Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

שימוש של doi: 10.3791/51601 Published: September 9, 2014

Summary

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

Abstract

flexneri Shigella הוא הפתוגן תאיים שיכול לברוח מphagosomes להגיע cytosol, ופלמר המארח יקטין שלד תא כדי לקדם את תנועתיות וההפצה שלה. עבודה חדשה הראתה כי חלבונים מעורבים בתנועתיות המבוסס על אקטין גם צמודים לautophagy, תהליך פירוק תאיים חיוני לחסינות אוטונומית תא. באופן מפתיע, תאי מארח עלולים למנוע תנועתיות המבוסס על תקטין של ס ' flexneri ידי מידור חיידקים "כלובי septin 'בתוך ולמקד אותם לautophagy. תצפיות אלו מצביעות על כך שהבנה של septins מלאה יותר, משפחה של חלבוני קושרי GTP סיביים, תספק תובנות חדשות על התהליך של autophagy. דו"ח זה מתאר פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד תא הנגרמות על ידי ס ' flexneri במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה. פרוטוקולים אלה מאפשרים חקירה של mechanis תאיתms ששולט הפצת חיידקים ברמת האורגניזם המולקולרית, תאית, וכל.

Introduction

flexneri Shigella, חיידק enteropathogenic פולשנית גראם שלילי, יכול לברוח מphagosomes לcytosol, ופלמר cytoskeleton אקטין המארח להתחמק תגובות חיסוניות cytosolic ולקדם תנועת התוך ובין תאית 1,2. למרות ההבנה של תנועתיות מבוססות אקטין במבחנה 3,4, המנגנונים המגבילים את הפצת חיידקי in vivo לא הוגדרו באופן מלא. הדבר זה הוא קריטי להבנה של חסינות מולדת והגנת מארחת מלאה יותר.

Septins, משפחה שמורה ביותר של חלבונים בין metazoans, היא אדנוזין guanosine (GTP) -binding חלבונים שיותכו מתחמי הטרו oligomeric וליצור חוטים פולריים שמקשרים עם ממברנות תאים ו5,6 שלד התא. מחקר שנערך לאחרונה גילה כי תאי מארח נגועים יכולים למנוע תנועתיות המבוססת אקטין Shigella על ידי חיידקי מידור הממוקדים לautoph"כלובי septin 'AGY בתוך, חושפים את המנגנון התאי הראשון שמנטרל תנועתיות המבוססת אקטין 7,8. שדה פתוח לרווחה של חקירה נמצא כיום ב'ביולוגיה septin וזיהום ". הרכבה Septin, הנגרמת על ידי מגוון רחב של גורמי מחלה (למשל, חיידקים ליסטריה 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, קנדידה אלביקנס 11), עשויה להתגלות כנושא מרכזי בהגנת מארחת 5,12.

Autophagy, תהליך פירוק תאיים שמור ביותר, נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים בגלל יכולתה לספק חיידקי cytosolic ל13,14 הליזוזום. עם זאת, התפקיד של autophagy חיידקי in vivo כדי להגביל או לקדם שכפול חיידקים נשאר גרוע הבין 15,16. דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חוליות לחקר הזיהומים כי זה אופטי נגישבשלבי הזחל כאשר מערכת החיסון המולדת היא כבר פונקציונלית 17,18. מחקר שנערך לאחרונה אפיין את הרגישות של זחלי דג הזברה לס flexneri, הפרדיגמה לautophagy חיידקי 15, והשתמשה במודל זיהום -zebrafish Shigella ללמוד המניפולציה של autophagy לטיפול אנטיבקטריאלי in vivo 19.

דוח זה מספק כלים ומבחנים ללמוד ס חדשים אינטראקציות flexneri עם autophagy ושלד התא. בשלב ראשון, פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד התא מתוארים באמצעות זיהום Shigella של שורת תאי אפיתל האנושית הלה. כדי להעריך את התפקיד של אינטראקציות autophagy-שלד תא בתהליך זיהום Shigella במבחנה, שיטות לתמרן autophagy ורכיבי שלד תא (באמצעות siRNA או חומרים כימיים תרופתיים) מסופקים. עבודה חדשה הראתה כי על ידי השימוש בo זיהום Shigellaזחלי דג הזברה f, ניתן ליישם מבחני דומים ללמוד הביולוגיה של התא של זיהום בגוף חי. פרוטוקולים להכין ולהדביק זחלי דג הזברה הם מפורטים, ולהעריך את תגובת המארח לזיהום Shigella in vivo, פרוטוקולים כדי לקבוע הישרדות מארח וניטל חיידקים של זחלים נגועים מסופקות. שיטות לניטור הגיוס של סמני septin וautophagy לShigella (באמצעות זחלי דג הזברה קבועים או חיים) ושיטות על מנת לבחון את תפקידם של תהליכים אלה in vivo [באמצעות oligonucleotides morpholino (הזריק ב1-4 עובר שלב תא) או חומרים כימיים תרופתיים ( הוספתי ישירות למים באמבטית דג הזברה)] הם דנו גם. תכנית זו של העבודה צפויה לספק תובנות לתוך המנגנונים הנדרשים לשליטה בזיהום על ידי תגובות מארחות cytosolic.

Protocol

1 הניטור Autophagy והנוגדנים במבחנה באמצעות תאים בתרבית הרקמה

  1. הכן ס flexneri
    1. צלחת ס flexneri M90T (wild-type) ממניות גליצרול -80 מעלות צלזיוס על Red קונגו tryptic סויה קזאין צלחת אגר (TCS). דגירה הלילה בשעה 37 C °. אותו הצלחת יכולה לשמש לכמה ניסויים.
    2. פיק מושבה בודדת ולגדול ב8 מ"ל תקשורת TCS שייקר לילה בשעה 37 ° C.
      הערה: קונגו כריכה אדומה מצביעה על כך שפלסמיד הארסיות נשמר.
    3. לתת חיידקים לגידול מעריכי, לחסן TCS הטרי עם תרבות חיידקי הלילה בשעה 1/80 דילול ולגדול שבייקר על 37 מעלות צלזיוס לOD 600 = .3-.6.
    4. ספין תת חיידקי XG ב 1000 למשך 5 דקות. שטוף את הכדור עם MEM ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 5 דקות. לשקם את הכדור ב MEM לOD 600 = 0.3-.6.
  2. הכן הלה Cells לזיהום
    1. לגדל תאי הלה ב'בינוני מלא ', כלומר., MEM בתוספת L-alanyl-L-גלוטמין בתוספת פירובט מ"מ 1 נתרן, 0.1 פתרון חומצת אמינו חיוני מ"מ, ו10% עוברי עגל בסרום.
    2. פלייט 1-1.5 x 10 5 תאים ב6 גם צלחות 24 או 48 שעות לפני שהניסוי יתחיל. צלחת על coverslips זכוכית 6 צלחות גם למיקרוסקופיה, או צלחת על 35 מנות תחתית כוס מ"מ להתכונן להדמיה לחיות.
      הערה: (. למשל, זנבות אקטין, כלובי septin) כדי לעקוב autophagy (למשל, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) ושלד תא דינמיקה בזמן אמת במהלך זיהום Shigella באמצעות הדמיה חיה, תאים בתרבית רקמה ניתן transfected זמני באמצעות GFP-, RFP- או בונה CFP מתויג (ראה דיון).
  3. זיהום
    1. להדביק תאים עם 100: זיהום 1 ריבוי (משרד הפנים) של Shigella (OD 600 = 0.3-.6) בדילול מלא בMEM; להוסיף ישירות לתאי הלה מצופים ב6-wצלחות ell 24 - 48 שעות לפני ההדבקה (כאמור בסעיף 1.2) ב2 מ"ל MEM (סרום מורעב).
    2. על מנת למקסם את דבקות חיידקים לארח תאים, חיידקים ותאי צנטריפוגות בXG 700 10 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר צנטריפוגה, דגירה למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאפשר זיהום להמשיך.
    3. שטוף תאים נגועים פעמיים עם MEM הטרי ודגירה עם מדיום גנטמיצין המכיל מלא (50 מיקרוגרם / מ"ל, כדי לחסל את החיידקים תאיים) ל1-4 שעות בהתאם לניסוי.
  4. תיקון וסימון תאי הלה מאשרום למיקרוסקופי
    1. שטוף תאים נגועים פעמיים עם PBS 1x, ולתקן עבור 15min בparaformaldehyde 4% ב1x PBS בטמפרטורת חדר. כדי להסיר paraformaldehyde, תאים לשטוף 2x עם 1x PBS.
    2. דגירה תאים קבועים באמוניום כלוריד 50 מ"מ ל10 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף פעם עם 1x PBS, וpermeabilize תאים לדקות 4 עם 0.1% עיבוי אתילן אוקסיד octylphenol בt החדרemperature.
      הערה: חלופות לoctylphenol עיבוי אתילן אוקסיד לpermeabilization, כגון saponin או מתנול, יכול להיות מיושם לשימור של מבנים תאיים 20 שונה.
    3. שטפו תאים ב1x PBS ו דגירה בתא רטוב עם נוגדנים ראשוניים כנגד מרכיבים קריטיים autophagy (למשל, p62 / SQSTM1) או שלד תא septin (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9, וSEPT11 באים לידי ביטוי בתאי הלה) ל30 דקות (ב בטמפרטורת חדר) ללילה (בשעה 4 ºC).
    4. שטפו תאים פעמיים עם 1x PBS ו דגירה בתא רטוב עם נוגדנים משני, ולתייג אקטין פילמנטיות (F-אקטין) עם phalloidin, ל30 דקות (בטמפרטורת חדר) ללילה (ב 4 מעלות צלזיוס). להכתמה של מארח גרעין תא להוסיף 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    5. שטוף תאים ב1x PBS והר coverslips הזכוכית בשקופיות באמצעות הרכבה בינונית.
  5. הדמיה מיקרוסקופית של תאי הלה מאשרום
    1. לתמונת infתאי ected להשתמש epifluorescence או מיקרוסקופ confocal ואובייקטיבי 63X או 100X לזהות Shigella שכותרתו DAPI.
      הערה: כפי שמוצג באיורי 1 א - 1C, יכולים להיות דמיינו כלובי septin כטבעת כמו מבנים, ~ 0.6 מיקרומטר בקוטר, המקיפים את חיידקי cytosolic polymerizing אקטין וגיוס סמני autophagy (למשל, p62 וLC3) 7,8. לעומת זאת, חיידקי polymerizing זנבות אקטין לא יהיו ממודרים על ידי כלובי septin ולא להיות ממוקד לautophagy 7,8.
    2. באמצעות epifluorescence או מיקרוסקופ confocal ואובייקטיבי 63X או 100X, לכמת את מספר החיידקים תאיים לכל שדה מיקרוסקופי. גם לכמת את מספרם של חיידקים וממולכד בכלובי septin וממוקד לautophagy, או polymerizing זנבות אקטין ונמלט autophagy.
    3. כדי לקבוע את האחוז של חיידקים וממולכד בכלובי septin או זנבות אקטין polymerizing, לנקוט בשורת תמונת Z-ערימת infected תאים, תמונות תהליך ולספור לפחות 500-1,000 חיידקים לניסוי מלפחות 3 ניסויים בלתי תלויים.

.2 ניתוח פונקציונלי של Autophagy והנוגדנים במבחנה

הערה: גנטי והן גישות תרופתיים יכולות לשמש ללטרוד autophagy בתאים בתרבית רקמה נגועים, ואת ההשפעה של טיפולים אלה על מהלך הזיהום יכול להיות במעקב.

  1. השתקה בתיווך siRNA
    1. פלייט 0.8 x 10 5 תאי הלה על coverslips זכוכית 6 צלחות גם במדיום שלם.
    2. Transfect למחרת באמצעות מגיב transfection שומנים מבוסס עם siRNA כנגד autophagy ו / או סמני שלד תא.
    3. לאחר תקופה הרצויה של דגירה, להדביק את התאים עם Shigella כפי שתואר בסעיף 1.3.
    4. לתקן ולתייג את התאים כמתואר בסעיף 1.4.
  2. מניפולציה תרופתית
    למשל, לdepolymerize שימוש cytoskeleton אקטין cytochalasin B D או latrunculin, לdepolymerize microtubules להשתמש nocodazole, לחסום blebbistatin שימוש פעילות actomyosin, או לשבש forchlorfeneuron שימוש הרכבה septin. Autophagy יכול להיות מגורה על ידי שימוש בrapamycin או חסום באמצעות bafilomycin.
    1. כדי לתפעל את שלד התא במהלך זיהום Shigella, להדביק הראשון את התאים עם Shigella כפי שתואר בסעיף 1.3 ולאפשר מספיק זמן לחיידקים להיכנס לתאים ולברוח מphagosome לcytosol (למשל.,> 1.5 לאחר זיהום hr).
    2. לדלל את התרופות מפתרון המניות [פתרון מניות התלויות בsulfoxide דימתיל (DMSO)] בMEM לריכוז סופי של 5 M (D cytochalasin, B latrunculin, nocodazole), ז 20 (forchlorfeneuron) או 50 M (blebbistatin), ו טיפול בתאים 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. הסכום הכולל של תרופה (הנפח של DMSO / דתערובת שטיח) הוסיפה לכל צלחת / בקבוקון של תאים הוא 1-5 μl (תלוי בפתרון מניות) ל2 מ"ל של תקשורת. פנק את התאים עם מנה דומה של DMSO בדילול מלא בMEM כביקורת שלילית.
    3. לתקן ולתייג את התאים כמתואר בסעיף 1.4.
      הערה: למניפולציה של שטף autophagic (בתאים נגועים או noninfected), להאריך טיפול תרופתי באמצעות rapamycin (20 ננומטר) או bafilomycin (160 ננומטר) בין 4 ל 12 שעות.
  3. מערבי כתם
    הערה: פעילות autophagic ניתן לכמת על ידי מדידת רמת החלבון של סמני autophagy כגון p62 וLC3.
    1. לאחר תקופה הרצויה של דגירה, לאסוף וlyse התאים לimmunoblotting. תמציות חלבון לרוץ על ג'לי acrylamide 8, 10, או 14%.
    2. שטף autophagic, כלומר. שיעור autophagy, ניתן לנתח כפי שמתואר ב21,22.
  4. הדמיה וכימות מיקרוסקופית
    1. באמצעות epifluorescence או מיקרוסקופ confocal ואובייקט 100X 63X אוive, ההשפעה של siRNA או הטיפול תרופתי בזיהום Shigella יכול להיות מוערך על ידי מיקרוסקופיה כמותית (כלומר, ספירה של autophagosomes, כלובי septin וזנבות אקטין) כמפורט בסעיף 1.5 ומוצגים ב2A דמויות ו2B.

.3 בVivo ההדמיה של ס ' flexneri אינטראקציות עם Autophagy והנוגדנים

הערה: מודל דג הזברה של זיהום Shigella יכול לשמש כדי לחקור כליאת septin וautophagy in vivo 19.

  1. הכן ס flexneri
    1. תרבות S. flexneri כפי שתואר בסעיף 1.1.
    2. בOD 600 = .3-.6, הספין תת חיידקים 8 מ"ל ב 1,000 XG עבור 10 דקות. שטוף את הכדור עם 1x PBS ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 10 דקות.
    3. Resuspend גלולה ב80 μl של פנול 0.1% 1x האדום PBS להשיג ~ 2,000 חיידקים / NL. שמור bactהכנת erial על קרח כדי להאט את הצמיחה.
      הערה: הוספת פנול אדום תסייע להמחיש את הבידוד כאשר הזרקה לתוך הזחלים.
  2. הכן דג הזברה זחלים להזרקה
    הערה: דג הזברה מונחות כמו ביצים ומזוהות כעוברים עד 72 שעות לאחר הפריה, כאשר הם נקראים זחלים.
    1. להתרבות דג הזברה מבוגרת כפי שמתואר בוסטרפילד 23 על ידי הצבת 4 זכרים ונקבות 8 (בדרך כלל 2: יחס 1) לאקווריום נפרד עם התחתית מכוסות בגולות (שימנע מבוגרים מאכילת הביצים הולידו). לחלופין, למקם את סלי אוסף ביצה בתוך טנקי הרבייה בלילה שלפני.
      הערה: ביצים מופרות ~ 30 דקות אחרי שהאורות נדלקים במתקן דג הזברה 23, ויש לאסוף בהקדם האפשרי כדי למנוע צמיחת עובש. סלי אוסף ביצה ישמשו כדי לאסוף את הביצים כדי שהם יוכלו לקצור בקלות וגם להגן על הביצים ממבוגרים.
    2. לאסוף את העוברים ולנקות אותם על ידי שטיפה בתקשורת עובר (E2) עם אקונומיקה 0.003% עבור 10 דקות. הסר E2 עם אקונומיקה, לשטוף עוברים פי 5 במדיום E2, ולגדול את העוברים ב10 סנטימטר צלחת פטרי (100 עוברים / 50 בינוני מ"ל E2) בשעה 28 ° C.
    3. אם עובר או זחלים ישמש למחקרי מיקרוסקופיה, ב24 שעות לאחר הפריה להוסיף 0.003% N-phenylthiourea למדיום E2 כדי למנוע melanization. שמור את העוברים ב28 ºC להתפתחות נורמלית.
      הערה: זחלי דג הזברה מוכנות לזיהום ב72 שעות לאחר הפריה.
    4. לנוהלי זיהום ומיקרוסקופיה, להרדים זחלי דג הזברה ב200 g / ml tricaine בE2.
  3. הכנה של דג הזברה זחלים לתוך ורידים וזיהום מקומי
    הערה: כדי להעריך הישרדות דג הזברה במהלך זיהום Shigella, לבצע זריקות תוך ורידי זנב. כדי להמחיש את הגיוס של סמני septin וautophagy לShigella, לבצע זיהום באתרים מקומיים כגון השרירים הזנב.
    1. להזרקה תוך ורידית זנב, למקם את הזחלים הרדימו רוחבי עם הצד הגבי מול המחט. כפי שניתן לראות באיור 3 א, המקום הקרוב קצה מחט (האחורי) לפתיחה ואברי המין, במטרה לוריד הזנב, ולחדור את העור ולספק את מנת חיידקים הרצויה (נפח הזרקה 1-5 NL).
      הערה: זיהום תוך ורידים הוא מאתגר לבצע וייקח כמה שבועות של אימונים כדי להרגיש בנוח עם הליך זה. הזרקת פנול אדום (ללא חיידקים) לאימונים תעזור להעריך את אתר ההזרקה כראוי.
      הערה: במקרה של Shigella, ניסויים תלויים מינון הראו כי זיהום במינון נמוך (<1,000 CFU) מנוקה בתוך 48 שעה, וזיהום במינון גבוה (> 4,000 CFU) מוביל לארח תמותה בתוך 48 שעה 19.
    2. לזיהום שריר זנב, למקם את הזחלים הרדימו כאמור בסעיף 3.3.1. כפי שניתן לראות באיור 3 א, למקם את carefull המחטy מעל somites שריר (כלומר, קטעים של שרירי שלד) ולהזריק נפח קטן (כלומר., NL 1) להכנת חיידקים.
  4. הזרקה תוך ורידית של חיידקים בזחלים
    1. משוך microcapillaries זכוכית בורוסיליקט כפי שמתואר ב24.
    2. חבר מחט לבעל מניפולטור הידני הגס תלת ממדים ולשבור את קצה המחט עם פינצטה בסדר.
    3. כדי לטעון את המחט, במקום ירידה של תרבית חיידקים על coverslip. הפעל את גליל microinjector וגז, מעט להטביע את קצה המחט לתוך הירידה, ולמלא את המחט עם הכמות הרצויה של הכנת חיידקים.
    4. כדי לכייל את עוצמת הזריקה, מקום טיפה של שמן מינרלים בלהחליק את המכסה ולהזריק את הכנת החיידקים. מדוד את הקוטר של הירידה באמצעות מיקרומטר ולחשב את הנפח המוזרק [V = (4/3) πr 3].
      הערה: שימוש בהגדרות הזרקה של 40 psi ו50 אלפיות שניות עם bacteriהכנת אל כפי שתוארה בסעיף 3.1 תיתן ~ 2,000 CFU / NL.
    5. הכן את צלחת ההזרקה באמצעות תבנית פלסטיק כפי שמתואר בוסטרפילד 23.
    6. העבר את הזחלים לצלחת ההזרקה ולסדר אותן תוך שימוש במכחול דק. אוריינט ולהזריק את הזחלים כאמור בסעיף 3.3.1.
    7. להערכת הישרדות דג הזברה, זחלי העברה נגועה בנפרד ב24 גם צלחות ב1 מ"ל של E2 / היטב דגירה על 28 מעלות צלזיוס. לפקח על הזחלים הנגועים יומי ל2-5 הימים הקרובים והישרדות עלילה לאורך הזמן (איור 3 ב).
  5. ציפוי דג הזברה זחלים לכימות בקטריאלי
    הערה: עבודה תחת מכסה המנוע סטרילית כדי למנוע זיהום.
    1. כדי להעריך את מספרם של החיידקים שהוחדרו לתוך הדגים (בשעה שלאחר זיהום 0 hr) וכימות חיידקים בנקודות זמן רצוי, להקריב את זחלי דג הזברה עם מנת יתר של tricaine (200-500 מ"ג / ליטר). מניחים זחלים בודדים ב1.5 pol מ"לצינור microcentrifuge ypropylene עם 200 μl של .0.1% עיבוי אתילן אוקסיד octylphenol 1x PBS ומכאניים homogenize באמצעות העלי.
      הערה: כדי לאשר את עומס החיידקים בנפח ההזרקה, משאבת מינון שווה לירידת 1x PBS סטרילי וצלחת אותו החוצה.
    2. הפוך דילול סדרתי של homogenates זחלי דג הזברה במים סטריליים וצלחת על מרק lysogeny (LB) צלחות אגר. יכולים להיות מצופים זחלים לחלופין על צלחות קונגו האדום TCS להפלות בין Shigella ששמרו על פלסמיד הארסי או לא.
      הערה: פלייט 3 או דגי noninfected יותר כביקורת כדי לבדוק את המצב של זחלי דג הזברה משמשים לזיהום.
    3. לאחר דגירה הלילה של צלחות על 37 מעלות צלזיוס, לספור מושבות חיידקים. כפי שניתן לראות באיור 3 ג, מייצג באמצעות סולם יומן.
      הערה: עומס בקטריאלי במהלך הזיהום של זחלי דג הזברה יכולה גם להיות דמיין באמצעות Shigella שכותרתו fluorescently ואני מיקרוסקופיmaging כפי שתואר בסעיף 3.7 או 3.8 (איור 3D).
  6. דג הזברה הזחלים Immunostaining
    1. בנקודות זמן רצויים, להקריב את הזחלים באמצעות מנת יתר של tricaine. לאסוף את הדגים ב1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות פוליפרופילן (10 עד 20 זחלים / צינור).
    2. לתקן את הזחלים באמצעות paraformaldehyde 4% עם 0.4% עיבוי אתילן אוקסיד octylphenol ב1x PBS ו דגירה בתועמלן מסלולית (כדי למנוע אשכולות זחל) עבור שעה 2 (בטמפרטורת חדר) או לילה (4 ° C).
      הערה: מיקרוסקופי אלקטרונים יכולים לשמש לניתוחי ultrastructural של זחלי דג הזברה נגועים. במקרה זה, צריכים להיות קבוע עוברים הרדימו ומעובד על פי Mostowy et al 19.
    3. 3x לשטוף ב0.4% עיבוי אתילן אוקסיד octylphenol 1x PBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן לחסום בחסימת פתרון (10% עוברי עגל בסרום, 1% DMSO, 0.1% monolaurate polyoxyethylenesorbitan ב1x PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
    4. Diלאוטה הנוגדן הראשוני בחסימת פתרון. הוספת זחלים לנוגדן ראשוני מדולל ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס בתועמלן מסלולית. השתמש בנוגדנים עיקריים כפי שתואר לעיל בסעיף 1.4.3.
    5. שטוף את 4x הזחלים במשך 15 דקות ב0.1% monolaurate polyoxyethylenesorbitan 1x PBS בטמפרטורת חדר.
    6. לדלל את הנוגדנים משני בחסימת פתרון. הוספת זחלים לנוגדנים משני בדילול ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס בתועמלן מסלולית. השתמש באותו נוגדנים וphalloidin משניים כאמור בסעיף 1.4.4.
    7. לשטוף 4x במשך 15 דקות ב0.1% monolaurate polyoxyethylenesorbitan 1x PBS בטמפרטורת חדר. עבור מכתים של גרעיני תאי מארח להוסיף DAPI (150 ריכוז סופי ננומטר) במהלך הראשון של 15 שוטף דקות אלה.
    8. לשימור של זחלי fluorescently שכותרתו, דגירה אותם בהדרגה בשיפוע גליצרול של 15, 30, 60, ו80% ​​בדילול מלאים 1x PBS ו0.1% monolaurate polyoxyethylenesorbitan עבור שעה 2 (ברוח חדרשבמקום) ללילה (בשעה 4 מעלות צלזיוס).
      הערה: ניתן לאחסן ויטראז זחלים לפרקי זמן ארוכים בגליצרול 80% ב 4 ° C. (לדוגמא, 4 חודשים.).
  7. הדמיה מיקרוסקופית של זחלי דג הזברה קבועים
    1. העבר את הזחלים מוטבעים גליצרול הקבוע לטיפה קטנה של גליצרול 80% בצלחת 35 מ"מ פטרי (לstereomicroscopy) או צלחת זכוכית מלאה תחתונה (לmiscopy confocal).
    2. סדרת תמונת Z-ערימה של זחלים נגועים קח ולעבד את התמונות כפי שנדרש.
    3. השתמש epifluorescence או מיקרוסקופ confocal ואובייקטיבי 10X או 20X הדמיה האורגניזם כולו. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ confocal ואובייקטיבי 40X, 63X, או 100X לדמיין תאים בודדים וגיוס של autophagy ושלד תא סמנים לחיידקים בודדים in vivo 19 (איורים 4 א ו -4 ב).
      הערה: להדביק דגים בשריר הזנב והר בדירת גליצרול לאורך החלק התחתון של צלחת תחתית הכוס כדי לאפשר eaמוקד סאי.
  8. לחיות מיקרוסקופי הדמיה של זחלי דג הזברה מאשרום
    הערה: זחלים הם אופטי נגישים, כך בautophagosomes vivo ניתן דמיינו באמצעות הקו המהונדס דג הזברה GFP-Lc3 25. להדביק זחלי דג הזברה כאמור בסעיף 3.3 והר כמתואר בסעיף זה.
    1. הכן התכה נמוכה agarose 1% (LMA) בE2 ולאפשר להתקרר ל35-37 מעלות צלזיוס, כדי למנוע נזק זחלים / הריגה. הפץ טיפות של LMA בצלחת 35 מ"מ פטרי (לstereomicroscopy) או צלחת זכוכית מלאה תחתונה (למיקרוסקופיה confocal).
    2. העברה הרדימו זחלי דג הזברה בנפרד (עם מים מעט ככל האפשר) לאה"ע טיפות. זחלי אוריינט למיקום הרצוי באמצעות מכחול ולהמתין לagarose כדי לחזק.
    3. מכסה את פני השטח כולו מנה עם אה"ע, וכיסוי עם E2 המכיל tricaine / מ"ל ​​200 מיקרוגרם, כדי למנוע את ההכנה מהתייבשות וכדי לאפשר דגים להחליף חמצן מהמים.
    4. השתמש epifluorescence או מיקרוסקופ confocal ואובייקטיבי 10X או 20X הדמיה זחלי דג הזברה כולו. השתמש במיקרוסקופ confocal ואובייקטיבי 40X, 63X, או 100X לדמיין authopagosomes חיידקים (כלומר, GFP-Lc3 + ve וקואולות מקיפה Shigella) in vivo.
    5. קח את Z-ערימה של זחלים נגועים לאורך זמן (למשל., כל 2 דקות על פני כמה שעות) כדי להמחיש autophagosomes, והדינמיקה שלהם, בזמן אמת.

.4 ניתוח פונקציונלי של Autophagy והנוגדנים בVivo

הערה: ההשפעה של הפרעות תרופתיים וגנטיות של autophagy על מהלך הזיהום יכולה להיות במעקב ברמה השלם של בעלי החיים, והן ברמה של התא הבודד.

  1. מניפולציה autophagy ידי הזרקת morpholino
    1. מחדש morpholino oligonucleotides במים סטריליים לפתרון מניות של 1 מ"מ על ידי ההתחממות על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חנותבטמפרטורת חדר.
      הערה: morpholino זריקות oligonucleotide חייבת להתבצע ב1-4 עובר שלב תא.
    2. הכן morpholino פתרון עובד oligonucleotide עם פנול אדום 0.1% סטרילי בופר פוספט של Dulbecco. טען את המחט כפי שתואר בסעיף 3.4.2., Morpholino oligonucleotide נפח הזרקה יכול להיות מכויל כאמור בסעיף 3.4.3.
      הערה: פנול אדום יעזור לדמיין את הנפח המוזרק.
    3. הכן תא עובר-מיצוב (כלומר., שקופיות מיקרוסקופ דבוקות עם cyanoacrylate על מיכסה צלחת פטרי 10 סנטימטר עם קצוות מול המחט הוסרו באופן חלקי). העבר את 1-4 עובר שלב תא לתא עם כמות קטנה של מים וליישר אותם עם מכחול דק.
    4. לחדור סיסית וחלמון בצורה חלקה. ברגע שנכנס, לחץ על הדוושה כדי להזריק את הנפח הרצוי של פתרון oligonucleotide morpholino.
      הערה: מזער את הנפח של הזרקה ל0.5-2 NL; כרכי tha גבוה יותרn 5 nl עלול לגרום למומים התפתחותיים ולהגביר תמותת ביצה.
    5. לאחר microinjection, עוברים נקיים (על ידי הלבנה כפי שתוארו בסעיף 3.2) דגירה אותם בצלחת פטרי עם E2 על 28 מעלות צלזיוס.
    6. להדביק 72 שליטה לאחר הפריה שעה (כלומר, זחלי דג הזברה הוזרקו לי oligonucleotide morpholino שליטה) או morphants p62 (כלומר., זחלי דג הזברה הוזרקו לי oligonucleotide morpholino p62) עם Shigella כפי שתוארו בסעיף 3.4. להעריך הישרדות וניטל חיידקים ל2-5 הימים הקרובים כאמור בסעיף 3.5. תמונה קבועה זחלי דג הזברה כאמור בסעיף 3.7 ומודגש באיור 4C, או תמונה המתגוררת זחלי דג הזברה כאמור בסעיף 3.8.
      הערה: מנת oligonucleotide morpholino היעילה ניתן להעריך על סמך היעילות שלה כדי לעכב שחבור תמליל או תרגום חלבון (ראה דיון).

Representative Results

עם הזיהום של תאים בתרבית רקמה במבחנה, ס ' flexneri יכול לברוח מphagosome ולפלוש cytosol. בcytosol, תאי מארח יכולים למנוע את תנועתיות המבוסס על אקטין של Shigella ידי מידור חיידקים בתוך כלובי septin (איור 1 א). חיידקים וממולכד על ידי כלובי septin יכולים גם להיות מתויגים על ידי p62 סמני autophagy (איור 1) וLC3 (איור 1 ג). תצפיות אלו מדגישות מנגנון חדשני של הגנת מארחת המגביל את ההפצה של גורמי מחלה פולשנית, וגם לחשוף את הקישורים חדשים בין autophagy ושלד התא. באופן מפתיע, הדלדול של סמני autophagy מפחית באופן משמעותי כליאת septin של חיידקים (איור 2 א), והעבודה הראתה גם כי הדלדול של כליאת septin מפחית גיוס של סמני autophagy 8 באופן משמעותי. כך, לפחות במקרה של Shigella, septin הרכבה כלוב וformatio autophagosomeניתן לצפות n כתהליכים תלויים זה בזה. דרישות סלולריות אחרות למידור של Shigella ידי כלובי septin כוללות פילמור אקטין ופעילות actomyosin (איור 2).

אין מודל טבעי עכבר של shigellosis, וחקירה של הפתוגנזה Shigella, ביולוגיה septin וautophagy חיידקי in vivo יכול להפיק תועלת ממודל חדש של בעלי חיים של זיהום, זחלי דג הזברה 19. אפשר להדביק זחלי דג הזברה על ידי הזרקת חיידקים באתרים אנטומיים שונים כגון זריקות זנב תוך ורידי לניסויי הישרדות, וזריקות שריר זנב למיקרוסקופיה in vivo (איור 3 א). בהתאם למינון, ס ' flexneri מוזרק בזחלי דג הזברה יכולה גם להיות מסומנת בתוך לאחר זיהום 48 שעות, או עלול לגרום לזיהום מתקדם וסופו של דבר קטלני (3B מספרים - 3D). fa ארסיות Shigellactors באים לידי ביטוי ב28 ° C, טמפרטורת הצמיחה האופטימלית של דג הזברה, וזיהום דג הזברה על ידי Shigella תלוי אך ורק על מערכת ההפרשה מהסוג III שלה (T3SS) 19, הקובע ארסיות חיונית במחלות של בני אדם. יחד צילום, תצפיות אלה מצביעים על כך שזחל דג הזברה מייצג מארח חדש בעל ערך לניתוח vivo של זיהום Shigella.

הנגישות האופטית של זחלי דג הזברה מאפשרת הדמיה של כליאת septin in vivo (איור 4 א), הישג ​​שמעולם לא לפני הושג תוך שימוש במודלי מארח יונקים. כדי להשלים את ההוכחה לכך שכלובי septin ללכוד את החיידקים ממוקדים לautophagy in vivo, אחד יכול להדביק את זחלי דג הזברה מהונדסים להביע GFP-Lc3 ולבחון גיוס סמן autophagy לShigella (איור 4). לניתוח ultrastrucutral של autophagosomes Shigella in vivo, אלמיקרוסקופיה ectron יכולה לשמש כדי להראות את תפיסת cytosolic של חיידקים על ידי וקואולות קרום כפולה 19 בבירור. Autophagy נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים ומנגנון הגנה חיוני מפני חיידקי intracytosolic 14-16. לאפיין פונקצית autophagy in vivo, ניתן להשתמש בם זחלי דג הזברה שטופל morpholino p62. בניגוד למכונות autophagy הליבה [לדוגמא., 36 חלבוני autophagy קשורים (ATGs) 26], p62 הוא לא חיוני להתפתחות של בעלי החוליות 27 וזחלים וכך דג הזברה יכול להתפתח בצורה תקינה לפני ההדבקה. באופן מפתיע, זחלים מדולדלים p62 מחוסן עם ס ' תוצאת flexneri בסיכון מוגבר לתמותה באופן משמעותי וניטל חיידקים מוגבר 19. בהסכם עם עבודה במבחנה מראה שהרכבת כלוב septin הוא תלות הדדית עם היווצרות autophagosome 7,8, גיוס septin לShigella מצטמצם באופן ברור בזחלים מדולדלים p62 (

איור 1
איור 1 כלוב septin במבחנה. () תאי הלה היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT9 וphalloidin, וצלם על ידי microcopy confocal. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר תאי הלה (B). נדבקו עם ס ' flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לp62 וSEPT2, וצלם על ידי מיקרוסקופ אור הניאון. סרגל קנה מידה, 1 תאים (C) הלה מיקרומטר. היו transfected עם GFP-ATG8 / LC3, נגוע בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT2, וצלמתי על ידי מיל אור הניאוןcroscopy. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל.

איור 2
.2 דרישות איור נייד להיווצרות כלוב -septin Shigella. () טופלו תאי הלה עם שליטה (CTRL), p62, ATG5, ATG6 או ATG7 siRNA. lysates כל התא של תאים שטופלו-siRNA היה immunoblotted לGAPDH, p62, ATG5, ATG6, או ATG7 להראות את היעילות של דלדול siRNA (למעלה). תאים שטופל siRNA היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, ומתויג למיקרוסקופיה כמותית. גרפים (תחתון) מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 מn ≥3 ניסויים לטיפול. (B) תאי הלה היו נגועים בס flexneri, שטופל בDMSO, cytochalasin D (CytD), B latrunculin (LatB), nocodazole (Noco), או blebbistatin (בועה) ולאחר 4 שעות 40 דקות היו קבועות ומתויגות למיקרוסקופיה כמותית. גרפים מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 משני ניסויים בלתי תלויים לטיפול. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל.

איור 3
איור 3 מודל דג הזברה של זיהום Shigella. תמונות () כדי להמחיש את הכיוון של זחל דג הזברה תחת סטראו. (לוח שמאלי) זחלי 72 הודעה hr הפריה דג הזברה הוצבו רוחבי בצלחת ההזרקה עם צד הגב שלהם מול מחט הזריקה. זיהום (פנל התיכון) בזרם דם בוצע על ידי injecting החיידקים (פתרון אדום) בוריד הזנב, אחורי לפתיחה ואברי המין. זיהום (פנל מימין) בשריר הזנב בוצע על ידי הזרקת החיידקים (פתרון אדום) מעל somite. (B) עקומות הישרדות של זחלים שלאחר הפריה 72 שעה מוזרק במינונים שונים של ס ' flexneri וטופחו על 28 מעלות צלזיוס במשך לאחר זיהום 48 שעות. הבידוד היעיל סווג כנמוך (<10 3 CFU, חוגים פתוחים), בינוני (~ 4 x 10 3 CFU, משולשים פתוחים) או (~ 10 4 CFU, ריבועים פתוחים) הגבוה. אומר% ± SEM (פסים אופקיים) מn ≥3 ניסויים בכיתה הבידוד. (C) ספירת חיידקים חיים בhomogenates מזחלים בודדים בזמנים שונים לאחר הזיהום שנמדד על ידי ציפוי על ק"ג הערה, רק זחלים ששרדו את הזיהום כלולים בניתוח ספירה. הממוצע ± SEM (פסים אופקיים) מוצג גם. (ד) הפצה של GFP- Shigella שנקבע על ידיהדמיה בשידור חי באמצעות סטראו ניאון בזמנים שונים לאחר הזיהום באמצעות מדיום, או הבידוד נמוך, במינון גבוה (זנב זריקות תוך ורידי). כיסוי של תמונת שידור (אפורה) וקרינת GFP (ירוק) (ב) -. (ד ') נתונים אלה שונים מMostowy et al 19.

איור 4
איור 4 הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה () היו נגוע בשריר הזנב עם GFP- Shigella (מינון נמוך) ל24 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 (אדום) ולGFP (ירוק ), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. זחלי דג הזברה (B) GFP-Lc3 היו נגועים בmCherry- Shigella (מינון בינוני) ל4 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד mCherry (אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. . סרגל קנה מידה, 1.5 מיקרומטר (C) זחלי דג הזברה שטופלו באו שליטה (CTRL; תמונה משמאל) או p62 (תמונה מימין) morpholinos היה נגוע בGFP- Shigella ל4 שעה (מינון בינוני), קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 ( אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. חיצים להדגיש כמה דוגמאות של Shigella וממולכד בכלובי septin (CTRL) או לא (p62 מדולדל) לאחר זיהום 4 שעות. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et al 19.

Discussion

כאשר ניטור autophagy ושלד התא במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים מפורטים בסעיפי 1 ו -2 למגוון רחב של סוגי תרבית רקמת תא. יתר על כן, כדי לעקוב autophagy (למשל, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) ושלד תא (לדוגמא., זנבות אקטין, כלובי septin) דינמיקה בזמן אמת במהלך זיהום Shigella באמצעות הדמיה חיה, תאים בתרבית רקמה ניתן transfected זמני באמצעות GFP-, מבני RFP- או CFP מתויג כמו בעבר תיארו 7,8. כדי להגדיל את אחוז התאים הנגועים בShigella (כלומר, בדרך כלל רצוי לניתוח בזמן אמת בהתחשב בכך שShigella יכול לפלוש 5-30% מתאי הלה ב100:. 1 משרד הפנים), להוסיף ישירות 400 μl של Shigella (OD 600 = 0.3 -0.6) לתאים ב2 מ"ל MEM (רעב לסרום) ולחכות לפחות 1.5 לאחר זיהום שעה לכניסת חיידקים מספיק, לברוח מphagosome, שכפול, auהכרת tophagy והקמה כלובי septin. לחלופין, ניתן להשתמש במתח Shigella M90T אפאי, המבטא את adhesin AfaE ויש לי את יכולות פלישה הרבה יותר גבוהות בתאי האפיתל בהשוואה לזן M90T 28. ראוי לציין, מתח M90T אפאי טרם נבדק in vivo באמצעות דג הזברה. צלחות של מושבות Shigella יכולות להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים ומשמשות לכמה ניסויים. עם זאת, לאורך זמן, מושבות של Shigella שאיבדו את הפלסמיד הארסיות גם יכול לספוג אדום קונגו ונראה שיש לי שמר פלסמיד ארסיותם. מסיבה זו אנו ממליצים להשתמש במניות חיידקים טריות במידת האפשר.

כאשר ניטור הביולוגיה של התא של זיהום in vivo, פרוטוקולים מתוארים בסעיפי 3 ו דג הזברה שורת 4 שימוש wildtype AB. כדי לפקח על אינטראקציות -leukocyte Shigella, ניתן להשתמש בקווים דג הזברה מהונדסים, למשל, MPX: GFP או, liz: DsRed לחזותייםize נויטרופילים 19,29,30 או MPEG1: mCherry לדמיין מקרופאגים 19,31. כדי להמחיש autophagy in vivo, הקו המהונדס דג הזברה GFP-Lc3 19,24 יכול לשמש כמפורט בסעיף 3.8.

להפריע autophagy in vivo, מינון oligonucleotide morpholino היעיל יש להעריך באופן ניסיוני המבוסס על יעילותה לעכב שחבור תמליל או תרגום חלבון. מומלץ לבצע ניסוי טיטרציה וכדי לאשר את הדלדול על ידי RT-PCR (לoligonucleotide morpholino אחוי) או על ידי SDS-PAGE (לoligonucleotide morpholino translational) 32. בידוד RNA מעוברים או זחלי דג הזברה יכול להתבצע באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium. כדי לחלץ חלבון מזחלי דג הזברה (8 עד 15 זחלים / צינור), מכאני homogenize באמצעות העלי ב200 מאגר תמוגה μl (1 מ 'טריס, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 0.01% condensat אתילן אוקסיד octylphenolדואר, ומעכבי פרוטאז). צנטריפוגה צינורות ב19,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש. הוסף חוצץ Laemmli ולחמם את המדגם על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ניתן לאחסן lysates ב -80 מעלות צלזיוס עד צורך, ויכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כאמור בסעיף 2.3.

דג הזברה הוא מודל מצוין לin vivo יישום תרופה. ניתוח באמצעות oligonucleotides morpholino יכול להיות כהשלמה עם סמים הוקמו כדי לתפעל autophagy (למשל, rapamycin וbafilomycin). זחלים נגוע ו / או נגועים יכולים להיות מטופלים עם rapamycin (1.5 מיקרומטר) או bafilomycin (80 ננומטר) בדילול מלא בE2 ושטף autophagic יכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כפי שמתואר ב25,33. התוצאה של המניפולציה autophagy על התוצאה של הזיהום וההישרדות של הזחלים הנגועים ניתן להעריך כאמור בסעיף 3.5.

בנוסף ללימוד תא מארחגורמים, במבחנה ובפרוטוקולי vivo יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך גורמי חיידקים הנדרשים להכרה autophagy, באמצעות זני מוטציה חיידקים שמוכרים באופן דיפרנציאלי על ידי autophagy, למשל., Shigella ΔicsA (חלבון Shigella ICSA מגייס N-WASP ולאחר מכן Arp2 / 3 לזנב אקטין והיווצרות כלוב septin; בהעדרו לא יכול להיות זנבות אקטין, ללא כלובים septin) וShigellaΔicsB (Shigella ימנע את תגובת autophagic באמצעות חלבון חיידקי מפעיל IcsB, המונע את הגיוס של מכונות autophagy לICSA; בהיעדרו לא יכול להיות יותר כלובי septin, יותר autophagy) 7,8.

Shigella הוא לא הפתוגן טבעי של דג הזברה וגדל בצורה אופטימלית על 37 C °. עם זאת, עבודה הראתה כי גורמים ארסי הנדרשים לפלישת Shigella, לברוח מvacuole phagocytic ושכפול בCYtosol יכול לבוא לידי ביטוי והם פונקציונליים בזחלי דג הזברה ב28 ° C 19. 28 ° C הוא הטמפרטורה הנפוצה ביותר לגידול דג הזברה וטמפרטורה סטנדרטית על מנת להבטיח התפתחות דג הזברה נורמלית 23. באופן מפתיע, האירועים המרכזיים פתוגניים שיובילו לshigellosis בבני אדם (כלומר, מוות של תאי מקרופאג, פלישה וכפל בתוך תאי אפיתל, התפשטות תא אל התא, ההרס דלקתי של האפיתל המארח) הם בתמונות בנאמנות במודל דג הזברה של זיהום Shigella 19.

גני autophagy ושלד תא בכל מקום באים לידי ביטוי ויש מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. מחקרי עכבר הראו נוקאאוט זה של autophagy החיוני 26 או septin גנים 5 הם קטלניים עובריים, וסביר להניח שחלק מהגנים הללו יהיה גם חיוני להתפתחות דג הזברה (אם כי בעיה זו עשויה להיות מופחתת על ידי העובדה שיש לי דג הזברה מרובהגני paralogous 33). אם כן, קיימות מספר חלופות כדי להתגבר על בעיה זו, כולל (i) השימוש בחומרים כימי תרופתיים לווסת autophagy ושלד התא, (ii) ניתן טיטרציה למטה morpholinos, (iii) בנוקאאוט של גנים יכול להיות מיועד לרק תא מסוים סוגים, ו / או (iv) גני המעורבים בהכרת autophagic שאינם חיוניים להתפתחות של בעלי חיים (לדוגמא., p62) עשוי להיות ממוקד.

בעוד דג הזברה היא מערכת מודל אידיאלית לחקור autophagy ושלד התא במהלך זיהום Shigella, כלים מולקולריים כרגע חסרים. השדה צריך ליצור כלים חדשים וביטוי ספציפי תא כונן של חלבוני עניין. להפיל ביטוי של גני autophagy / שלד תא, רצפי morpholino חדשים נדרשים, ושיטות חדשניות להנדסת הגנום (למשל, Talen, CRISPR / Cas9) יכול לשמש גם. בינתיים, מספר כלים שנוצרו בעבר למחקרים בבני אדם או בעכברייתכן באותה מידה לעבוד עבור דג הזברה.

החיידקים תאיים ס flexneri התפתח כאורגניזם מודל יוצא דופן כדי לטפל בבעיות מרכזיות בביולוגיה, לרבות היכולת של חיידקים כדי להיות מוכרת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. התא המארח מעסיק septins להגביל את תנועתיות של ס ' flexneri ולמקד אותם לautophagy, מרכיב קריטי של חסינות אוטונומית תא 7,8. מקרים אלה מצביעים על מסגרת מולקולרית חדשה ללמוד autophagy ויכולתה כדי לבזות חיידקי cytosolic. נושא עיקרי הוא עכשיו לפענח באופן מלא את האירועים מולקולריים ותאיים הבסיסיים, וכדי לאמת את האירועים הללו ניתחו במבחנה במהלך זיהום חיידקי in vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים רלוונטיים. לשם כך, דג הזברה כבר נקבע כמארח חדש בעל ערך לניתוח של ס ' זיהום flexneri 19. יחסי גומלין בין חיידקים ותאי מארח ניתן הדמיה ברזולוציה גבוהה, ומודל דג הזברה צריך להוכיח שימושי להבנת הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה יכולים לשמש כדי לחקור את תפקידו של autophagy חיידקים בהגנת מארחת, והעבודה הוכיחה כי שההפרעות של autophagy יכולות להשפיע לרעה על הישרדות מארח בתגובה לזיהום Shigella 19.

התצפיות שנוצרו ממחקר של Shigella, septin כליאה וautophagy במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית הרקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה עשויה לספק התקדמות יסודית בהבנת הגנת מארחת. הם גם יכולים להציע את הפיתוח של אסטרטגיות חדשות שנועדו להילחם במחלות זיהומיות.

מטרה קריטית של דו"ח זה היא הגיוני של האירועים המולקולריים ותאיים ניתחו במבחנה (כלומר, autophagy, זנבות אקטין, septin כליאה) במהלך זיהום חיידקי in vivo בהקשר של אף אוזן גרוןהאורגניזם זעם, תוך שימוש בזחלי דג הזברה. אם לא מכיר את ביולוגיה וטיפול דג הזברה, אחד עשוי להתייחס בפרוטוקולי עומק לגידול דג הזברה נכון 23 ובניתוח vivo של זיהום דג הזברה 19,35.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה במעבדה SM נתמכת על ידי בקריירה מחקר פיתוח [WT097411MA] מלגת Wellcome Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4, (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4, (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2, (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61, (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5, (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25, (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).
שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).More

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter