Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام doi: 10.3791/51601 Published: September 9, 2014

Summary

لمواجهة نشر الممرض، الخلايا المضيفة إعادة تنظيم الهيكل الخلوي لتجزئة البكتيريا وحمل الالتهام الذاتي. يتم تحديد العدوى عن طريق الشيجلا الخلايا زراعة الأنسجة، المضيف والمحددات الكامنة وراء هذه العملية الممرض وتتميز. باستخدام نماذج الزرد العدوى الشيجلا، يتم التحقيق في دور الجزيئات والآليات التي اكتشفت في الجسم الحي.

Abstract

الشيغيلة الفلكسنرية هو الممرض داخل الخلايا التي يمكن الهروب من phagosomes للوصول إلى العصارة الخلوية، وبلمرة الأكتين المضيف الهيكل الخلوي لتعزيز حركية ونشره. وقد أظهرت عمل جديد أن البروتينات المشاركة في الحركة القائم على الأكتين ترتبط أيضا إلى الالتهام الذاتي، عملية تحلل الخلايا حاسمة لخلية مناعة ذاتية الحكم. لافت للنظر، قد الخلايا المضيفة منع الحركة القائم على الأكتين من S. الفلكسنرية بواسطة compartmentalizing البكتيريا داخل "أقفاص septin" واستهداف لهم الالتهام الذاتي. هذه الملاحظات تشير إلى أن فهم أكثر اكتمالا من septins، وهي عائلة من البروتينات ملزمة GTP الخيطية، سوف توفر رؤى جديدة في عملية الالتهام الذاتي. ويصف هذا التقرير بروتوكولات لمراقبة التفاعلات الالتهام الذاتي، الهيكل الخلوي الناجم عن S. الفلكسنرية في المختبر باستخدام خلايا زراعة الأنسجة في الجسم الحي واستخدام اليرقات الزرد. هذه البروتوكولات تمكن التحقيق من الخلايا mechanisالسيدة التي تتحكم في نشر البكتيريا على مستوى الحي الجزيئية الخلوية، وكله.

Introduction

الفلكسنرية الشيجلا، بكتيريا سلبية الغرام ممرض للأمعاء الغازية، ويمكن الهروب من phagosomes إلى العصارة الخلوية، وتتبلمر المضيف الأكتين الهيكل الخلوي للتهرب من الاستجابات المناعية عصاري خلوي وتعزيز الحركة البينية بين الخلايا و1،2. على الرغم من فهم الحركة القائم على الأكتين في المختبر 3،4، آليات تقييد نشر البكتيريا في الجسم الحي لم يعرف تماما. هذا أمر بالغ الأهمية من أجل فهم أكثر اكتمالا من المناعة الفطرية والدفاع المضيف.

Septins، عائلة الحفظ جدا من البروتينات بين metazoans، هم ثلاثي فسفات (GTP) -binding البروتينات التي تجمع في المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات وتشكل خيوط غير القطبية التي ترتبط بها مع الأغشية الخلوية والهيكل الخلوي 5،6. وقد اكتشف مؤخرا أن عمل الخلايا المضيفة المصابة يمكن أن يمنع الشيجلا الأكتين الحركة القائمة على compartmentalizing بواسطة البكتيريا التي تستهدف autophAGY داخل "أقفاص septin"، وكشف عن آلية الخلوية الأولى التي يصد الأكتين الحركة القائمة على 7،8. حقل مفتوح على مصراعيه للتحقيق يكمن الآن في "البيولوجيا septin والعدوى. التجمع Septin، الناجمة عن مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض (مثل الليستريا المستوحدة 7،9،10، المتفطرة البحرية 7،8، المبيضات البيض 11)، قد تظهر كقضية أساسية في دفاع المضيف 5،12.

الالتهام الذاتي، وهي عملية تدهور الخلايا الحفظ جدا، ويعتبر عنصرا أساسيا في مناعة خلايا مستقلة بسبب قدرتها على تقديم البكتيريا عصاري خلوي إلى يحلول 13،14. ومع ذلك، فإن دور الالتهام الذاتي البكتيريا في الجسم الحي لتقييد أو تشجيع تكرار البكتيرية لا تزال غير مفهومة 15،16. برزت الزرد (دانيو rerio) كنموذج الفقارية لدراسة التهابات لأنه يمكن الوصول بصريافي مراحل اليرقات عندما يكون نظام المناعة الفطري هو بالفعل ظيفية 17،18. وقد تميزت الأعمال الأخيرة حساسية اليرقات الزرد إلى S. الفلكسنرية، نموذجا لالالتهام الذاتي البكتيرية 15، واستخدمت الشيجلا نموذج عدوى -zebrafish لدراسة التلاعب الالتهام الذاتي لعلاج مضاد للجراثيم في الجسم الحي 19.

يقدم هذا التقرير أدوات والمقايسات لدراسة S. جديدة التفاعلات الفلكسنرية مع الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي. في خطوة أولى، وبروتوكولات لرصد وصفها التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي باستخدام عدوى الشغيلة من خط الخلايا الظهارية البشرية هيلا. لتقييم دور التفاعلات الالتهام الذاتي، الهيكل الخلوي على عملية العدوى الشغيلة في المختبر، وأساليب للتلاعب الالتهام الذاتي ومكونات الهيكل الخلوي (باستخدام الكواشف سيرنا أو الدوائية) وتقدم. وقد أظهرت عمل جديد باستخدام الشيجلا العدوى ساليرقات الزرد جمعة، فحوصات مماثلة يمكن تطبيقها على دراسة بيولوجيا الخلية من عدوى في الجسم الحي. بروتوكولات لإعداد وتصيب اليرقات الزرد مفصلة، ​​وتقييم استجابة المضيف للإصابة الشغيلة في الجسم الحي والبروتوكولات لتحديد بقاء وتقدم المضيف وعبء البكتيرية اليرقات المصابة. طرق لرصد تجنيد septin والالتهام الذاتي علامات لالشيجلا (باستخدام إما ثابتة أو يعيشون اليرقات الزرد) وطرق لاختبار دور هذه العمليات في الجسم الحي [أليغنوكليوتيد] باستخدام morpholino (1-4 حقن في الأجنة مرحلة الخلية) أو الكواشف الدوائية ( وأضاف مباشرة إلى ماء الحمام الزرد)] وتناقش أيضا. ومن المتوقع هذا البرنامج من العمل لتوفير نظرة ثاقبة الآليات المطلوبة للسيطرة على العدوى عن طريق استجابات المضيف عصاري خلوي.

Protocol

1. رصد الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي في المختبر باستخدام خلايا الأنسجة الثقافة

  1. إعداد S. الفلكسنرية
    1. لوحة S. الفلكسنرية M90T (البرية من نوع) من -80 ° C الأسهم الجلسرين على الكونغو والأحمر زيتية الكازين الصويا (TCS) لوحة آغار. احتضان ليلا 37 درجة مئوية. نفس لوحة يمكن استخدامها لعدة تجارب.
    2. اختيار مستعمرة الفردية وتنمو في 8 مل سائل الإعلام TCS في شاكر ليلا 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الكونغو الحمراء ملزمة تشير إلى أن البلازميد الفوعة تم الاحتفاظ بها.
    3. إلى ثقافة فرعية للنمو البكتيريا الأسي، تطعيم TCS جديدة مع ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في 1/80 تخفيف وتنمو في شاكر في 37 درجة مئوية إلى OD 600 = 0.3-0.6.
    4. تدور ثقافة فرعية البكتيرية في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق. غسل بيليه مع MEM والطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. إعادة تشكيل بيليه في MEM إلى OD 600 = 0.3-0.6.
  2. إعداد هيلا سيLLS للعدوى
    1. تنمو خلايا هيلا في "المتوسطة كاملة"، أي.، MEM بالإضافة إلى L-ألانيل-L-الجلوتامين تستكمل مع 1 ملي البيروفات الصوديوم، 0.1 ملي حل غير الاساسيين من الأحماض الأمينية، و 10٪ مصل العجل الجنين.
    2. لوحة 1-1.5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا 24 أو 48 ساعة قبل بدء التجربة. لوحة على الزجاج coverslips في 6 لوحات جيدا للفحص المجهري، أو لوحة على 35 ملم أطباق الزجاج السفلي للتحضير لتصوير حي.
      ملاحظة: (على سبيل المثال، ذيول أكتين، أقفاص septin) لمتابعة الالتهام الذاتي (على سبيل المثال، ATG8 / LC3 + ف] autophagosomes) والهيكل الخلوي ديناميكية في الوقت الحقيقي خلال العدوى الشيجلا باستخدام التصوير الحية، وخلايا زراعة الأنسجة يمكن عابر باستخدام GFP-، RFP- أو يبني CFP الموسومة (انظر مناقشة).
  3. العدوى
    1. تصيب الخلايا مع 100: 1 تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من الشغيلة (OD 600 = 0،3-0،6) المخفف في MEM. إضافة مباشرة إلى خلايا هيلا مطلي في 6 ثلوحات الذراع 24 - 48 ساعة قبل العدوى (كما هو موضح في القسم 1.2) في 2 مل MEM (المصل جوعا).
    2. لتحقيق أقصى قدر من الالتزام البكتيرية لاستضافة الخلايا والبكتيريا والخلايا الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 والسماح العدوى للمتابعة.
    3. غسل الخلايا المصابة مرتين مع MEM الطازجة واحتضان مع الجنتاميسين تحتوي المتوسطة كاملة (50 ميكروغرام / مل، للقضاء على البكتيريا خارج الخلية) ل1-4 ساعة اعتمادا على التجربة.
  4. تحديد ووسم خلايا هيلا المصابة للفحص المجهري
    1. غسل الخلايا المصابة مرتين مع 1X PBS، وإصلاح ل15min في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. لإزالة امتصاص العرق، خلايا غسل 2X مع 1X PBS.
    2. احتضان خلايا ثابتة في كلوريد الأمونيوم 50 ملم لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X، وpermeabilize الخلايا لمدة 4 دقائق مع 0.1٪ أكسيد الإثيلين octylphenol المكثفات في غرفة رemperature.
      ملاحظة: بدائل octylphenol أكسيد الإثيلين المكثفات لpermeabilization، مثل سابونين أو الميثانول، ويمكن تطبيقها للحفاظ مختلف الهياكل الخلوية 20.
    3. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان في غرفة رطبة مع الأجسام المضادة الأولية ضد الالتهام الذاتي مكونات أساسية (مثل P62 / SQSTM1) أو الهيكل الخلوي septin (يتم التعبير عن SEPT2، SEPT6، SEPT7، SEPT9، وSEPT11 في خلايا هيلا) لمدة 30 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة) ليلة وضحاها (في 4 درجة مئوية).
    4. غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS واحتضان في غرفة رطبة مع الأجسام المضادة الثانوية، وتسمية الأكتين الخيطية (F-الأكتين) مع phalloidin، لمدة 30 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة) ليلة وضحاها (في 4 درجة مئوية). لتلطيخ نواة الخلية المضيفة إضافة 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي).
    5. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X وتركيب الزجاج coverslips على الشرائح باستخدام تصاعد المتوسطة.
  5. التصوير المجهري للخلايا هيلا المصابة
    1. لصورة المشعخلايا ECTED تستخدم لepifluorescence أو متحد البؤر المجهر وهدف 63X أو 100X لتحديد دابي المسمى الشيجلا.
      ملاحظة: كما هو مبين في الأشكال 1A - 1C، أقفاص septin يمكن تصور وخاتم مثل الهياكل، ~ 0.6 ميكرون في القطر، والبكتيريا المحيطة بها عصاري خلوي بلمرة الأكتين وتجنيد علامات الالتهام الذاتي (على سبيل المثال، P62 وLC3) 7،8. على النقيض من ذلك، لن يتم مجزأة البكتيريا البلمرة ذيول أكتين بواسطة أقفاص septin ولن تستهدف 7،8 الالتهام الذاتي.
    2. باستخدام المجهر epifluorescence أو متحد البؤر والهدف 63X أو 100X، تحديد عدد من البكتيريا داخل الخلايا في الحقل المجهري. أيضا تحديد عدد البكتيريا شرك في أقفاص septin وتستهدف الالتهام الذاتي، أو البلمرة ذيول أكتين والهروب الالتهام الذاتي.
    3. لتحديد نسبة البكتيريا شرك في أقفاص septin أو البلمرة ذيول الأكتين، اتخاذ سلسلة صورة Z-كومة من infeالمديرية التنفيذية الخلايا، وعملية الصور والعد 500-1،000 على الأقل من البكتيريا في التجربة لا يقل عن 3 تجارب مستقلة.

2. التحليل الوظيفي الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي في المختبر

ملاحظة: كل الوراثية والنهج الدوائية يمكن استخدامها لالتشويش الالتهام الذاتي في الخلايا زراعة الأنسجة المصابة، وأثر هذه العلاجات على مسار العدوى يمكن رصدها.

  1. بوساطة سيرنا إسكات
    1. لوحة 0.8 × 10 5 خلايا هيلا على coverslips الزجاج في 6 لوحات جيدا في المتوسط ​​كاملة.
    2. بالنقل في اليوم التالي باستخدام كاشف ترنسفكأيشن القائم على الدهون مع سيرنا ضد الالتهام الذاتي و / أو علامات الهيكل الخلوي.
    3. بعد فترة المرجوة من الحضانة، تصيب الخلايا مع الشغيلة كما هو موضح في القسم 1.3.
    4. إصلاح وتسمية الخلايا كما هو موضح في القسم 1.4.
  2. التلاعب الدوائية
    على سبيل المثال، ليزيل البلمرة استخدام الهيكل الخلوي الأكتين مثبط حركة الخلايا D أو latrunculin B، ليزيل البلمرة ميكروتثبول استخدام نوكودازول، لمنع النشاط أكتوميوزين استخدام blebbistatin، أو لتعطيل استخدام septin التجمع forchlorfeneuron. الالتهام الذاتي يمكن حفز باستخدام rapamycin أو مسدودة باستخدام bafilomycin.
    1. لمعالجة الهيكل الخلوي خلال العدوى الشغيلة، أولا تصيب الخلايا مع الشغيلة كما هو موضح في القسم 1.3 وإتاحة الوقت الكافي للبكتيريا لدخول الخلايا والهروب من يبلوع إلى العصارة الخلوية (على سبيل المثال،> 1.5 عدوى آخر ساعة).
    2. تمييع المخدرات من محلول المخزون [محلول المخزون معلقة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس])] في MEM إلى تركيز النهائي من 5 M (مثبط حركة الخلايا D، B latrunculin، نوكودازول)، 20 M (forchlorfeneuron) أو 50 M (blebbistatin)، و علاج خلايا 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المبلغ الإجمالي للعقار (حجم DMSO / دخليط البساط) وأضاف في لوحة / قارورة من الخلايا هي 1-5 ميكرولتر (اعتمادا على محلول المخزون) في 2 مل من وسائل الإعلام. علاج الخلايا مع جرعة مماثلة من DMSO مخففة في MEM كعنصر تحكم السلبية.
    3. إصلاح وتسمية الخلايا كما هو موضح في القسم 1.4.
      ملاحظة: للحصول على التلاعب في تدفق ذاتية البلعمة (في الخلايا المصابة أو غير مصاب)، تمديد العلاج من تعاطي المخدرات باستخدام rapamycin (20 نانومتر) أو bafilomycin (160 نانومتر) 4-12 ساعة.
  3. البقعة الغربية
    ملاحظة: النشاط ذاتية البلعمة يمكن كميا عن طريق قياس مستوى البروتين من علامات الالتهام الذاتي مثل P62 وLC3.
    1. بعد فترة المرجوة من الحضانة، وجمع وليز الخلايا لimmunoblotting. مستخلصات البروتين في 8 أو 10 أو 14٪ والمواد الهلامية الأكريلاميد تشغيل.
    2. تدفق ذاتية البلعمة، مثال. معدل الالتهام الذاتي، يمكن تحليلها كما هو موضح في 21،22.
  4. التصوير المجهري والكمي
    1. باستخدام المجهر epifluorescence أو متحد البؤر وكائن 100X 63X أوإيف، وتأثير سيرنا أو العلاج من تعاطي المخدرات على العدوى الشيجلا يمكن تقييمها بواسطة المجهر الكمي (أي عد من autophagosomes، أقفاص septin وذيول أكتين) كما هو موضح في القسم 1.5 ويظهر في أرقام 2A و 2B.

3. في فيفو التصوير من S. الفلكسنرية التفاعلات مع الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي

ملاحظة: نموذج الزرد العدوى الشيجلا يمكن استخدامها لتحقيق الحبس septin والالتهام الذاتي في الجسم الحي 19.

  1. إعداد S. الفلكسنرية
    1. ثقافة S. الفلكسنرية كما هو موضح في القسم 1.1.
    2. في OD 600 = 0.3-0.6، وتدور 8 مل ثقافة فرعية البكتيرية في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. غسل بيليه مع 1X PBS والطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    3. Resuspend وبيليه في 80 ميكرولتر من 0.1٪ الفينول الأحمر 1X PBS للحصول على ~ 2،000 البكتيريا / NL. الحفاظ على جرثومةإعداد يريال على الجليد لإبطاء النمو.
      ملاحظة: سيتم إضافة الفينول الأحمر يساعد على تصور عند حقن اللقاح في اليرقات.
  2. إعداد يرقات اسماك الزرد للحقن
    ملاحظة: الزرد وضعت والبيض ويتم تحديدها والأجنة حتى الإخصاب آخر 72 ساعة، وعندما يطلق عليهم اليرقات.
    1. تولد الزرد الكبار كما هو موضح في Westerfield 23 عن طريق وضع 4 ذكور و 8 إناث (عادة نسبة 2: 1) داخل حوض للأسماك منفصل مع الجزء السفلي مغطاة الرخام (التي من شأنها منع البالغين من أكل البيض ولدت). بدلا من ذلك، وضع سلال جمع البيض داخل الدبابات تربية في الليلة السابقة.
      ملاحظة: يتم إخصاب البيض ~ 30 دقيقة بعد أضواء على المضي قدما في منشأة الزرد 23، وينبغي جمعها في أسرع وقت ممكن لمنع نمو العفن. سلال جمع البيض تعمل على جمع البيض بحيث يمكن حصادها بسهولة وأيضا حماية البيض من البالغين.
    2. جمع الجنينق وتنظيفها عن طريق الغسيل في وسائل الإعلام الجنين (E2) مع 0.003٪ التبييض لمدة 10 دقيقة. إزالة E2 مع التبييض، وغسل الأجنة 5X في E2 المتوسطة، وتنمو الأجنة في 10 سم طبق بتري (100 الأجنة / 50 مل E2 المتوسطة) عند 28 درجة مئوية.
    3. إذا كان سيتم استخدام الأجنة أو اليرقات للدراسات المجهري، في الإخصاب آخر 24 ساعة إضافة 0.003٪ N-الفنيل إلى المتوسطة E2 لمنع التصبغ. الحفاظ على الأجنة عند 28 درجة مئوية للتنمية العادية.
      ملاحظة: يرقات اسماك الزرد جاهزة للإخصاب العدوى في آخر 72 ساعة.
    4. لإجراءات العدوى والمجهري، تخدير اليرقات الزرد في 200 غرام / مل تريكين في E2.
  3. إعداد يرقات اسماك الزرد عن الوريد والعدوى المحلي
    ملاحظة: لتقييم بقاء الزرد خلال العدوى الشيجلا، نفذ الحقن في الوريد الذيلية. لتصور تجنيد septin والالتهام الذاتي علامات لالشيجلا، نفذ العدوى في مواقع محلية مثل العضلات الذيل.
    1. لحقن الوريد الذيلية، ضع اليرقات تخدير أفقيا مع الجانب الظهري التي تواجه الإبرة. كما هو مبين في الشكل 3A، ضع طرف الإبرة قريبة (الخلفي) لافتتاح البولي التناسلي، وتهدف لالوريد الذيلية، ويخترق الجلد وتسليم جرعة البكتيرية المطلوب (حجم حقن NL 1-5).
      ملاحظة: التهاب الوريد يمثل تحديا لأداء وسوف يستغرق عدة أسابيع من التدريب للحصول على راحة مع هذا الإجراء. وحقن الفينول الأحمر (بدون البكتيريا) للتدريب تساعد على تقييم موقع الحقن بشكل صحيح.
      ملاحظة: في حالة الشغيلة، وقد أظهرت التجارب الجرعة التي تعتمد عدوى جرعة منخفضة (<1،000 كفو) يتم مسح خلال 48 ساعة، وعدوى جرعة عالية (> 4،000 كفو) يؤدي إلى استضافة وفيات خلال 48 ساعة 19.
    2. من التهاب في عضلة الذيل، ضع اليرقات تخدير كما هو موضح في القسم 3.3.1. كما هو مبين في الشكل 3A، ضع متأن إبرةذ على somites العضلات (أي قطاعات من العضلات والهيكل العظمي) وحقن كمية صغيرة (أي، 1 NL) من إعداد البكتيريا.
  4. حقن في الوريد من البكتيريا في اليرقات
    1. سحب microcapillaries الزجاج البورسليكات كما هو موضح في 24.
    2. ربط الإبرة إلى صاحب الخشنة ثلاثي الأبعاد تتلاعب اليدوي وكسر طرف الإبرة مع ملاقط غرامة.
    3. لتحميل الإبرة، وضع قطرة من ثقافة البكتيرية على ساترة. التبديل على microinjector واسطوانة غاز، قليلا غمر طرف الإبرة في قطرة، وتملأ الإبرة مع المبلغ المطلوب من إعداد البكتيريا.
    4. لمعايرة حجم الحقن، ضع قطرة من الزيت المعدني على زلة غطاء وحقن إعداد البكتيريا. قياس قطرها من الانخفاض باستخدام ميكرومتر وحساب حجم حقن [V = (4/3) πr 3].
      ملاحظة: استخدام إعدادات حقن 40 رطل و 50 ميللي ثانية مع البكترياإعداد آل النحو الموضح في القسم 3.1 سيعطي ~ 2،000 كفو / NL.
    5. إعداد لوحة الحقن باستخدام قالب من البلاستيك كما هو موضح في Westerfield 23.
    6. نقل اليرقات إلى لوحة الحقن وخط لهم باستخدام الفرشاة الجميلة. توجيه وحقن يرقات كما هو موضح في القسم 3.3.1.
    7. لتقييم بقاء الزرد، ونقل المصابة يرقات بشكل فردي في 24 لوحات جيدا في 1 مل من E2 / جيد واحتضان عند 28 درجة مئوية. مراقبة اليرقات المصابة يوميا لمدة 2-5 أيام المقبلة والبقاء مؤامرة على مر الزمن (الشكل 3B).
  5. يرقات اسماك الزرد الطلاء الجرثومي الكمي ل
    ملاحظة: العمل تحت غطاء العقيمة لتجنب التلوث.
    1. لتقييم عدد من البكتيريا تحقن الأسماك (في وقت آخر 0 ساعة العدوى) والكمي البكتيريا في نقاط زمنية المطلوب، تضحية اليرقات الزرد مع جرعة زائدة من تريكين (200-500 ملغم / لتر). وضع اليرقات الفردية في 1.5 مل بولypropylene أنبوب microcentrifuge مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ octylphenol أكسيد الإثيلين المكثفات 1X PBS والتجانس ميكانيكيا باستخدام مدقة.
      ملاحظة: لتأكيد الحمل البكتيري في حجم حقن، ضخ جرعة متساوية إلى قطرة معقمة 1X PBS وصفيحة بها.
    2. جعل التخفيف المتسلسل لليرقات الزرد الخليط في الماء المعقم وطبق على مرق استذابة (LB) لوحات أجار. اليرقات يمكن مطلي بدلا من ذلك على لوحات الكونغو الأحمر TCS للتمييز بين الشغيلة بعد أن حافظت البلازميد خبيث أم لا.
      ملاحظة: لوحة 3 أو أكثر من الأسماك غير مصاب كوسيلة لمراقبة للتحقق من حالة من اليرقات الزرد تستخدم لإصابة.
    3. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها لوحات عند 37 درجة مئوية، عد المستعمرات البكتيرية. كما هو مبين في الشكل 3C، تمثل باستخدام مقياس السجل.
      ملاحظة: يمكن أيضا تحميل الجرثومي أثناء إصابة اليرقات الزرد يمكن تصور باستخدام fluorescently المسمى الشغيلة وأنا المجهريmaging كما هو موضح في القسم 3.7 أو 3.8 (الشكل 3D).
  6. الزرد اليرقات المناعية
    1. في نقاط الوقت المطلوب، تضحية اليرقات باستخدام جرعة زائدة من تريكين. جمع الأسماك في 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين ميكروسنتريفوج (10 إلى 20 يرقة / أنبوب).
    2. إصلاح اليرقات باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ مع 0.4٪ octylphenol أكسيد الإثيلين المكثفات في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان في المحرض المداري (لتجنب تجميع اليرقات) لمدة 2 ساعة (في درجة حرارة الغرفة) أو بين عشية وضحاها (في 4 درجة مئوية).
      ملاحظة: الكترون المجهري يمكن أن تستخدم في التحليلات التركيبية اليرقات الزرد المصابة. في هذه الحالة، تخدير الأجنة ينبغي أن تكون ثابتة وتجهيزها وفقا لMostowy وآخرون 19.
    3. غسل 3X في برنامج تلفزيوني 1X 0.4٪ octylphenol أكسيد الإثيلين المكثفات لمدة 5 دقائق، ثم منع في عرقلة الحل (10٪ مصل العجل الجنين، 1٪ DMSO، 0.1٪ polyoxyethylenesorbitan monolaurate في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. ديالعود الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل. إضافة إلى يرقات المخفف الأجسام المضادة الأولية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في المحرض المداري. استخدام الأجسام المضادة الأولية كما هو موضح أعلاه في القسم 1.4.3.
    5. غسل 4X اليرقات لمدة 15 دقيقة في 0.1٪ polyoxyethylenesorbitan monolaurate برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة.
    6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل. إضافة إلى يرقات المخفف الضد الثانوية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في المحرض المداري. استخدام نفس الأجسام المضادة الثانوية وphalloidin كما هو موضح في القسم 1.4.4.
    7. غسل 4X لمدة 15 دقيقة في 0.1٪ monolaurate polyoxyethylenesorbitan برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. لتلطيخ نواة الخلية المضيفة إضافة دابي (150 نانومتر تركيز النهائي) خلال أول هذه 15 دقيقة يغسل.
    8. للحفاظ على اليرقات fluorescently المسمى، احتضان لهم تدريجيا في التدرج الجلسرين من 15، 30، 60، و 80٪ المخفف في برنامج تلفزيوني 1X و 0.1٪ polyoxyethylenesorbitan monolaurate لمدة 2 ساعة (في غرفة المزاجature) ليلة وضحاها (في 4 درجة مئوية).
      ملاحظة: ملون اليرقات يمكن تخزينها لفترات طويلة من الزمن في الجلسرين 80٪ في 4 درجات مئوية (على سبيل المثال، 4 أشهر).
  7. التصوير المجهري لليرقات اسماك الزرد الثابتة
    1. نقل الجلسرين الثابتة اليرقات جزءا لا يتجزأ من لقطرة صغيرة من الجلسرين 80٪ في 35 ملم طبق بتري (لstereomicroscopy) أو كوب كامل الطبق السفلي (لmiscopy مبائر).
    2. اتخاذ Z كومة صورة سلسلة من اليرقات المصابة ومعالجة الصور حسب المطلوب.
    3. استخدام epifluorescence أو متحد البؤر المجهر وهدف 10X 20X أو للتصوير الحي كله. ثم استخدام المجهر متحد البؤر والهدف 40X، 63X، أو 100X لتصور الخلايا الفردية وتجنيد الالتهام الذاتي وعلامات الهيكل الخلوي للبكتيريا الفردية في الجسم الحي 19 (الأرقام 4A و 4B).
      ملاحظة: أصب الأسماك في عضلة الذيل والجلسرين شقة في جبل على طول الجزء السفلي من الطبق السفلي من الزجاج لتمكين عصامالتركيز سي.
  8. يعيش مجهرية التصوير من يرقات اسماك الزرد المصابة
    ملاحظة: يرقات يمكن الوصول إليها بصريا، وبالتالي في الجسم الحي autophagosomes يمكن تصور باستخدام GFP-LC3 خط المعدلة وراثيا الزرد 25. تصيب اليرقات الزرد كما هو موضح في القسم 3.3 وجبل كما هو موضح في هذا القسم.
    1. إعداد منخفضة ذوبان 1٪ الاغاروز (LMA) في E2 والسماح لتبرد إلى 35-37 درجة مئوية لتجنب الضرر اليرقات / القتل. توزيع قطرات من LMA في 35 مم طبق بتري (لstereomicroscopy) أو كوب كامل الطبق السفلي (للفحص المجهري متحد البؤر).
    2. نقل تخدير الزرد اليرقات بشكل فردي (مع القليل من الماء قدر الإمكان) إلى LMA قطرات. اليرقات توجيه إلى الموضع المطلوب باستخدام فرشاة الرسام وانتظر الاغاروز ليصلب.
    3. تغطي السطح كله الطبق مع LMA، وتراكب مع E2 تحتوي على 200 ميكروغرام / مل تريكين لتجنب إعداد من الجفاف والسماح الأسماك لتبادل الأوكسجين من الماء.
    4. استخدام epifluorescence أو متحد البؤر المجهر وهدف 10X 20X أو لتصوير اليرقات الزرد بأكملها. استخدام المجهر متحد البؤر والهدف 40X، 63X، أو 100X لتصور authopagosomes بكتيريا (أي GFP-LC3 + لقد فجوات المحيطة الشيجلا) في الجسم الحي.
    5. اتخاذ Z-كومة من اليرقات المصابة مع مرور الوقت (على سبيل المثال، كل 2 دقيقة على مدى عدة ساعة) لتصور autophagosomes، وديناميتها، في الوقت الحقيقي.

4. التحليل الوظيفي الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي في فيفو

ملاحظة: تأثير الاضطرابات الوراثية الدوائية والالتهام الذاتي على مسار العدوى يمكن رصدها على مستوى كامل الحيوان، وعلى مستوى الخلية واحدة.

  1. الالتهام الذاتي التلاعب من قبل Morpholino حقن
    1. إعادة أليغنوكليوتيد] morpholino في الماء المعقم إلى حل المخزون من 1 ملم من ارتفاع درجات الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. مخزنفي درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب إجراء الحقن morpholino قليل النوكليوتيد 1-4 أجنة في مرحلة الخلية.
    2. إعداد morpholino حل العمل مع قليل النوكليوتيد معقم 0.1٪ الفينول الأحمر في الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco ل. تحميل الإبرة كما هو موضح في القسم 3.4.2.، يمكن معايرة morpholino حجم الحقن قليل النوكليوتيد كما هو موضح في القسم 3.4.3.
      ملاحظة: سوف الفينول الأحمر تساعد على تصور حجم حقن.
    3. إعداد غرفة الجنين لتحديد المواقع (أي.، شريحة المجهر لصقها مع فورية الغراء على 10 سم غطاء طبق بتري مع حواف التي تواجه إبرة إزالة جزئيا). 1-4 نقل الأجنة مرحلة الخلية إلى غرفة مع كمية صغيرة من الماء ومواءمتها مع الفرشاة الجميلة.
    4. تخترق المشيمه وصفار بسلاسة. مرة واحدة داخل، اضغط على دواسة لحقن حجم المطلوب من حل morpholino قليل النوكليوتيد.
      ملاحظة: تصغير حجم الحقن ل0،5-2 NL. كميات أعلى ثان 5 NL قد يسبب تشوهات في النمو وزيادة معدلات وفيات البيض.
    5. بعد حقن مكروي والأجنة النظيفة (التي تبيض كما هو موضح في القسم 3.2)، واحتضان لهم في طبق بتري مع E2 عند 28 درجة مئوية.
    6. إصابة 72 ساعة السيطرة الإخصاب آخر (أي يرقات الزرد حقنوا السيطرة morpholino قليل النوكليوتيد) أو morphants P62 (أي.، اليرقات الزرد حقنوا P62 morpholino قليل النوكليوتيد) مع الشغيلة كما هو موضح في القسم 3.4. تقييم عبء البقاء والبكتيرية خلال الأيام القادمة 2-5 كما هو موضح في القسم 3.5. صورة ثابتة اليرقات الزرد كما هو موضح في القسم 3.7 وسلط الضوء في الشكل 4C، أو صورة يعيشون اليرقات الزرد كما هو موضح في القسم 3.8.
      ملاحظة: يمكن تقييم الجرعة الفعالة morpholino قليل النوكليوتيد على أساس كفاءتها لمنع الربط نص أو ترجمة بروتين (انظر مناقشة).

Representative Results

على إصابة خلايا زراعة الأنسجة في المختبر، S. الفلكسنرية تستطيع الهروب من يبلوع وغزو العصارة الخلوية. في العصارة الخلوية، يمكن أن الخلايا المضيفة منع الحركة القائم على الأكتين من الشغيلة من قبل compartmentalizing البكتيريا داخل أقفاص septin (الشكل 1A). ويمكن أيضا البكتيريا شرك أقفاص septin أن توصف من قبل علامات الالتهام الذاتي P62 (الشكل 1B) وLC3 (الشكل 1C). هذه الملاحظات تبرز آلية جديدة للدفاع المضيف الذي يقيد نشر الجراثيم الغازية، وأيضا تكشف روابط جديدة بين الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي. لافت للنظر، واستنفاد علامات الالتهام الذاتي يقلل بشكل ملحوظ septin الحبس من البكتيريا (الشكل 2A)، وأظهرت النتائج أيضا إلى أن استنزاف septin الحبس يقلل بشكل ملحوظ من علامات التوظيف الالتهام الذاتي 8. وهكذا، على الأقل في حالة الشيجلا، septin التجمع القفص والتشكل جسيم بلعمي ذاتيويمكن الاطلاع ن كعمليات مترابطة. متطلبات الخلوية الأخرى للتجزئة الشيجلا بواسطة أقفاص septin تشمل بلمرة الأكتين والنشاط أكتوميوزين (الشكل 2B).

لا يوجد نموذج الفأر الطبيعي داء الشيغيلات، والتحقيق في الشيجلا المرضية، septin البيولوجيا والالتهام الذاتي البكتيريا في الجسم الحي يمكن أن تستفيد من نموذج حيواني جديد من العدوى، ويرقات الزرد 19. فمن الممكن أن تصيب اليرقات الزرد عن طريق حقن البكتيريا في مختلف المواقع التشريحية مثل الحقن في الوريد الذيلية للتجارب البقاء على قيد الحياة، وذيل حقن العضلات في الجسم الحي المجهري (الشكل 3A). اعتمادا على الجرعة، S. الفلكسنرية حقنه في يرقات الزرد يمكن إما أن يتم مسح خلال 48 ساعة بعد الإصابة، أو قد يؤدي إلى الإصابة تدريجيا وقاتلة في نهاية المطاف (أرقام 3B - 3D). الفوعة كرة القدم الشيجلاوأعرب ctors عند 28 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثلى للنمو الزرد، وعدوى الزرد بواسطة الشيجلا يعتمد على بصرامة نظامها إفراز النوع الثالث (T3SS) 19، أحد المحددات الفوعة أساسيا في الأمراض التي تصيب البشر. معا تؤخذ هذه الملاحظات تشير إلى أن اليرقة الزرد تمثل مجموعة جديدة قيمة لفي الجسم الحي تحليل العدوى الشيجلا.

إمكانية الوصول البصرية اليرقات الزرد يمكن تصور الحبس septin في الجسم الحي (الشكل 4A)، وهو إنجاز لم يسبق له مثيل الذي تم إنجازه باستخدام نماذج المضيف الثدييات. لاستكمال أدلة على أن أقفاص septin إيقاع البكتيريا المستهدفة لالالتهام الذاتي في الجسم الحي، يمكن للمرء أن تصيب اليرقات الزرد المعدلة وراثيا معربا عن GFP-LC3 ومراقبة التوظيف الالتهام الذاتي علامة لالشيجلا (الشكل 4B). لتحليل ultrastrucutral من autophagosomes الشغيلة في الجسم الحي، شectron المجهري يمكن استخدامها لتظهر بوضوح عصاري خلوي من عزل البكتيريا عن طريق الفجوات غشاء مزدوج 19. وينظر الالتهام الذاتي كعنصر رئيسي من خلايا مناعة ذاتية الحكم وآلية الدفاع حاسمة ضد البكتيريا intracytosolic 14-16. لتوصيف وظيفة الالتهام الذاتي في الجسم الحي، يمكن استخدام P62 المعالجة morpholino اليرقات الزرد. على عكس الآلات الالتهام الذاتي الأساسية [على سبيل المثال، البروتينات 36 الالتهام الذاتي ذات الصلة (ATGs) 26]، P62 ليست ضرورية للتنمية الفقاريات 27 واليرقات الزرد بالتالي يمكن أن تتطور بشكل طبيعي قبل العدوى. لافت للنظر، اليرقات-P62 المنضب تلقيح مع S. نتيجة الفلكسنرية إلى زيادة كبيرة في الوفيات وزيادة عبء البكتيرية 19. بالاتفاق مع العمل في المختبر تبين أن التجمع septin القفص هو مترابطة مع تشكيل جسيم بلعمي ذاتي 7،8، يتم تقليل توظيف septin إلى الشيجلا بوضوح في يرقات-P62 المنضب (

الشكل 1
الشكل 1. قفص septin في المختبر. أصيب (A) خلايا هيلا مع S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة لSEPT9 وphalloidin، وتصويرها بواسطة microcopy متحد البؤر. شريط النطاق، أصيب 1 ميكرون (B) خلايا هيلا مع S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة لP62 وSEPT2، وتصويرها بواسطة المجهر الفلورسنت ضوء. شريط النطاق، و transfected 1 ميكرون. خلايا (C) هيلا مع GFP-ATG8 / LC3، مصابة S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة لSEPT2، وتصويرها بواسطة ضوء الفلورسنت ميلcroscopy. شريط النطاق، 1 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 7.

الشكل 2
الشكل 2. متطلبات الخلوية لالشيجلا تشكيل قفص -septin. (A) تم علاج خلايا هيلا مع التحكم (CTRL)، P62، ATG5، ATG6 أو ATG7 سيرنا. تم immunoblotted لست] خلية كاملة من خلايا سيرنا المعاملة لGAPDH، P62، ATG5، ATG6، أو ATG7 لإظهار كفاءة سيرنا نضوب (أعلى). أصيب الخلايا المعالجة سيرنا مع S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، والمسمى لالمجهر الكمي. الرسوم البيانية (القاع) تمثل متوسط ​​± SEM٪ من الشغيلة داخل أقفاص SEPT2 من ن ≥3 تجارب في العلاج. (B) أصيبوا خلايا هيلا مع S. وlexneri، وتعامل مع DMSO، مثبط حركة الخلايا D (CytD)، latrunculin B (LatB)، نوكودازول (Noco)، أو blebbistatin (البثرة)، وبعد 4 ساعة 40 دقيقة كانت ثابتة والمسمى لالمجهر الكمي. رسوم بيانية تمثل متوسط ​​± SEM٪ من الشغيلة داخل أقفاص SEPT2 من تجربتين مستقلة لكل معاملة. تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 7.

الرقم 3
الشكل 3. نموذج الزرد العدوى الشيجلا. (A) الصور لتوضيح اتجاه اليرقة الزرد تحت stereomicroscope. تمركزت (اللوحة اليسرى) الزرد اليرقات الإخصاب آخر 72 ساعة أفقيا في لوحة حقن مع الجانب الظهري من يواجه إبرة الحقن. تم إجراء العدوى (لوحة الأوسط) مجرى الدم عن طريق ينجecting البكتيريا (حل الأحمر) في الوريد الذيلية، الخلفي لافتتاح البولي التناسلي. تم تنفيذ (اللوحة اليمنى) العدوى في العضلات الذيل عن طريق حقن البكتيريا (حل الأحمر) أكثر من الجسيدة. (B) منحنيات البقاء على قيد الحياة من 72 ساعة الإخصاب آخر اليرقات حقنه بجرعات مختلفة من S. الفلكسنرية وحضنت عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة إصابة آخر. تم تصنيف اللقاح اعتبارا منخفض (<10 3 كفو، والدوائر المفتوحة) ومتوسطة (~ 4 × 10 3 كفو، مثلثات مفتوحة) أو عالية (~ 10 4 كفو والساحات المفتوحة). يعني٪ ± SEM (قضبان أفقية) من ن ≥3 التجارب في الصف الواحد اللقاح. (C) تعداد البكتيريا الحية في الخليط من اليرقات الفردية في أوقات مختلفة إصابة آخر يقاس الطلاء على LB. ملاحظة، يرقات فقط بعد أن نجا مدرجة في تحليل تعداد العدوى. يعني ± SEM (قضبان أفقية) يظهر أيضا. (D) توزيع GFP- الشيجلا يحددهاالتصوير الحي باستخدام stereomicroscope الفلورسنت في أوقات مختلفة إصابة آخر باستخدام المنخفض والمتوسط، أو جرعة عالية من اللقاح (الذيلية الحقن في الوريد). تراكب من نقل صورة (الرمادي) ومضان GFP (الأخضر) (B) - (D) تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 19.

الرقم 4
أصيب الرقم 4. بيولوجيا الخلية من عدوى الشغيلة في الجسم الحي. (A) يرقات اسماك الزرد في عضلة الذيل مع GFP- الشيجلا (جرعة منخفضة) لمدة 24 ساعة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة ضد SEPT7 (الحمراء) وGFP (الخضراء )، وتصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. شريط النطاق، أصيب 5 ميكرون (B) GFP-LC3 اليرقات الزرد مع mCherry- الشيجلا (جرعة متوسطة) ل4 ساعة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة ضد mCherry (أحمر) وGFP (الأخضر)، وتصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. . شريط النطاق، 1.5 ميكرون (C) يرقات اسماك الزرد تعامل مع أي التحكم (CTRL، الصورة اليسرى) أو P62 (الصورة اليمنى) أصيب morpholinos مع GFP- الشغيلة لمدة 4 ساعة (جرعة متوسطة)، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة ضد SEPT7 ( أحمر) وGFP (الأخضر)، وتصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. السهام تبرز بعض الأمثلة من الشغيلة شرك في أقفاص septin (CTRL) أو لا (P62 المنضب) إصابة آخر 4 ساعة. شريط النطاق، 5 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 19.

Discussion

عند رصد الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي في المختبر باستخدام خلايا زراعة الأنسجة، والبروتوكولات المذكورة في المادتين 1 و 2 يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا زراعة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، لمتابعة الالتهام الذاتي (على سبيل المثال، ATG8 / LC3 + ف] autophagosomes) والهيكل الخلوي (على سبيل المثال، ذيول أكتين، أقفاص septin) ديناميكية في الوقت الحقيقي خلال العدوى الشيجلا باستخدام التصوير الحية، وخلايا زراعة الأنسجة يمكن عابر باستخدام GFP-، يبني RFP- أو CFP الموسومة كما وصفت سابقا 7،8. لزيادة نسبة الخلايا المصابة بواسطة الشيجلا (أي مرغوب فيه عموما لتحليلها في الوقت الحقيقي على اعتبار أن الشغيلة يمكن أن تغزو 5-30٪ من خلايا هيلا في 100: 1 وزارة الداخلية)، مباشرة إضافة 400 ميكرولتر من الشغيلة (OD 600 = 0.3 -0.6) إلى الخلايا في 2 مل MEM (المتعطشة المصل) وانتظر لا يقل عن 1.5 ساعة عدوى بكتيرية آخر للدخول كافية، والهروب من يبلوع، والنسخ، والاتحاد الافريقيالاعتراف tophagy وseptin الحبس. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام سلالة الشيجلا M90T الفجر العالمية التي تعبر عن adhesin AfaE ولقد أعلى بكثير قدرات الغزو في الخلايا الظهارية مقارنة مع سلالة M90T 28. من المذكرة، لم يتم بعد اختبار سلالة M90T الفجر العالمية في الجسم الحي باستخدام الزرد. يمكن أن تظل لوحات من المستعمرات الشغيلة في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام وتستخدم لعدة تجارب. لكن، مع مرور الوقت، مستعمرات الشغيلة التي فقدت البلازميد الفوعة يمكن أيضا استيعاب الكونغو الأحمر ويبدو أن الاحتفاظ بلازميد الفوعة بهم. لهذا السبب نحن نوصي لاستخدام مخزونات البكتيرية جديدة عندما يكون ذلك ممكنا.

عند رصد بيولوجيا الخلية من عدوى في الجسم الحي والبروتوكولات وصفها في المادتين 3 و 4 استخدام wildtype AB خط الزرد. لمراقبة التفاعلات -leukocyte الشغيلة، وخطوط الزرد المعدلة وراثيا يمكن استخدامها، على سبيل المثال، MPX: GFP أو lyz: DsRed البصرية لإيزي العدلات 19،29،30 أو MPEG1: mcherry لتصور الضامة 19،31. لتصور الالتهام الذاتي في الجسم الحي، وGFP-LC3 خط المعدلة وراثيا الزرد 19،24 يمكن استخدامها كما هو موضح في القسم 3.8.

إلى التشويش على الالتهام الذاتي في الجسم الحي، والجرعة الفعالة morpholino قليل النوكليوتيد يجب أن يتم تقييم التجربة على أساس كفاءتها لمنع الربط نص أو الترجمة البروتين. فإنه من المستحسن إجراء تجربة المعايرة وتأكيد استنزاف بواسطة RT-PCR (للصق morpholino قليل النوكليوتيد) أو SDS-PAGE (لمتعدية morpholino قليل النوكليوتيد) 32. عزل الحمض النووي الريبي من أجنة الزرد أو يرقات يمكن أن يؤديها باستخدام استخراج guanidinium ثيوسيانات-الفينول كلوروفورم. لاستخراج البروتين من اليرقات الزرد (8 إلى 15 يرقة / أنبوب)، التجانس ميكانيكيا باستخدام مدقة في 200 ميكرولتر تحلل العازلة (1 M تريس، 5 M كلوريد الصوديوم، 0.5 M EDTA، 0.01٪ octylphenol أكسيد الإيثيلين condensatالإلكترونية، ومثبط البروتياز). أنابيب الطرد المركزي في 19،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ونقل طاف لأنبوب جديد. إضافة عازلة Laemmli وتسخين العينة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ويمكن تخزين لست] في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها، ويمكن تقييمها من قبل الغرب النشاف كما هو موضح في القسم 2.3.

الزرد هو نموذج ممتاز للتطبيق في الجسم الحي المخدرات. التحليل باستخدام أليغنوكليوتيد] morpholino يمكن أن تستكمل مع المخدرات التي أنشئت لمعالجة الالتهام الذاتي (مثل rapamycin وbafilomycin). ويمكن علاج اليرقات غير المصابة و / أو المصابين rapamycin (1.5 ميكرومتر) أو bafilomycin (80 نانومتر) المخفف في E2 ويمكن تقييم تدفق ذاتية البلعمة بواسطة النشاف الغربي كما هو موضح في 25،33. يمكن تقييم نتيجة التلاعب الالتهام الذاتي على نتيجة العدوى وبقاء اليرقات المصابة كما هو موضح في القسم 3.5.

بالإضافة إلى دراسة الخلية المضيفةالمحددات، في المختبر وفي الجسم الحي بروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم المحددات البكتيرية اللازمة للاعتراف الالتهام الذاتي، وذلك باستخدام سلالات متحولة البكتيرية التي يتم الاعتراف بها بشكل مختلف من قبل الالتهام الذاتي، على سبيل المثال، الشيجلا ΔicsA (البروتين الشيجلا يكسا المجندين N-WASP ثم Arp2 / 3 لذيل الأكتين وتشكيل septin قفص، وفي غيابها لا يمكن وجود ذيول أكتين، لا أقفاص septin) وShigellaΔicsB (الشيجلا يتجنب استجابة ذاتية البلعمة عبر البروتين المستجيب البكتيرية IcsB، والذي يمنع تجنيد من الآلات الالتهام الذاتي ليكسا، وفي غيابها يمكن أن يكون هناك المزيد من أقفاص septin، والمزيد من الالتهام الذاتي) 7،8.

الشيجلا ليس الممرض الطبيعي من الزرد وينمو على النحو الأمثل عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك، فقد أظهرت العمل الذي عوامل الفوعة اللازمة لغزو الشغيلة، والهروب من فجوة أكلة والتكرار في قبرصيtosol يمكن التعبير و وظيفية في يرقات الزرد في 28 ° C 19. 28 ° C هي درجة الحرارة الأكثر شيوعا لتربية الزرد ودرجة الحرارة القياسية لضمان التنمية الزرد العادي 23. اللافت في الأحداث الكبرى المسببة للأمراض التي تؤدي إلى داء الشيغيلات في البشر (أي موت الخلايا البلاعم والغزو والضرب داخل الخلايا الظهارية، وانتشار الخلية الى خلية والدمار التهاب ظهارة المضيف) وترد بإخلاص في نموذج الزرد العدوى الشيجلا 19.

وأعرب بتواجد مطلق الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي وجينات لديها مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية. وقد أظهرت الدراسات أن الماوس خروج المغلوب من الالتهام الذاتي أساسي 26 أو 5 septin الجينات الجنينية هي القاتلة، وأنه من المرجح أن بعض هذه الجينات سيكون من الضروري للتنمية الزرد (أيضا على الرغم من أن هذه المشكلة قد يمكن خفضها من خلال حقيقة أن لديها العديد من الزردالجينات paralogous 33). إذا كان الأمر كذلك، هناك عدة بدائل للتغلب على هذه المسألة، بما في ذلك (ط) استخدام الكواشف الدوائية لتنظيم الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي، (ب) يمكن معاير morpholinos أسفل، (ج) خروج المغلوب من الجينات يمكن تصميم لخلية معينة فقط أنواع، و / أو (د) الجينات المسؤولة عن الاعتراف ذاتية البلعمة التي ليست ضرورية للتنمية الحيوانية (مثل، P62) قد تكون مستهدفة.

بينما الزرد هو نظام نموذج مثالي للتحقيق الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي خلال العدوى الشيجلا، تفتقر الأدوات الجزيئية حاليا. يحتاج حقل لتوليد أدوات جديدة والتعبير خلية محرك أقراص معينة من البروتينات في المصالح. لاسقاط التعبير عن الجينات الالتهام الذاتي / الهيكل الخلوي، يطلب تسلسل morpholino جديدة، وطرق جديدة للهندسة الجينوم (على سبيل المثال، TALEN، CRISPR / Cas9) يمكن أن تستخدم أيضا. في غضون ذلك، العديد من الأدوات إنشاؤه مسبقا للدراسات الإنسان أو الماوسقد تعمل على قدم المساواة لالزرد.

البكتيريا داخل الخلايا S. برزت الفلكسنرية باعتبارها كائن نموذج استثنائي لمعالجة القضايا الرئيسية في علم الأحياء، بما في ذلك قدرة البكتيريا لا بد من الاعتراف من قبل النظام المناعي 1،2. الخلية المضيفة توظف septins لتقييد الحركة من S. الفلكسنرية واستهدافهم لالالتهام الذاتي، عنصر حاسم في خلية مناعة ذاتية الحكم 7،8. وتشير هذه الملاحظات إطار جزيئي جديد لدراسة الالتهام الذاتي وقدرته على البكتيريا تتحلل عصاري خلوي. والمسألة الرئيسية الآن هي فك تماما الأحداث الجزيئية والخلوية الأساسية، والتحقق من صحة هذه الأحداث تحليلها في المختبر خلال العدوى البكتيرية في الجسم الحي باستخدام نماذج حيوانية ذات الصلة. ولهذه الغاية، تم تأسيس الزرد كمضيف جديد قيما لتحليل S. عدوى الفلكسنرية 19. التفاعلات بين البكتيريا والخلايا المضيفة يمكن تصويرها بدقة عالية، وينبغي أن نموذج الزرد تكون مفيدة لفهم بيولوجيا الخلية من عدوى الشغيلة في الجسم الحي. اليرقات الزرد يمكن استخدامها لتحقيق في دور الالتهام الذاتي البكتيري في دفاع المضيف، وأظهرت أن العمل الذي اضطراب الالتهام الذاتي يمكن أن تؤثر سلبا على بقاء المضيفة في الاستجابة للعدوى الشيجلا 19.

الملاحظات الناتجة عن دراسة الشيجلا، septin الحبس والالتهام الذاتي في المختبر باستخدام خلايا زراعة الأنسجة في الجسم الحي واستخدام اليرقات الزرد قد توفر التطورات الأساسية في فهم دفاع المضيف. أنها يمكن أن تشير أيضا إلى وضع استراتيجيات جديدة تهدف إلى مكافحة الأمراض المعدية.

وثمة هدف بالغ الأهمية من هذا التقرير هو لفهم الأحداث الجزيئية والخلوية تحليلها في المختبر (أي الالتهام الذاتي، والذيول أكتين، septin الحبس) خلال العدوى البكتيرية في الجسم الحي في سياق الأنف والحنجرةكائن غضب، وذلك باستخدام اليرقات الزرد. إذا لم تكن مألوفة مع البيولوجيا الزرد والمناولة، يمكن للمرء الرجوع إليها في البروتوكولات عمق المناسبة لتربية الزرد 23 و في تحليل الجسم الحي للعدوى الزرد 19،35.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

ويدعم العمل في المختبر SM من قبل زمالة بحوث التنمية الوظيفي يلكوم ترست [WT097411MA].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4, (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4, (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2, (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61, (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5, (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25, (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).
استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).More

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter