Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anvendelse af Published: September 9, 2014 doi: 10.3791/51601
Automatic Translation
1, 2, 1
1Section of Microbiology, MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London, 2Département de Biologie du Développement et des Cellules Souches, Institut Pasteur, Unité Macrophages et Développement de l'Immunité

Summary

At modvirke patogen udbredelse, værtsceller reorganisere deres cytoskelet at inddeler bakterier og fremkalde autofagi. Brug af Shigella-infektion af vævskulturceller, vært og patogen determinanter bag denne proces er identificeret og karakteriseret. Brug af zebrafisk modeller af Shigella-infektion, er den rolle, som opdagede molekyler og mekanismer undersøgt in vivo.

Abstract

Shigella flexneri er et intracellulært patogen, som kan flygte fra phagosomes at nå cytosolen, og polymerisere værten actincytoskelettet at fremme sin motilitet og formidling. Nyt arbejde har vist, at proteiner involveret i actin-baserede motilitet også er knyttet til autophagy, en intracellulær nedbrydning proces afgørende for celle autonom immunitet. Bemærkelsesværdigt, kan værtsceller forhindre actin-baserede motilitet S. flexneri ved afskaerme bakterier indenfor 'septin bure «og målrette dem til autofagi. Disse observationer tyder på, at en mere fuldstændig forståelse af septins, en familie af trådformede GTP-bindende proteiner, vil give ny indsigt i processen med autophagy. Denne rapport beskriver protokoller til at overvåge autofagi-Cytoskeleton interaktioner forårsaget af S. flexneri in vitro under anvendelse vævskulturceller og in vivo ved hjælp af zebrafisk larver. Disse protokoller muliggøre undersøgelse af intracellulære mechanisms, der styrer bakteriel udbredelse på molekylært, cellulært og hele organismen niveau.

Introduction

Shigella flexneri, en Gram-negativ invasiv enteropatogene bakterie, kan flygte fra phagosomes til cytosolen, og polymerisere værten actincytoskelettet at unddrage cytosoliske immunreaktioner og fremmer intern og intercellulære bevægelse 1,2. På trods af den forståelse af actin-baserede motilitet in vitro 3,4, de mekanismer, der begrænser bakteriel spredning i vivo er ikke fuldstændigt klarlagt. Dette er afgørende for en mere fuldstændig forståelse af medfødte immunitet og vært forsvar.

Septins, en højkonserveret familie af proteiner blandt metazoans er guanosintriphosphat (GTP) -bindende proteiner, der samler ind i hetero-oligomert komplekser og danner polære filamenter, der forbinder med cellemembraner og cytoskelettet 5,6. Nyligt arbejde har opdaget, at inficerede værtsceller kan forhindre Shigella actin baseret motilitet ved afskaerme bakterier målrettet til autophAGY indenfor 'septin bure «, afslører den første cellulære mekanisme, der modvirker actin baseret motilitet 7,8. En bred åben mark efterforskning ligger nu i 'septin biologi og infektion. Septin samling, fremkaldt af en række forskellige patogener (f.eks, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11) kan fremstå som et centralt emne i værtsforsvaret 5,12.

Autophagy, en stærkt bevaret intracellulær nedbrydning proces, ses som et centralt element i celle-autonom immunitet på grund af sin evne til at levere cytosoliske bakterier til lysosomet 13,14. Men den rolle af bakteriel autofagi in vivo begrænse eller fremme bakteriereplikation stadig dårligt forstået 15,16. Den zebrafisk (Danio rerio) er dukket op som et hvirveldyr model for studiet af infektioner, fordi det er optisk tilgængeligpå larvestadier når det medfødte immunsystem er allerede funktionelle 17,18. Nyligt arbejde har præget modtagelighed zebrafisk larver til S. flexneri, et paradigme for bakteriel autofagi 15, og har brugt Shigella -zebrafish infektion model til at studere manipulation af autophagy til antibakteriel behandling in vivo 19.

Denne rapport indeholder nye værktøjer og analyser for at studere S. flexneri interaktioner med autofagi og cytoskelettet. I et første skridt, at protokoller overvåge autofagi-cytoskelettet interaktioner beskrives ved hjælp af Shigella-infektion af den humane epitelcellelinie HeLa. For at vurdere den rolle, autofagi-Cytoskeleton interaktioner på Shigella-infektion proces in vitro metoder manipulere autofagi og Cytoskeleton komponenter (ved hjælp af siRNA eller farmakologiske reagenser) er forudsat. Nyt arbejde har vist, at ved hjælp af Shigella-infektion of zebrafisk larver, kan lignende analyser anvendes til at studere celle biologi infektion in vivo. Protokoller til at forberede og inficere zebrafisk larver er detaljeret, og at vurdere værtens respons på Shigella-infektion in vivo, protokoller til at bestemme vært overlevelse og bakteriel byrde af inficeret larver er forudsat. Metoder til at overvåge ansættelsen af septin og autofagi markører til Shigella (ved hjælp af enten fast eller levende zebrafisk larver), og metoder til at teste rollen af disse processer in vivo [hjælp morpholinogrupper oligonukleotider (injiceret i 1-4 celle embryoer) eller farmakologiske reagenser ( tilsættes direkte til zebrafisk badevandet)] er også diskuteret. Dette program forventes arbejde at give indsigt i de mekanismer, der er nødvendige til kontrol af infektion af cytosole værtsresponser.

Protocol

1. Overvågning Autophagy og Cytoskeleton in vitro ved anvendelse vævskulturceller

  1. Forbered S. flexneri
    1. Plade S. flexneri M90T (vildtype) fra -80 ° C glycerol-lager på en Congorødt tryptisk kasein soja (TCS) agarplade. Inkuber natten over ved 37 ° C. Den samme plade kan anvendes til adskillige eksperimenter.
    2. Pick en enkelt koloni og vokse i 8 ml TCS medier i et rysteapparat natten over ved 37 ° C.
      BEMÆRK: Congo-rød binding indikerer, at virulensplasmidet er blevet bibeholdt.
    3. Til videredyrke bakterier til eksponentiel vækst, inokulere frisk FKS med natten bakteriekultur ved 1/80 fortynding og vokse i et rysteapparat ved 37 ° C til OD600 = 0,3 til 0,6.
    4. Spin den bakterielle subkultur ved 1.000 xg i 5 minutter. Vask pellet med MEM og centrifugeres ved 1.000 xg i 5 minutter. Opløs pellet i MEM til OD600 = 0,3-0,6.
  2. Forbered HeLa CeLLS til Infektion
    1. Grow HeLa-celler i "komplet medium", dvs. MEM plus L-alanyl-L-glutamin tilsat 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essentiel aminosyreopløsning, og 10% føtalt kalveserum.
    2. Plate 1-1,5 x 10 5 celler i 6-brønds plader 24 eller 48 timer før forsøget begynder. Plade på dækglas i 6-brønds plader til mikroskopi, eller plade på 35 mm glasbund retter at forberede sig til direkte billedvisning.
      BEMÆRK: (. F.eks actin haler, septin bure) for at følge autofagi (f.eks ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) og cytoskelet dynamik i realtid i løbet af Shigella-infektion med levende billeddannelse, kan vævsdyrkningsceller transficeres forbigående hjælp GFP-, RFP- eller FFP-mærkede konstruktioner (se diskussionen).
  3. Infektion
    1. Inficere celler med 100: 1 infektionsmultiplicitet (MOI) på Shigella (OD600 = 0,3 til 0,6) fortyndet i MEM; direkte tilføje til HeLa-celler forgyldt med 6-well plader 24-48 timer før infektion (som beskrevet i afsnit 1.2) i 2 ml MEM (serumudsultet).
    2. For at maksimere bakteriel vedhæftning til værtsceller, centrifugeres bakterier og celler ved 700 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og lade infektionen forløbe.
    3. Vask inficerede celler to gange med frisk MEM og inkuberes med gentamicin indeholdende komplet medium (50 ug / ml, for at fjerne ekstracellulære bakterier) i 1-4 timer afhængigt af forsøget.
  4. Fastsættelse og mærkning Inficerede HeLa-celler til mikroskopi
    1. Vask inficerede celler to gange med 1x PBS og løse i 15 min i 4% paraformaldehyd i 1x PBS ved stuetemperatur. For at fjerne paraformaldehyd, Vask cellerne 2x med 1x PBS.
    2. Inkuber fikserede celler i 50 mM ammoniumchlorid i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask en gang med 1x PBS og permeabilisere celler til 4 minutter med 0,1% octylphenol ethylenoxid-kondensat ved stuetemperatur temperatur.
      BEMÆRK: Alternativer til oktylphenol ethylenoxidkondensat til permeabilisering, såsom saponin eller methanol, kan anvendes til forskellige konservering af cellulære strukturer 20.
    3. Vask cellerne i 1x PBS og inkuberes i vådt kammer med primære antistoffer mod autofagi kritiske komponenter (fx p62 / SQSTM1) eller septin cytoskelettet (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9 og SEPT11 er udtrykt i HeLa-celler) i 30 min (ved stuetemperatur) til natten over (ved 4 * C).
    4. Vask cellerne to gange med 1x PBS og inkuberes i vådt kammer med sekundære antistoffer, og mærke trådformede actin (F-actin) med phalloidin i 30 minutter (ved stuetemperatur) til natten over (4 ° C). Til farvning af vært cellekerner tilsættes 4 ", 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
    5. Vask cellerne i 1x PBS og montere dækglas på objektglas med montering medium.
  5. Mikroskopisk Imaging af inficerede HeLa-celler
    1. Til billede infected celler bruger et epifluorescens eller konfokal mikroskop og en 63X eller 100X mål at identificere DAPI-mærket Shigella.
      BEMÆRK: Som vist i figur 1A - 1C, kan septin bure visualiseres som ringe lignende strukturer, ~ 0,6 um i diameter, der omgiver cytosoliske bakterier polymerisering actin og rekrutterer autofagi markører (fx P62 og LC3) 7,8. Derimod vil bakterier polymerisering actin haler ikke kompartmentaliseret ved septin bure og vil ikke blive målrettet mod autofagi 7,8.
    2. Ved hjælp af en epifluorescens eller konfokal mikroskop og en 63X eller 100X mål kvantificere antallet af intracellulære bakterier pr mikroskopisk felt. Også kvantificere antallet af bakterier fanget i septin bure og målrettet til autofagi eller polymerisering aktin haler og undslippe autofagi.
    3. For at bestemme den procentdel af bakterier fanget i septin bure eller polymerisering actin haler, tage en Z-stak billede serie af infeCTED celler, proces billederne og tælle mindst 500-1.000 bakterier pr eksperiment fra mindst 3 uafhængige forsøg.

2. funktionel analyse af Autophagy og cytoskelettet In Vitro

BEMÆRK: Både genetiske og farmakologiske metoder kan bruges til at forstyrre autofagi i inficerede vævskulturceller, og virkningen af ​​disse behandlinger på forløbet af infektionen kan overvåges.

  1. siRNA-medieret Silencing
    1. Plate 0,8 x 10 5 HeLa-celler på dækglas i 6-brønds plader i komplet medium.
    2. Transficere den følgende dag ved hjælp af en lipidbaseret transfektionsreagens med siRNA mod autofagi og / eller Cytoskeleton markører.
    3. Efter den ønskede inkubationstid, inficere cellerne med Shigella som beskrevet i afsnit 1.3.
    4. Fix og mærke de celler som beskrevet i afsnit 1.4.
  2. Farmakologisk manipulation
    fx at depolymerisere actincytoskelettet brug cytochalasin D eller latrunculin B, at depolymerisere mikrotubuli bruge nocodazol at blokere actomyosin aktivitet brug Blebbistatin, eller at forstyrre septin samling brug forchlorfeneuron. Autofagi kan stimuleres ved hjælp af rapamycin eller blokeres ved hjælp bafilomycin.
    1. At manipulere cytoskelettet under Shigella-infektion, først inficere cellerne med Shigella, som beskrevet i afsnit 1.3 og give tilstrækkelig tid for bakterier at trænge ind i cellerne og flygte fra fagosomet til cytosolen (f.eks.,> 1,5 timer efter infektion).
    2. Fortynd narkotika fra stamopløsningen [stamopløsning suspenderet i dimethylsulfoxid (DMSO)] i MEM til en endelig koncentration på 5 M (cytochalasin D, latrunculin B, nocodazol), 20 m (forchlorfeneuron) eller 50 m (Blebbistatin), og behandle cellerne i 30 minutter ved 37 ° C. Den totale mængde af lægemiddel (rumfang DMSO / dtæppe blanding) tilsat pr plade / hætteglas af celler er 1-5 pi (afhængig af stamopløsning) per 2 ml medium. Behandl celler med en tilsvarende dosis DMSO fortyndet i MEM som en negativ kontrol.
    3. Fix og mærke de celler som beskrevet i afsnit 1.4.
      BEMÆRK: For at manipulation af autophagic flux (i inficerede eller ikke-inficerede celler), udvide narkotikabehandling hjælp rapamycin (20 nM) eller bafilomycin (160 Nm) fra 4 til 12 timer.
  3. Western-blot
    BEMÆRK: Autophagic aktivitet kan kvantificeres ved at måle protein-niveau autofagi markører, såsom p62 og LC3.
    1. Efter den ønskede inkubationstid, indsamle og lysere cellerne til immunblotting. Kør proteinekstrakter på 8, 10 eller 14% acrylamidgeler.
    2. Autophagic flux, dvs. satsen for autophagy, kan analyseres som beskrevet i 21,22.
  4. Mikroskopisk Imaging og kvantificering
    1. Ved hjælp af en epifluorescens eller konfokal mikroskop og en 63X eller 100X objektive, virkningen af siRNA eller medicinsk behandling på Shigella-infektion kan evalueres ved kvantitativ mikroskopi (dvs. tælle af autophagosomes, septin bure og aktin haler) som beskrevet i punkt 1.5 og vist i figur 2A og 2B.

3. In vivo Imaging S. flexneri Interaktioner med Autophagy og cytoskelettet

BEMÆRK: zebrafisk model af Shigella infektion kan bruges til at undersøge septin anbringelse i bur og autofagi in vivo 19.

  1. Forbered S. flexneri
    1. Kultur S. flexneri som beskrevet i afsnit 1.1.
    2. Hos OD600 = 0,3-0,6, centrifugering 8 ml bakteriel subkultur ved 1.000 xg i 10 min. Vask pelleten med 1x PBS og centrifugeres ved 1000 xg i 10 minutter.
    3. Pellet resuspenderes i 80 pi 0,1% phenolrødt 1x PBS til opnåelse af ~ 2.000 bakterier / nl. Hold Bacterial forberedelse på is for at bremse væksten.
      BEMÆRK: Tilføjelse phenolrødt vil bidrage til at visualisere inokulum når den indsprøjtes i larver.
  2. Forbered zebrafisk Larver til injektion
    BEMÆRK: Zebrafisk er lagt som æg og er identificeret som embryoner indtil 72 timer efter befrugtning, når de kaldes larver.
    1. Race voksen zebrafisk som beskrevet i Westerfield 23 ved at placere 4 hanner og 8 hunner (normalt en 2: 1) i en separat akvarium med bunden dækket med kugler (der vil forhindre voksne æde udklækkede æg). Alternativt kan placere æg opsamlingskurve inde i avl kampvogne natten før.
      BEMÆRK: Æg er befrugtet ~ 30 min efter lysene gå i zebrafisk facilitet 23, og bør indsamles så hurtigt som muligt for at forhindre skimmelvækst. Ægget opsamlingskurve tjener til at indsamle æggene, så de let kan høstes og også beskytte æg fra voksne.
    2. Saml embryos og rense dem ved vask i embryo medier (E2) med 0,003% blegemiddel i 10 min. Fjern E2 med blegemiddel, vask embryoner 5x i E2 medium og vokse embryoner i 10 cm petriskål (100 embryoner / 50 ml E2 medium) ved 28 ° C.
    3. Hvis embryoner eller larver vil blive anvendt til mikroskopi studier ved 24 timer efter befrugtning tilføje 0,003% N-phenylthiourea til E2-medium for at forhindre melanin. Hold embryoner ved 28 º C for normal udvikling.
      BEMÆRK: Zebrafisk larver er klar til infektion ved 72 timer efter befrugtningen.
    4. Til infektion og mikroskopi procedurer, bedøver zebrafisk larver i 200 g / ml tricaine i E2.
  3. Forberedelse af zebrafisk Larver til intravenøs og lokal infektion
    BEMÆRK: For at vurdere zebrafisk overlevelse under Shigella-infektion, udføre caudale intravenøse injektioner. At visualisere rekrutteringen af septin og autofagi markører til Shigella, udføre infektion på lokaliserede steder såsom halen muskel.
    1. For en caudale intravenøs injektion, skal du placere bedøvet larver sideværts med den dorsale side vendt nålen. Som vist i figur 3A, kanylespidsen tæt (bageste) til urogenitale åbning, sigter til den kaudale vene, og gennembore huden og levere den ønskede bakteriedosis (injektionsvolumen 1-5 nl).
      BEMÆRK: Intravenøs infektion er udfordrende at udføre og vil tage flere ugers træning at blive fortrolig med denne procedure. Injektion phenolrød (uden bakterier) til uddannelse vil hjælpe med at vurdere injektionsstedet ordentligt.
      BEMÆRK: I tilfælde af Shigella, har dosisafhængige eksperimenter vist, at en lav dosis infektion (<1.000 CFU) er ryddet inden 48 timer, og en høj dosis infektion (> 4.000 CFU) fører til vært dødelighed inden for 48 timer 19.
    2. For en hale muskel infektion, skal du placere bedøvet larver som beskrevet i afsnit 3.3.1. Som vist i figur 3A, placere nålen forsigtigiy over muskel somitter (dvs. segmenter af skeletmuskulatur) og indsprøjte en lille mængde (dvs.. 1 nl) af bakteriel forberedelse.
  4. Intravenøs injektion af bakterier i Larver
    1. Træk borosilicat mikrokapillærer som beskrevet i 24.
    2. Slut nål til indehaveren af ​​den tredimensionale grove manuel manipulator og bryde nålespidsen med fine pincet.
    3. For at indlæse nålen, placere en dråbe bakteriekultur på et dækglas. Tænd for mikroinjektor og gascylinder, lidt nedsænkes nålespidsen ind i drop, og fylde nålen med den ønskede mængde af bakteriel forberedelse.
    4. Sådan kalibreres injektionsvolumenet, placere en dråbe af mineralsk olie på et dækglas og injicere den bakterielle forberedelse. Mål diameteren af dråben anvendelse af et mikrometer, og beregne den injicerede volumen [V = (4/3) πr 3].
      BEMÆRK: Brug af indstillinger for injektion af 40 psi og 50 msek med en bacteriforberedelse al som beskrevet i afsnit 3.1 vil give ~ 2.000 CFU / nl.
    5. Forbered injektionen pladen ved hjælp af en plast skimmel, som beskrevet i Westerfield 23.
    6. Overfør larverne til injektionen pladen og line dem op med en fin pensel. Orienten og sprøjt larver som beskrevet i afsnit 3.3.1.
    7. Til vurdering af zebrafisk overlevelse, overførsel inficerede larver individuelt i plader med 24 brønde i 1 ml E2 / brønd og inkuberes ved 28 ° C. Overvåg inficerede larver dagligt i de næste 2-5 dage og plot overlevelse over tid (figur 3B).
  5. Plating zebrafisk Larver for bakteriel Kvantificering
    BEMÆRK: Arbejdet under en steril hætte for at undgå forurening.
    1. At evaluere antallet af bakterier injiceret ind i fisken (på tidspunktet 0 timer efter infektion) og bakteriel kvantificering på ønskede tidspunkter, ofre zebrafisk larver med en overdosis tricaine (200-500 mg / l). Placer individuel larver i 1,5 ml polypropylene mikrocentrifugerør med 200 pi 0,1% octylphenol ethylenoxidkondensat 1x PBS, og mekanisk homogeniseres ved hjælp af en støder.
      BEMÆRK: For at bekræfte den bakterielle belastning i injektionsvolumenet, pumpe en lige dosis i en steril 1x PBS slip og plade det ud.
    2. Lav en seriel fortynding af zebrafisk larver homogenaterne i sterilt vand og plade på lysogeni bouillon (LB) agarplader. Larver kan være belagt alternativt Congorødt FKS-plader til at skelne mellem Shigella have fastholdt den virulente plasmid eller ej.
      BEMÆRK: Plade 3 eller flere ikke-inficeret fisk som en kontrol for at kontrollere status for zebrafisk larver anvendes til infektion.
    3. Efter inkubering natten over af pladerne ved 37 ° C, tælle bakteriekolonier. Som vist i figur 3C, repræsentere anvendelse af en logaritmisk skala.
      BEMÆRK: Bakteriel belastning under infektion af zebrafisk larver kan også visualiseres ved hjælp af fluorescens-mærket Shigella og mikroskopisk jegmaging som beskrevet i afsnit 3.7 eller 3.8 (figur 3D).
  6. Zebrafisk Larver Immunofarvning
    1. Ved ønskede tidspunkter, ofre larverne ved hjælp af en overdosis af tricaine. Saml fisk i 1,5 ml mikrocentrifugerør polypropylen rør (10 til 20 larver / tube).
    2. Fastgør larver under anvendelse af 4% paraformaldehyd med 0,4% octylphenol ethylenoxid-kondensat i 1x PBS og inkuberes i en orbital omrører (for at undgå larvernes klyngedannelse) i 2 timer (ved stuetemperatur) eller natten over (4 ° C).
      BEMÆRK: Elektronmikroskopi kan anvendes til ultrastrukturelle analyse af inficerede zebrafisk larver. I dette tilfælde bør bedøvede embryoner fastsættes og forarbejdet i henhold til Mostowy m.fl. 19.
    3. Wash 3x i 1x PBS 0,4% octylphenol ethylenoxid-kondensat i 5 minutter, derefter blokere i blokerende opløsning (10% føtalt kalveserum, 1% DMSO, 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurat i 1x PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Dilut det primære antistof i blokerende opløsning. Tilføj larver fortyndet primært antistof og inkuberes natten over ved 4 ° C i en orbital omrører. Brug primære antistoffer, som beskrevet ovenfor i afsnit 1.4.3.
    5. Vask larver 4x i 15 minutter i 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurat 1x PBS ved stuetemperatur.
    6. Fortynd det sekundære antistof i blokerende opløsning. Tilføj larver fortyndet sekundært antistof og inkuberes natten over ved 4 ° C i en orbital omrører. Brug de samme sekundære antistoffer og phalloidin som beskrevet i afsnit 1.4.4.
    7. Vask 4x til 15 min i 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurat 1x PBS ved stuetemperatur. Til farvning af værten cellekerner tilføje DAPI (150 Nm slutkoncentration) i løbet af den første af disse 15 min vaske.
    8. Til konservering af fluorescens-mærket larver, inkuberes dem gradvist i en glycerolgradient på 15, 30, 60, og 80% fortyndes i 1x PBS og 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurat i 2 timer (ved stuetemperatur temperamentperatur) til natten over (4 ° C).
      BEMÆRK: Stained larver kan opbevares i lange perioder i 80% glycerol ved 4 ° C (fx 4 måneder.).
  7. Mikroskopisk Imaging af Fixed zebrafisk Larver
    1. Overfør fast glycerol indlejret larver til en lille dråbe af 80% glycerol i en 35 mm petriskål (til stereomikroskopi) eller fuld glasbund fad (til konfokal miscopy).
    2. Tag Z-stak billede serie af inficerede larver og behandle billeder efter behov.
    3. Brug en epifluorescens eller konfokal mikroskop og en 10X eller 20X målsætning for hele organismen billeddannelse. Så brug et konfokalt mikroskop og en 40X, 63X eller 100X mål at visualisere de enkelte celler og ansættelsen af autofagi og cytoskeleton markører til individuelle bakterier in vivo 19 (figur 4A og 4B).
      BEMÆRK: inficere fisk i halen muskel og montere i glycerol fladt langs bunden af ​​glasset bund fad, der giver EAsy fokus.
  8. Lev Mikroskopisk Imaging af inficerede zebrafisk Larver
    BEMÆRK: Larver er optisk tilgængelige, således in vivo autophagosomes kan visualiseres ved hjælp af GFP-Lc3 zebrafisk transgene linje 25. Inficere zebrafisk larver som beskrevet i afsnit 3.3 og montere som beskrevet i dette afsnit.
    1. Forbered lavtsmeltende 1% agarose (LMA) i E2 og afkøles til 35-37 ° C for at undgå larver skader / drab. Fordel dråber LMA i en 35 mm petriskål (til stereomikroskopi) eller fuld glasbund fad (til konfokal mikroskopi).
    2. Overførsel bedøvet zebrafisk larver individuelt (med så lidt vand som muligt) til LMA dråber. Orient larver til den ønskede position ved hjælp af en pensel og vente på agarose at størkne.
    3. Dæk hele skålen overfladen med LMA, og overlejring med E2 indeholdende 200 ug / ml tricaine at undgå præparat fra udtørring og for at tillade fisk at udveksle ilt fra vandet.
    4. Brug en epifluorescens eller konfokal mikroskop og en 10X eller 20X objektiv til billeddannelse hele zebrafisk larver. Brug en konfokal mikroskop og en 40X, 63X eller 100X mål at visualisere bakterielle authopagosomes (dvs. GFP-Lc3 + ve vakuoler omkring Shigella) in vivo.
    5. Tag en Z-stak inficerede larver over tid (f.eks. Hver 2 minutter i løbet af flere timer) for at visualisere autophagosomes og deres dynamik, i realtid.

4. funktionel analyse af Autophagy og cytoskelettet in vivo

BEMÆRK: virkningen af ​​farmakologiske og genetiske forstyrrelser af autophagy på forløbet af infektionen kan overvåges på hele dyr niveau og på niveauet for den enkelt celle.

  1. Autofagi Manipulation af Morpholino Injection
    1. Opløs morpholino oligonukleotider i sterilt vand til en stamopløsning på 1 mM af opvarmning ved 65 ° C i 10 min. Storeved stuetemperatur.
      BEMÆRK: morpholinogrupper oligonucleotid- injektioner skal udføres i 1-4 celle embryoer.
    2. Forbered morpholino oligonukleotid arbejdsopløsning med steril 0,1% phenolrødt i Dulbeccos phosphatbufferet saltvand. Indlæse nålen som beskrevet i afsnit 3.4.2., Kan injektionsvolumen morpholino oligonukleotid være kalibreret som beskrevet i afsnit 3.4.3.
      BEMÆRK: Phenolrødt vil bidrage til at visualisere volumen injiceres.
    3. Forbered et embryo-positionering kammer (dvs.., Et objektglas limet med cyanoacrylat på en 10 cm petriskål låg med kanter står nålen delvist fjernet). Overfør 1-4 celle embryoer til kammeret med en lille mængde vand og tilpasse dem med en fin pensel.
    4. Trænge ind chorion og blommesækken glat. Når du er inde, skal du trykke på pedalen for at injicere den ønskede mængde morpholinogruppe oligonukleotid løsning.
      BEMÆRK: Minimer mængden af ​​injektion til 0,5-2 nl; volumener højere than 5 nl kan forårsage udviklingsmæssige defekter og øge æg dødelighed.
    5. Efter mikroinjektion, rene embryoner (ved blegning som beskrevet i afsnit 3.2) og inkuberes dem i en petriskål med E2 ved 28 ° C.
    6. Inficere 72 timer efter befrugtning kontrol (dvs. zebrafisk larver injiceret med kontrol morpholino oligonukleotid) eller P62 morphants (dvs.., Zebrafisk larver injiceret med p62 morpholino oligonukleotid) med Shigella som beskrevet i afsnit 3.4. Vurdere overlevelse og bakteriel byrde for de næste 2-5 dage, som beskrevet i afsnit 3.5. Billede faste zebrafisk larver, som beskrevet i afsnit 3.7 og fremhævet i figur 4C, eller billede levende zebrafisk larver som beskrevet i afsnit 3.8.
      BEMÆRK: Den effektive morpholinogruppe oligonukleotid dosis kan vurderes på grundlag af dens effektivitet til at hæmme afskrift splejsning eller protein oversættelse (se Diskussion).

Representative Results

Efter infektion af vævskulturceller in vitro, S. flexneri kan undslippe fra fagosomet og invadere cytosolen. I cytosolen, kan værtsceller forhindre actin-baserede motiliteten af Shigella ved afskaerme bakterier inde septin bure (figur 1A). Bakterier indesluttet af septin bure kan også mærkes ved autofagi markører p62 (figur 1B), og LC3 (figur 1C). Disse observationer fremhæve en ny virkningsmekanisme vært forsvar, der begrænser udbredelsen af ​​invasive patogener, og også afsløre nye forbindelser mellem autofagi og cytoskelettet. Påfaldende, udtømningen af autofagi markører reducerer septin anbringelse i bur af bakterier (figur 2A), og arbejde har også vist, at nedbrydningen af septin anbringelse i bur reducerer rekruttering af autofagi 8 markører betydeligt. I det mindste i tilfælde af Shigella septin huskonstruktion og autophagosome FORMATIOn kan ses som indbyrdes afhængige processer. Andre cellulære krav til opdeling af Shigella efter septin bure omfatter actinpolymerisation og actomyosin aktivitet (figur 2B).

Der er ikke nogen naturlig musemodel af shigellose, og efterforskning af Shigella patogenese, septin biologi og bakteriel autofagi in vivo kan drage fordel af en ny dyremodel for infektion, zebrafisk larver 19. Det er muligt at inficere zebrafisk larver ved at injicere bakterier i forskellige anatomiske steder såsom kaudale intravenøse injektioner for overlevelse eksperimenter og hale muskel injektioner til in vivo-mikroskopi (figur 3A). Afhængig af den dosis, S. flexneri injiceret i zebrafisk larver kan enten blive ryddet inden 48 timer efter infektion, eller kan resultere i en progressiv og i sidste ende dødelig infektion (figur 3B - 3D). Shigella virulens factors udtrykkes ved 28 ° C, den optimale væksttemperatur af zebrafisk, og zebrafisk infektion af Shigella er strengt afhængig af en type III sekretionssystem (T3SS) 19, en vigtig virulens determinant i human sygdom. Tilsammen disse observationer tyder på, at zebrafisk larve repræsenterer en værdifuld ny vært til in vivo analyser af Shigella-infektion.

Den optiske tilgængelighed zebrafisk larver muliggør visualisering af septin bure in vivo (figur 4A), en præstation, som aldrig før er blevet opnået under anvendelse af pattedyr-modeller. Som supplement til dokumentation for, at septin bure indfange bakterier målrettet til autophagy in vivo, kan man inficere transgene zebrafisk larver udtrykker GFP-Lc3 og observere autofagi markør rekruttering til Shigella (figur 4B). Til ultrastrucutral analyse af Shigella autophagosomes in vivo, electron mikroskopi kan bruges til tydeligt at vise cytosoliske beslaglæggelse af bakterier ved dobbelte membran vakuoler 19. Autofagi ses som et centralt element i celle-autonom immunitet og en afgørende forsvarsmekanisme mod intracytosolic bakterier 14-16. For at karakterisere autofagi funktion in vivo, kan p62 morpholino-behandlede zebrafisk larver anvendes. I modsætning til kernen autofagi maskiner [f.eks. De 36 autofagi relaterede proteiner (ATG'er) 26], p62 ikke er essentielt for vertebrat udvikling 27 og dermed zebrafisk larver kan udvikle sig normalt før infektion. Bemærkelsesværdigt, p62-udtømte larver inokuleret med S. flexneri resultat betydeligt øget dødelighed og øget bakteriel byrde 19. Efter aftale med in vitro-arbejde viser, at septin bur samling er indbyrdes afhængige med autophagosome dannelse 7,8 er septin rekruttering til Shigella klart reduceret i p62-udtømte larver (

Figur 1
Figur 1. septin bur in vitro. (A) HeLa-celler blev inficeret med S. flexneri i 4 timer 40 min, faste, mærket med antistoffer mod SEPT9 og phalloidin, og afbildet ved konfokal mikroskopi. Scale bar, blev en um. (B) HeLa-celler inficeret med S. flexneri i 4 timer 40 min, faste, mærket med antistoffer mod p62 og SEPT2, og afbildet af fluorescerende lys mikroskopi. Scale bar, blev en um. (C) HeLa-celler transficeret med GFP-ATG8 / LC3, inficeret med S. flexneri i 4 timer 40 minutter, fikseret, mærket med antistoffer mod SEPT2 og afbildet af fluorescerende lys kmcroscopy. Målestok, 1 um. Disse tal er blevet ændret fra Mostowy m.fl. 7.

Figur 2
Figur 2. Cellular krav til Shigella -septin bur dannelse. (A) HeLa-celler blev behandlet med kontrol (CTRL), P62, ATG5, ATG6 eller ATG7 siRNA. Helcellelysater af siRNA-behandlede celler blev immunoblottet til GAPDH, p62, ATG5, ATG6 eller ATG7 at vise effektiviteten af ​​siRNA udtømning (øverst). siRNA-behandlede celler blev inficeret med S. flexneri i 4 timer 40 min, faste, og mærket til kvantitativ mikroskopi. Grafer (nederst) repræsenterer middelværdien% ± SEM af Shigella inde SEPT2 bure fra n ≥3 eksperimenter pr behandling. (B) HeLa-celler blev inficeret med S. flexneri, behandlet med DMSO, cytochalasin D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazol (NOCO) eller Blebbistatin (Bleb), og efter 4 timer 40 min blev fikseret og mærket til kvantitativ mikroskopi. Grafer repræsenterer middelværdien% ± SEM af Shigella inde SEPT2 bure fra to uafhængige forsøg per behandling. Disse tal er blevet ændret fra Mostowy m.fl. 7.

Figur 3
Figur 3. zebrafisk model af Shigella-infektion. (A), der illustrerer orienteringen af zebrafisk larve under stereomikroskop. (Venstre panel) zebrafisk larver 72 timer efter befrugtning var placeret sideværts i injektionen plade med deres dorsalsiden vender kanylen. (Midterste panel) infektion i blodet blev udført ved injecting bakterierne (rød opløsning) i halevenen, posteriort for urogenitale åbning. (Højre panel) Infektion i halen musklen blev udført ved injektion af bakterier (rød opløsning) over et somit. (B) Overlevelseskurver af 72 timer efter befrugtning larver injiceret med forskellige doser af S. flexneri og inkuberet ved 28 ° C i 48 timer efter infektion. Den effektive inokulum blev klassificeret som lav (<10 3 CFU, åbne cirkler), medium (~ 4 x 10 3 CFU, åbne trekanter) eller høj (~ 10 4 CFU, åbne pladser). Mean% ± SEM (vandrette stænger) fra n ≥3 eksperimenter pr inokulum klasse. (C) Tælling af levende bakterier i homogenater fra de enkelte larver på forskellige tidspunkter efter infektion målt ved udpladning på LB Bemærk, kun larver har overlevet infektionen er inkluderet i optællingen analyse. Middel ± SEM (vandrette stænger), også vist. (D) Fordeling af GFP- Shigella bestemt vedlevende billeddannelse ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop på forskellige tidspunkter efter infektion med en lav, medium eller høj dosis inokulum (caudale intravenøse injektioner). Overlay for overførsel billede (grå) og GFP-fluorescens (grøn) (B) -. (D) Disse tal er blevet ændret fra Mostowy m.fl. 19.

Figur 4
Figur 4. cellebiologi af Shigella-infektion in vivo. (A) zebrafisk larver blev inficeret i halen musklen med GFP- Shigella (lav dosis) i 24 timer, fikseret, mærket med antistoffer mod SEPT7 (rød) og GFP (grønt ) og afbildet ved konfokal mikroskopi. Målestokken blev 5 um. (B) GFP-Lc3 zebrafisk larver inficeret med mCherry- Shigella (medium dosis) i4 timer, faste, mærket med antistoffer mod mCherry (rød) og til GFP (grøn) og afbildet ved konfokal mikroskopi. . Målestokken, 1,5 um (C) zebrafisk larver behandlet med enten kontrol (Ctrl; billedet til venstre) eller P62 (højre billede) morpholinos blev inficeret med GFP- Shigella i 4 timer (middel dosis), fast, mærket med antistoffer mod SEPT7 ( rød) og GFP (grønt) og afbildet ved konfokal mikroskopi. Pile fremhæve nogle eksempler på Shigella indesluttet i septin bure (CTRL) eller ej (P62 forarmet) en 4 timer efter infektion. Scale bar, 5 um. Disse tal er blevet ændret fra Mostowy m.fl. 19.

Discussion

Ved overvågning autofagi og cytoskelettet in vitro ved anvendelse vævskulturceller, kan de protokoller, der er beskrevet i afsnit 1 og 2 anvendes til en bred vifte af vævskultur celletyper. Desuden følger autophagy (f.eks ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) og cytoskelet (f.eks. Actin haler, septin bure) dynamik i realtid i løbet af Shigella-infektion med levende billeddannelse, kan vævsdyrkningsceller transficeres forbigående hjælp GFP-, RFP- eller FFP-mærkede konstruktioner som tidligere beskrevet 7,8. At øge andelen af celler inficeret med Shigella (dvs. generelt ønskeligt for real-time analyse overvejer at Shigella kan invadere 5-30% af HeLa-celler ved 100:. 1 MOI), direkte tilsættes 400 ul af Shigella (OD600 = 0,3 -0.6) til celler i 2 ml MEM (serum-udsultet), og vent mindst 1,5 timer efter infektion tilstrækkelig bakteriel indrejse, flygte fra fagosomet, replikation, AUtophagy anerkendelse og septin bure. Alternativt kan man anvende Shigella M90T AfaI stamme, der udtrykker adhesin AfaE og har meget højere invasion evner i epitelceller i forhold til M90T stamme 28. Af note, M90T AfaI stamme er endnu ikke blevet testet in vivo ved hjælp af zebrafisk. Plader af Shigella kolonier kan opbevares ved 4 ° C i 2-3 dage og anvendes til flere eksperimenter. Men over tid, kolonier af Shigella, der har mistet virulensplasmidet kan også absorbere Congorødt og synes at have bevaret deres virulensplasmid. Af denne grund anbefaler vi at bruge friske bakterielle bestande, når det er muligt.

Ved overvågning af cellebiologi infektion in vivo, protokoller, der er beskrevet i punkt 3 og 4 anvendelse vildtype AB linjen zebrafisk. For at overvåge Shigella -leukocyte interaktioner, kan transgene zebrafisk linjer skal anvendes, f.eks, MPX: GFP eller LYZ: dsRed til visuelize neutrofiler 19,29,30 eller MPEG1: mcherry at visualisere makrofager 19,31. At visualisere autofagi in vivo, kan GFP-Lc3 zebrafisk transgene linje 19,24 bruges som beskrevet i afsnit 3.8.

At forstyrre autofagi in vivo, er den effektive morfolino oligonukleotid dosis skal vurderes eksperimentelt baseret på dens effektivitet til at hæmme afskrift splejsning eller protein oversættelse. Det er tilrådeligt at udføre en titrering eksperiment og bekræfte udtømning ved RT-PCR (for splejs morpholino oligonukleotid) eller ved SDS-PAGE (til translationel morpholino oligonukleotid) 32. RNA-isolering fra zebrafisk embryoner eller larver kan udføres under anvendelse af guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion. At udvinde protein fra zebrafisk larver (8 til 15 larver / rør), mekanisk homogeniseres ved hjælp af pistil i 200 pi lysisbuffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylphenol ethylenoxid Kondense og proteasehæmmer). Centrifugerør ved 19.000 xg ved 4 ° C i 15 minutter og overføres supernatanten til et nyt rør. Tilføj Laemmli puffer og opvarmes prøven ved 95 ° C i 15 min. Lysater kan opbevares ved -80 ° C indtil brug, og kan evalueres ved Western blotting som beskrevet i afsnit 2.3.

Zebrafisken er en fremragende model for in vivo-lægemiddel ansøgning. Analyse ved hjælp af morpholino oligonukleotider kan suppleres med etablerede medicin til at manipulere autofagi (fx rapamycin og bafilomycin). Ikke-inficerede og / eller inficerede larver kan behandles med rapamycin (1,5 uM) eller bafilomycin (80 nM) fortyndet i E2 og autophagic flux kan vurderes ved Western blotting som beskrevet i 25,33. Konsekvensen af ​​autofagi manipulation på resultatet af infektion og overlevelse af de inficerede larver kan vurderes som beskrevet i afsnit 3.5.

Ud over at studere værtscelledeterminanter, in vitro og in vivo protokoller kan anvendes til at vurdere bakterielle determinanter, der kræves for autophagy anerkendelse, ved hjælp af bakterielle mutantstammer, der er forskelligt anerkendt af autophagy, f.eks., Shigella ΔicsA (Shigella proteinet ICSA rekrutterer N-WASP og derefter ARP2 / 3 for actin hale og septin bur stiftelse i sit fravær kan der ikke være nogen actin haler, ingen septin bure) og ShigellaΔicsB (Shigella undgår autophagic svar via bakterielle effektor proteiner IcsB, der forhindrer rekruttering af autofagi maskiner til ICSA, i sit fravær Der kan være flere septin bure, mere autofagi) 7,8.

Shigella er ikke en naturlig patogen af zebrafisk og vokser optimalt ved 37 ° C. Hidtil er der dog vist, at virulensfaktorer kræves for Shigella invasion, flygte fra den fagocytiske vacuole og replikation i cytosol kan udtrykkes og er funktionelle i zebrafisk larver ved 28 ° C 19. 28 ° C er den mest almindeligt anvendte temperatur for zebrafisk opdræt og standard temperatur for at sikre normal zebrafisk udvikling 23. Bemærkelsesværdigt er de vigtigste patogene begivenheder, der fører til shigellose i mennesker (dvs. makrofag celledød, invasion og multiplikation i epitelceller, celle-til-celle-spredning, inflammatorisk ødelæggelse af værtens epitel) trofast gengivet i zebrafisk model af Shigella infektion 19.

Autofagi og Cytoskeleton gener ubikvitært udtrykt og har et bredt spektrum af biologiske funktioner. Museforsøg har vist, at knockout af væsentlig autofagi 26 eller septin gener 5 er embryonale dødbringende, og det er sandsynligt, at nogle af disse gener også vil være afgørende for zebrafisk udvikling (selv om dette problem kan reduceres ved, at zebrafisk har flereparalogous gener 33). Hvis ja, er der flere alternativer til at løse dette problem, herunder (i) brug af farmakologiske reagenser til at regulere autofagi og cytoskelettet, (ii) morpholinos kan titreres ned, kan (iii) knockout af gener være konstrueret til kun bestemt celle typer, og / eller (iv) gener involveret i autophagic erkendelse af, at der ikke er afgørende for udvikling af dyr (f.eks., p62) kan målrettes.

Mens zebrafisk er en ideel model for at undersøge autofagi og cytoskelettet under Shigella-infektion, er molekylære værktøjer øjeblikket mangler. Feltet har brug for at generere nye værktøjer og drev celle konkret udtryk for de proteiner af interesse. At banke ned udtryk for autofagi / Cytoskeleton gener er nye morpholinogrupper sekvenser, der kræves, og nye metoder til genom teknik (f.eks Talen, CRISPR / Cas9) kan også anvendes. I mellemtiden, tidligere flere værktøjer genereret for mennesker eller museforsøgkan ligeledes arbejde for zebrafisk.

De intracellulære bakterier S. flexneri har vist sig som en ekstraordinær modelorganisme at tage fat på centrale spørgsmål i biologi, herunder evnen af bakterier til at blive genkendt af immunsystemet 1,2. Værtscellen anvender septins at begrænse motilitet S. flexneri og målrette dem til autophagy, en kritisk komponent i celle autonom immunitet 7,8. Disse observationer tyder på en ny molekylær rammer at studere autofagi og dets evne til at nedbryde cytosoliske bakterier. Et stort problem er nu fuldt ud at dechifrere de underliggende molekylære og cellulære begivenheder, og at validere disse begivenheder analyseret in vitro under bakteriel infektion in vivo anvendelse af relevante dyremodeller. Til dette formål har zebrafisk blevet etableret som en værdifuld ny vært til analyse af S. flexneri infektion 19. Interaktioner mellem bakterier og værtsceller kan afbildes ved høj opløsning, ogzebrafisk modellen skal vise sig nyttig for forståelsen af cellebiologi af Shigella-infektion in vivo. Zebrafisk larver kan bruges til at undersøge, hvilken rolle af bakteriel autofagi i vært forsvar, og arbejde har vist, at der den forstyrrelse af autofagi negativt kan påvirke vært overlevelse som reaktion på Shigella-infektion 19.

De bemærkninger, der genereres fra studiet af Shigella, septin anbringelse i bur og autofagi in vitro ved anvendelse vævsdyrkningsceller og in vivo ved hjælp af zebrafisk larver kan give betydelige fremskridt i forståelsen vært forsvar. De kunne også foreslå udviklingen af ​​nye strategier til bekæmpelse af smitsomme sygdomme.

En kritisk Formålet med rapporten er at give mening for de molekylære og cellulære begivenheder analyseret in vitro (dvs. autofagi, aktin haler, septin anbringelse i bur) under bakteriel infektion in vivo i forbindelse med en entire organisme ved hjælp af zebrafisk larver. Hvis ikke bekendt med zebrafisk biologi og håndtering, kan man henvise til i dybden protokoller for korrekt zebrafisk dyrehold 23 og in vivo analyser af zebrafisk infektion 19,35.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Arbejdet i SM laboratorium understøttes af en Wellcome Trust Research Karriereudvikling Fellowship [WT097411MA].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4 (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4 (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. , (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. , 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).

Tags

Infektion ATG8 / LC3 autophagy cytoskelettet HeLa-celler P62 septin, Zebrafisk
Anvendelse af<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; For at studere autofagi-Cytoskeleton interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon,… More

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter