apéndices, sino también porque existen varias líneas de peces transgénicos para rastrear las células y para sobreexpresar genes construye ^{2, 3.} Sin embargo, la inhibición de genes en larvas de pez cebra se limita principalmente a la overexpression de las construcciones dominantes negativos, que no están disponibles para todos los genes de interés o cuyo producto transgénico puede adquirir con ganancia de función de los efectos que no reflejan la actividad endógena del gen. Por lo tanto, se necesita un método alternativo para eliminar específicamente la expresión de genes por knockout o knockdown para superar estos problemas.

Específica la orientación de genes usando TALENS existe como un medio de genética inversa para octavos de final la función de genes; Sin embargo, esta estrategia eliminatoria es muy limitado con frecuencia a evaluaciones funcionales durante la embriogénesis temprana, porque los requisitos iniciales del gen impiden la progresión del desarrollo embrionario. Por lo tanto, el estudio de los fenómenos posteriores como la regeneración o la homeostasis de órganos después de desarrollo utilizando TALENS está impedido ^{4, 5.} Por lo tanto, se necesita una estrategia alternativa de eliminación de genes que se dirige a la función de genes después del desarrollo temprano para evaluar los requisitos de genes en los órganos y estructuras completamente formados. Morfolino inyección se ha demostrado ser eficaz en la orientación de los genes en un par de órganos de adultos y el adulto regeneración de aleta ^6-8, pero estos métodos requieren la electroporación y muchos órganos internos son difíciles de electroporar ya sea debido a su ubicación o debido a su sensibilidad a eléctrica interrupción. Por otra parte, algunos tejidos de la larva son difíciles de inyectar directamente, ya que la inyección directa puede alterar su integridad estructural o porque su tamaño es limitante. La aleta caudal de la larva es un tal estructura, debido a la inyección directa en el pliegue de la aleta no es posible. Por lo tanto, se necesita una alternativa a la electroporación y la inyección directa de los genes objetivo en los tejidos que son demasiado pequeña para inyectar o no puede ser a electroporación.

Con el fin de dirigir e inhibir la función de genes específicos durante la regeneración de la aleta caudal de larvas, hemos modificado tecnologías de morfolino existentes permitiendo que el unVALUACIÓN de la función génica durante la regeneración de la aleta caudal en larva-etapas finales. Este método emplea la entrega intraventricular ⁹ de morfolinos fluoresceína etiquetado junto con Endo-Porter transfección reactivo ^10. Una vez en el ventrículo, la mezcla morfolino-Endo-Porter se propaga rápidamente a través de la larva a través de la vasculatura y entra en los tejidos que han sido previamente imposible para apuntar. Este método de inyección puede ser modificado para los genes objetivo en tejidos específicos y muy posiblemente puede ser aplicado en otros modelos animales que actualmente carecen de métodos de genética inversa para inhibir la función del gen. Así, se ofrece un método rápido y fácil con el potencial de uso de gama amplia para estudiar de inmediato la función de genes durante la homeostasis de órganos en general y la regeneración en las etapas larvales.

Protocol

1. Preparación de las agujas de vidrio (Figura 1)

1. Utilice capilares de vidrio con un diámetro de 0,75 mm para preparar agujas de inyección (Figura 1A).
2. Coloque el capilar de vidrio en un extractor de aguja y tire de la aguja con el siguiente parámetro: valor del ciclo de calentamiento: 463; tirando de valor del ciclo: 230; velocidad: 150 mseg; tiempo: 150 ms (Figura 1B).
3. Romper el capilar de vidrio tirado con pinzas de relojero para producir una aguja de 20 m de diámetro bajo un estereoscopio con un ocular micrométrico.
4. Utilice un torno con una rueca de goma mojada para afilar la aguja y producir unas 20 micras de bisel (figuras 1C y 1D). Nota: agudo, agujas biseladas mejorar la facilidad de inserción en el ventrículo y por lo tanto minimizar el daño al tejido y permitir que el músculo perforada para volver a sellar después de la retirada de la aguja (figuras 1E-G).

2. Preparación de la Solución Morpholino

1. Preparar la población de morfolino disolviendo el morfolino liofilizado en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración final de 7,5 mM. [Vea las instrucciones del fabricante para obtener más información (tabla Materiales)].
2. Preparar la solución de inyección morfolino mezclando disolución 2,5 l morfolino acciones (7,5 mM) con 2,8 l solución Endo-Porter de valores (1 mM) (Ver tabla Materiales) para obtener una concentración final de 3,5 mM morfolino y 0,5 mM Endo-Porter.

3. Preparación de la inyección de morfolino (Figura 2)

1. Cargue la aguja de vidrio biselado con 5 l de esta solución utilizando una micropipeta con una punta de pipeta microloader 10 l.
2. Insertar la aguja de vidrio en el soporte de la aguja de la micromanipulador conectada a la bomba neumática Pico (Figuras 2A-C).
3. Coloque el soporte de la aguja al lado del microscopio, de manera que sólo las necesidades de la agujapara moverse en una dirección plana para insertarla en el ventrículo cardíaco de la larva (Figura 2A).
4. Ajuste el ángulo de la inyección en los alrededores de 45 °.
5. Establezca los valores microinyector como sigue: presión de mantenimiento: 20 libras por pulgada cuadrada (psi); presión de expulsión: 15 psi; Alcance de 100 ms de gating, valor del periodo de 1,9 (corresponde a 10,9 ms).
6. Derretir de agarosa en 1x PBS utilizando un horno de microondas estándar para producir 20 ml de un 1,5% (w / v) en gel. Verter en gel fundida en un plato de Petri de 10 cm. Coloque una forma de inyección ranurado en la agarosa caliente para que una vez endurecido, la agarosa tendrá surcos en los que la larva sedado se colocará ¹¹ (Figuras 2D y 2E).

4. Inyecciones (Figura 3)

1. Anestesie larva en 100 ml de agua del acuario con 20 mg / L tricaína (sulfonato L-etil-m-amino-benzoato-metano) hasta que dejan de responder al tacto.
2. Utilice una Pasteur pipetee plásticoe para transferir cuidadosamente la larva sedado en una ranura del molde de agarosa húmeda de modo que el lado ventral se enfrenta contra la pared de agarosa vertical de la ranura (Figura 3A).
3. Coloque la placa de agarosa bajo el microscopio estereoscópico para que el ventrículo está de espaldas a la aguja de inyección (Figura 3A).
4. Baje la aguja para insertarla en el ventrículo del corazón. Inserte la aguja sólo 1-2 micras en el ventrículo teniendo cuidado de no insertar la aguja profundamente (Figuras 3B y 3C).
5. Una vez que se inserta la aguja, se inyecta la solución morfolino al ventrículo con 4-6 pulsos, cada entrega de 3 nl de la solución, con intervalos de espera para permitir la limpieza del corazón (Figuras 3D y 3E).
6. Después de la inyección, retire la aguja (paralelo al plano de la inserción) y, a continuación transferir cuidadosamente la larva usando una pipeta Pasteur de plástico llena de E3 medio BACk en una placa de Petri que contiene medio de E3 fresco.
7. Coloque la aguja en una placa de Petri que contiene PBS 1x para evitar el secado de la aguja cuando la transferencia de la larva inyectado.
8. Repita los pasos 4.1 a 4.6 de cada 12 a 24 horas durante la duración del experimento. Nota: La repetición de las inyecciones asegura la absorción y el mantenimiento de la morfolino en las células.

5. Los análisis de las inyecciones (Figura 4)

1. Anestesiar los peces en 100 ml de agua del acuario con 20 mg / L tricaína hasta que dejan de responder al tacto.
2. Coloque la larva lateralmente en un piso mojado 1,5% (w / v) de agarosa placa de cubierta con medio E3.
3. Larvas de imagen usando un microscopio estereoscópico con campo claro y fluorescencia de imagen. Nota: Como las larvas son transparentes, la fluoresceína morfolino-etiquetado debe ser visible como verde fluorescente en los vasos sanguíneos en todo el animal directamente después de la inyección. Esta fluorescencia se dispersará más en los tejidos vascularizados por15 min (Figuras 4A-4C).

6. Evaluación de Regenerativa excrecencia

1. Evaluar las imágenes capturadas utilizando Fiji Image J software libre (http://fiji.sc/Fiji). Para la investigación de la regeneración, utilice la herramienta de línea de trazado para determinar la cantidad de crecimiento regenerativo que se ha producido en el control y la larva morpholino inyectado.
2. Para calibrar las imágenes, abrir uno de los archivos de imagen originales en Fiji por arrastrar y soltar el archivo en la ventana principal de Fiji.
3. Para definir la escala para todas las siguientes imágenes, vaya a "Analizar" en el menú principal.
4. En el menú desplegable, haga clic en "escala Ajuste".
5. En esta ventana, active la opción "Global" haciendo clic en la casilla de verificación.
6. Ahora abra la imagen para medir la cantidad de crecimiento regenerativo de nuevo por arrastrar y soltar (véase el paso 6.1).
7. Elija la herramienta "selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas.
8. Rodear el área a ser medido (Figuras 4J-4L).
9. Presione Ctrl + M. Esto abrirá una nueva ventana "Resultados" muestra el valor del área cercada en píxeles cuadrados.

Representative Results

La aguja de inyección agudo, biselado se coloca fácilmente en el ventrículo cardíaco de la larva de pez cebra cuando se acercó dorsalmente (Figura 3A). El corazón continúa bombeando y se mantiene el flujo de sangre a pesar de la presencia de la aguja (Figuras 3B y 3C). Inyecciones de cuidado no alteran la morfología del ventrículo o contracciones cardíacas (Figura 3D) a pesar de la inyección de la morfolino en el corazón (Figura 3E).

En cuestión de minutos, la solución morfolino-Endo-Porter distribuye por todo el cuerpo a través de la vasculatura (Figuras 4A y 4B). El morfolino se distribuye entonces desde la vasculatura en diferentes tejidos tales como el pliegue de la aleta y el cerebro durante al menos 12 horas o más como se observa a partir de la fluorescencia (Figura 4C).

En este enfoque, se elimina la punta distal del the pliegue de la aleta, la punta distal de la médula espinal, los músculos del tronco distal, la notocorda distal y células de pigmento (Figuras 4D y 4H); todos los cuales son difíciles de apuntar específicamente por inyección directa debido a la compacidad (músculo), tamaño pequeño (la médula espinal y la notocorda) y la delgadez (pliegue de la aleta), pero parece que incorporar el morfolino después de las inyecciones ventriculares de serie, que es visto por fluorescencia dentro de estos tejidos (Figura 4E) en comparación con los animales no inyectados (figuras 4F y 4G). Por lo tanto, este método promueve de forma relativamente fácil la entrega de morfolino a los tejidos que son difíciles de orientar de forma individual, y permite la evaluación de la función del gen en varios tejidos en la aleta de regeneración a la vez. Para evaluar la importancia de los genes específicos implicados en la regeneración, uno amputa quirúrgicamente parcialmente la aleta caudal de larvas (Figura 4H), resección de todos los tejidos que tienen Incorp corporado el morfolino (Figura 4I). El pliegue de la aleta larval regenera su estructura dentro de unos pocos días después de la amputación (dpa) (Figura 4J). Morpholino focalización   un gen necesario para la regeneración (datos no publicados) resulta en una respuesta de regeneración perturbado (Figura 4K) en comparación con no inyectada (Figura 4J) y controles de morfolino no coincide (Figura 4L). El efecto total de estos experimentos de morfolino en consecuencia regenerativa se puede medir usando herramientas morfométricas estándar en los programas de Fiji públicamente disponibles ¹² mediante el trazado de los tejidos regenerados y la comparación de las áreas (figuras 4J-4L). Por lo tanto, este método de reconocimiento de genes proporciona un ensayo rápido y relativamente fácil para probar la importancia de los genes en el proceso de regeneración.

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Figura 1. Preparación de agujas capilares de vidrio para la inyección. A) tubo capilar de vidrio antes de tirar (arriba) y sacó la aguja (abajo). B) Aguja aparato tirando. C) Torno para biselado y afilar la aguja de vidrio. La aguja se ve a través de los prismáticos. D) El torno es un disco giratorio de goma mojada. La aguja se baja lentamente en el disco. E) de la aguja afilado debe tener un bisel corto que ya no es (20 micras) que es amplia (20 m) para reducir al mínimo el espacio necesario para insertar todo el extremo de la aguja en el cardiaco larvas ventrículo. F) Imagen Mayor aumento que muestra la punta de la aguja. G) ​​Vista esquemática de la punta de la aguja que muestra la forma del bisel después del afilado.

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Aparato de inyección de la figura 2. Creado. A) Equipo completo de inyección de morfolino en larva de pez cebra. B) Soporte para el control de la colocación de la aguja durante la inyección. C) La bomba de pico que regula la presión neumática para preparaciones inyectables. D) prensa Formulario utilizado para crear moldes de agarosa. E) molde de agarosa utilizado para estabilizar larva inyectable.

Figura 3. La inyección de larvas de peces. A) La colocación de la aguja en relación con la larva de pez cebra. B) La inserción en ventrículo cardíaco. C) de la fluorescencia de la morfolino en la aguja, pero ausente en el ventrículo antes de Injectien. D) Imagen de campo claro muestra la relación entre el tamaño de la aguja de vidrio y el ventrículo larvas. E) La inyección de la morfolino fluorescente en el ventrículo del corazón. Las barras de escala son iguales a 100 micras.

Figura 4. Dispersión de morfolino lo largo de los peces. A) El pez cebra 3 días de edad larva. B) de fluorescencia de la fluoresceína-etiquetados morfolino lo largo de la vasculatura del cuerpo (v) publicar ventricular 5 min de la inyección. C) Dispersión de la morfolino en todo el animal, incluyendo pliegue de la aleta (FF), cerebro (b) en los mayores larva después de las inyecciones de morfolino cada 12 horas D) los tejidos de la aleta caudal larval y el tronco:.. notocorda (n), de la médula espinal (sc), pigmento (p) y pliegue de la aleta (ff) E) morfolino Dispersosvarios minutos después de la inyección en los tejidos del tronco larvales incluyendo el pliegue de la aleta de la imagen de campo claro del tronco larval no inyectada y la aleta caudal. F). La línea de puntos indica el plano amputación prospectivo. G) aleta uninjected fotografiado con el filtro GFP muestran autofluorescencia en verde (puntas de flecha). La forma dendrítica de las estructuras fluorescentes sugiere que estos son. H) imagen de campo claro de una aleta caudal larval amputado quirúrgicamente a través de la notocorda, el músculo y la médula espinal células pigmentarias. I) Fluorescente imagen que muestra la distribución morfolino en los tejidos del muñón. Morpholino incorporación en el músculo, médula espinal, notocorda y pliegue de la aleta. J) regenerada estructuras pliegue de la aleta caudal de tipo salvaje larva. Línea de Negro traza los tejidos regenerados para el análisis de la cuantificación. K) inhibición mediada Morpholino de la regeneración. Negro rastreo de línea pone claramente de manifiesto la regeneración re reducidarespuesta después de caída morfolino. L) regenerado pliegue de la aleta caudal de la larva inyecta con una falta de coincidencia morfolino de control que muestra una respuesta similar a la regeneración en la larva no inyectado (J). Las barras de escala son iguales a 100 micras.

Discussion

La inyección intraventricular proporciona un método de evaluación rápida y fiable para probar la función de genes en las etapas posteriores del desarrollo o de la homeostasis del cuerpo sin afectar a la función del gen durante la embriogénesis. Para asegurar el éxito de esta técnica, uno debe ser consciente de los cuatro puntos críticos: 1) Tamaño de la aguja, 2) la desecación de la aguja, 3) reducir al mínimo el volumen, y 4) el tiempo mínimo de exposición en la solución de la sedación. Agujas que son demasiado pequeños se obstruyen con frecuencia, mientras que las agujas que son demasiado grandes pueden dañar el ventrículo y causar un sangrado excesivo. Aunque se recomienda 20 micras, la aguja nunca debe ser más de una quinta parte del tamaño de la cámara ventricular. Un segundo punto importante es mantener la aguja se seque y obstruya. El pequeño tamaño de la aguja y las pausas frecuentes inevitables para sedar, la transferencia y la posición de la larva puede proporcionar el tiempo suficiente para permitir que el morfolino en la punta de la aguja se seque y obstruya la aguja. Para evitaresto, uno puede sumergir la aguja en una placa de Petri de 1x PBS. Un tercer punto crítico es minimizar la hinchazón del ventrículo por demasiado alto de un volumen. Si la dosis está limitada por el tamaño de la aguja, a continuación, aumentar el número de inyecciones es siempre preferible aumentar el volumen: volúmenes más grandes pueden causar lesión por estiramiento para el corazón. Un cuarto punto crítico es el grado de sedación. El tiempo de la sedación se basa en la longitud de tiempo necesario para el procedimiento. Las larvas pueden permanecer en la solución de sedación y permanecerá sedado durante varios minutos, debido a que son más bien robusto y resucitar con bastante facilidad. Sin embargo, el mantenimiento de los peces demasiado tiempo en el anestésico puede afectar a su recuperación o demasiado corto hará que se reviven durante la inyección. Por lo tanto, se debe sedar sólo el número de la larva que se puede inyectar en un plazo de 4 min.

Una limitación de este método actual es que el morfolino no se dirige a la función del gen en un tejido-De manera específica. Dos modificaciones diferentes pueden proporcionar especificidad de tejido: Una modificación es utilizar morfolinos enjaulados. Después de la activación por la luz láser desde un microscopio confocal, estos morfolinos inhiben su objetivo de genes, la exposición confocal de manera oportuna puede proporcionar un control temporal y espacial de la actividad morfolino. Morfolinos enjaulados se han utilizado para dirigir los genes durante el desarrollo temprano después de la inyección en el embrión de una sola célula. Mientras la entrega en la etapa de célula única puede trabajar a sus genes diana durante la embriogénesis, la concentración de la morfolino probable que sea demasiado baja en las etapas de larvas posteriores debido a la cantidad de divisiones celulares sucesivas como el desarrollo progresa a la etapa larval ^13. La cantidad de morfolino se puede inyectar en la fase de una célula también está limitada por la toxicidad ^13-15. Una segunda modificación posible es inyectar directamente una morfolino en el órgano o tejido a ser estudiado cuando el tamaño y la proyección de imagen permiten. La larva de pez cebra es translúcido, de modo de visualización mesest órganos internos después de que se han desarrollado no debería ser un problema. Los morfolinos fluoresceína etiquetados trabajan con este protocolo; Por lo tanto, la fluorescencia se puede utilizar para realizar un seguimiento de la distribución y la localización específica de tejido de la morfolino. La incorporación de la morfolino fluoresceína-etiquetados en las células del tejido requiere de la presencia del reactivo de Endo-Porter, por lo que otra modificación sería limitar la distribución espacial del reactivo de Endo-Porter inyectándola en cantidades más bajas directamente en el tejido diana. Por lo tanto, la resolución espacial debe ser posible con esta técnica.

Hay métodos de sobreexpresión transgénicas que proporcionan para el control temporal y espacial de la expresión de genes exógenos mediante la combinación de promotores específicos de tejido con choque térmico o promotores-tamoxifeno inducible que permite el análisis de la función génica en etapas posteriores de desarrollo o en ciertos tejidos mediante el uso de tejido promotores específicos ^16-19. Esto incluye la transgeNIC expresión de constructos dominantes negativos diseñados para crear un producto que puede outcompete el gen endógeno. Esta estrategia de derribo es susceptible a los efectos fuera de la meta cuando un transgén produce niveles de expresión desproporcionados de un producto transgénico que adquiere efectos ²⁰ o ganancia de función cuando se integra en un gen y altera la función endógena del gen ^{21, 22.} Mientras morfolinos también pueden generar efectos fuera de la meta, se puede controlar más fácilmente y limitar estos efectos mediante el uso de morfolinos control de desajuste con secuencias diana similares pero ligeramente alteradas que no se unen al ARNm diana, mediante el uso de múltiples morfolinos antisentido que se dirigen a diferentes secuencias dentro de la mismo ARNm y probando diferentes concentraciones de morfolino ^13-15. Por otra parte, morfolinos pueden ser producidos y probados mucho más rápido y más barato que el diseño, la elevación y probar diferentes líneas transgénicas dominante-negativo. Por lo tanto, la dela inyección intraventricular de morfolinos proporciona una herramienta útil para derribar los genes en las etapas posteriores del desarrollo, cuando la transgénesis dominante negativo no es posible. Cuando una estrategia transgénica dominante negativo es posible, la inyección intraventricular morfolino es un enfoque alternativo para confirmar la especificidad del transgén dominante negativo sobreexpresada.

Es probable que las concentraciones eficaces entre diferentes morfolinos variarán, como lo hacen cuando se utilicen para la caída de genes durante la embriogénesis ^{13, 15.} Para el gen objetivo en este estudio, no se observó un efecto en la regeneración a dosis inferiores a 3,5 mM, y los efectos no específicos no se observaron en desajuste controla con esta concentración morfolino.

La inyección intraventricular permite la distribución de pequeñas moléculas para evaluar la actividad y la eficacia en un sistema animal completo en tiempo real cuando la eficacia está limitada por Penetracionar a través de la piel o el sistema digestivo o por las cantidades de producto disponibles. También permite la focalización de los tejidos cuando no pueden ser objetivo de inyecciones directas, como es el caso para el pliegue de la aleta. Este método no sólo proporciona una herramienta para estudiar la función de genes durante la regeneración de la aleta en las fases larvarias. Desde el morfolino integra en el pliegue de la aleta de larvas que comprende células mesenquimales y la epidermis, también podría proporcionar una técnica adecuada para investigar el papel de los genes que juegan parte en el proceso de cicatrización de heridas o la aparición de cáncer de piel. La inyección de morfolino junto con Endo-Porter también se puede aplicar a los órganos objetivo o tejidos en adultos de pez cebra, que son susceptibles de cirugía y líneas de pez cebra adultos translúcidos están disponibles. Además, este método no se limita al pez cebra; dispersión por la inyección intraventricular se puede utilizar en otros modelos de vertebrados, así, especialmente aquellos modelos que todavía carecen de métodos de genes recesivos eficacestales como Xenopus, Axolotl, el tritón, que también son modelos importantes para estudios de regeneración.

Por lo tanto, la inyección intraventricular en el pez cebra ofrece la capacidad de controlar temporalmente la expresión de genes con un protocolo relativamente rápida para apuntar múltiples tejidos, y la versatilidad de este método permite su uso con líneas transgénicas de pez cebra, así como para otros organismos que carecen de la transgénesis funcional o estrategias knockout de genes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections