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Immunology and Infection

का प्रयोग करें doi: 10.3791/51601 Published: September 9, 2014

Summary

रोगाणु प्रसार प्रतिक्रिया, मेजबान कोशिकाओं बैक्टीरिया compartmentalize और भोजी प्रेरित करने के लिए उनके cytoskeleton पुनर्निर्माण. टिशू कल्चर कोशिकाओं, मेजबान और इस प्रक्रिया अंतर्निहित रोगजनक निर्धारकों का उपयोग करना शिगेला संक्रमण की पहचान की और विशेषता है. शिगेला संक्रमण के zebrafish मॉडल का प्रयोग, खोज अणुओं और तंत्र की भूमिका विवो में जांच कर रहे हैं.

Abstract

शिगेला flexneri cytosol तक पहुँचने के लिए phagosomes से बचने, और अपनी गतिशीलता और प्रसार को बढ़ावा देने के cytoskeleton actin मेजबान भाजन कर सकते हैं कि एक intracellular रोगजनक है. नए काम actin आधारित गतिशीलता में शामिल प्रोटीन भी भोजी, सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के लिए महत्वपूर्ण एक intracellular गिरावट प्रक्रिया से जुड़े होते हैं कि दिखाया गया है. आश्चर्यजनक, मेजबान कोशिकाओं एस के actin आधारित गतिशीलता रोक सकता बैक्टीरिया के अंदर 'septin पिंजरों' compartmentalizing और भोजी उन्हें लक्षित करके flexneri. इन टिप्पणियों septins की एक और पूरी समझ, filamentous जीटीपी बाध्यकारी प्रोटीन का एक परिवार, भोजी की प्रक्रिया में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि संकेत मिलता है. यह रिपोर्ट एस के कारण भोजी-cytoskeleton बातचीत पर नजर रखने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन flexneri इन विट्रो टिशू कल्चर कोशिकाओं का उपयोग और इन विवो में zebrafish लार्वा का उपयोग. इन प्रोटोकॉल intracellular mechanis की जांच सक्षम, आणविक सेलुलर, और पूरे जीव स्तर पर बैक्टीरिया के प्रसार को नियंत्रित कि एमएस.

Introduction

शिगेला flexneri, एक ग्राम नकारात्मक आक्रामक enteropathogenic जीवाणु, cytosol को phagosomes से बचने, और साइटोसोलिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने और अंतर और कहनेवाला आंदोलन 1,2 बढ़ावा देने के लिए मेजबान actin cytoskeleton भाजन कर सकते हैं. इन विट्रो 3,4 में actin आधारित गतिशीलता की समझ के बावजूद, विवो में बैक्टीरिया के प्रसार को सीमित तंत्र पूरी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है. यह सहज प्रतिरक्षा और मेजबान रक्षा की एक और पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है.

Septins, मेटाजोअन बीच प्रोटीन की एक अत्यधिक संरक्षित परिवार, असमलैंगिक oligomeric परिसरों में इकट्ठा और सेलुलर झिल्ली और cytoskeleton 5,6 के साथ संबद्ध है कि nonpolar तंतु कि फार्म प्रोटीन -binding ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी) कर रहे हैं. हाल ही में काम संक्रमित मेजबान कोशिकाओं autoph को लक्षित compartmentalizing बैक्टीरिया द्वारा शिगेला actin आधारित गतिशीलता रोका जा सकता है की खोज की हैactin आधारित गतिशीलता 7,8 counteracts कि पहले सेलुलर तंत्र खुलासा AGY अंदर 'septin पिंजरों',. जांच की एक विस्तृत खुले मैदान अब 'septin जीव विज्ञान और संक्रमण' में निहित है. रोगजनकों की एक किस्म से प्रेरित Septin विधानसभा, (उदाहरण के लिए, लिस्टेरिया monocytogenes 7,9,10, माइकोबैक्टीरियम marinum 7,8, कैंडिडा सफेद 11), मेजबान रक्षा 5,12 में एक महत्वपूर्ण मुद्दे के रूप में उभर सकता है.

भोजी, एक अत्यधिक संरक्षित intracellular गिरावट प्रक्रिया, क्योंकि लाइसोसोम 13,14 को साइटोसोलिक बैक्टीरिया वितरित करने के लिए अपनी क्षमता का सेल स्वायत्त उन्मुक्ति का एक प्रमुख घटक के रूप में देखा जाता है. हालांकि, विवो में जीवाणु भोजी की भूमिका को सीमित या खराब 15,16 समझा रहता बैक्टीरियल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के लिए. यह ऑप्टिकली सुलभ है क्योंकि zebrafish (Danio rerio) संक्रमण के अध्ययन के लिए एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में उभरा हैलार्वा चरणों में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली पहले से ही 17,18 कार्यात्मक है. हाल ही में काम एस के लिए zebrafish लार्वा की संवेदनशीलता विशेषता है flexneri, जीवाणु भोजी 15 के लिए एक प्रतिमान है, और इन विवो 19 में जीवाणुरोधी उपचार के लिए भोजी के हेरफेर का अध्ययन करने के शिगेला -zebrafish संक्रमण मॉडल का इस्तेमाल किया गया है.

यह रिपोर्ट नए उपकरणों और एस अध्ययन करने के लिए assays प्रदान करता है भोजी और cytoskeleton साथ flexneri बातचीत. पहले कदम में, प्रोटोकॉल भोजी-cytoskeleton बातचीत मानव उपकला कोशिका लाइन हेला के शिगेला संक्रमण का उपयोग वर्णित हैं पर नजर रखने के लिए. इन विट्रो में शिगेला संक्रमण प्रक्रिया पर भोजी-cytoskeleton बातचीत की भूमिका का आकलन करने के लिए, तरीकों प्रदान की जाती हैं भोजी और (siRNA या औषधीय अभिकर्मकों का उपयोग) cytoskeleton घटकों में हेरफेर करने के लिए. नए काम शिगेला संक्रमण ओ का उपयोग करके दिखा दिया है किच zebrafish लार्वा, इसी तरह assays vivo में संक्रमण की कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. प्रोटोकॉल तैयार करने और zebrafish लार्वा विस्तृत हैं संक्रमित, और इन विवो में शिगेला संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, प्रोटोकॉल मेजबान अस्तित्व और संक्रमित लार्वा की बैक्टीरियल बोझ प्रदान की जाती हैं यह निर्धारित करने के लिए. (तरीके (या तय रह zebrafish लार्वा का उपयोग) शिगेला को septin और भोजी मार्कर की भर्ती की निगरानी करने के लिए और तरीके [morpholino (1-4 सेल चरण भ्रूण में इंजेक्ट) oligonucleotides या औषधीय अभिकर्मकों का उपयोग vivo में इन प्रक्रियाओं की भूमिका का परीक्षण करने के लिए zebrafish नहाने के पानी को सीधे जोड़ा)] भी चर्चा कर रहे हैं. काम के इस कार्यक्रम साइटोसोलिक मेजबान प्रतिक्रियाओं से संक्रमण के नियंत्रण के लिए आवश्यक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की उम्मीद है.

Protocol

1 निगरानी भोजी और इन विट्रो में cytoskeleton टिशू कल्चर कोशिकाओं का उपयोग

  1. एस तैयार flexneri
    1. प्लेट एस एक कांगो लाल पर -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से flexneri M90T (जंगली प्रकार) कैसिइन सोया (टीसीएस) अगर प्लेट tryptic. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. एक ही थाली कई प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. एक व्यक्ति कॉलोनी उठाओ और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक प्रकार के बरतन में 8 मिलीग्राम टीसीएस मीडिया में हो जाना.
      नोट: बंधन कांगो लाल डाह प्लाज्मिड बनाए रखा गया है कि इंगित करता है.
    3. घातीय वृद्धि के लिए बैक्टीरिया उपसंस्कृति के लिए, 1/80 कमजोर पड़ने पर रातोंरात जीवाणु संस्कृति के साथ ताजा टीसीएस टीका लगाना और = 0.3-0.6 600 आयुध डिपो के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में हो जाना.
    4. 5 मिनट के लिए 1000 XG पर बैक्टीरिया उपसंस्कृति स्पिन. 5 मिनट के लिए 1000 XG पर सदस्य और अपकेंद्रित्र के साथ गोली धो लें. = 0.3-0.6 600 आयुध डिपो को सदस्य में गोली पुनर्गठित.
  2. हेला प्रमाणित तैयारसंक्रमण के लिए LLS
    1. 'पूरा मध्यम', यानी में हेला कोशिकाओं को विकसित., सदस्य प्लस एल alanyl-एल glutamine 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.1 मिमी अनावश्यक अमीनो एसिड समाधान, और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक.
    2. प्रयोग शुरू होने से पहले 6 अच्छी तरह प्लेटें 24 में 1-1.5 x 10 5 कोशिकाओं या 48 घंटा प्लेट. कांच माइक्रोस्कोपी के लिए 6 अच्छी तरह प्लेटों में coverslips, या 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन पर प्लेट पर प्लेट लाइव इमेजिंग के लिए तैयार करने के लिए.
      नोट: (. जैसे, actin पूंछ, septin पिंजरों) भोजी का पालन करने के लिए जी इमेजिंग का उपयोग शिगेला संक्रमण के दौरान वास्तविक समय में और cytoskeleton गतिशीलता (जैसे, ATG8 / LC3 autophagosomes ve +), टिशू कल्चर कोशिकाओं क्षणिक, GFP- का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है RFP- या पाकिस्तानी टैग निर्माणों (चर्चा देखें).
  3. संक्रमण
    1. 100 के साथ कोशिकाओं को संक्रमित: संक्रमण के 1 बहुलता (MOI) शिगेला की (600 आयुध डिपो = 0.3-0.6) सदस्य में पतला; सीधे 6-W में चढ़ाया HELA कोशिकाओं को जोड़ने(सीरम भूखे) सदस्य 2 मिलीलीटर में (धारा 1.2 में वर्णित है) के संक्रमण को 48 घंटा पूर्व - 24 पक्ष प्लेटें.
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 700 XG पर कोशिकाओं, अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया और कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए जीवाणु पालन अधिकतम करने के लिए. Centrifugation के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और संक्रमण आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. ताजा सदस्य के साथ दो बार संक्रमित कोशिकाओं को धो लें और 1-4 घंटा प्रयोग पर निर्भर करता है के लिए (कोशिकी बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल) जेंटामाइसिन युक्त पूरा मध्यम के साथ सेते हैं.
  4. माइक्रोस्कोपी के लिए संक्रमित HELA कोशिकाओं फिक्सिंग और लेबलिंग
    1. 1x पीबीएस के साथ दो बार संक्रमित कोशिकाओं को धो लें, और कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde में 15min के लिए तय. Paraformaldehyde निकालने के लिए, धोने कोशिकाओं 1x पीबीएस के साथ 2x.
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 50 मिमी अमोनियम क्लोराइड में तय कोशिकाओं को सेते हैं. कमरे टी में 0.1% octylphenol ethylene ऑक्साइड घनीभूत के साथ 4 मिनट के लिए कोशिकाओं 1x पीबीएस के साथ एक बार धोएं, और permeabilizeemperature.
      नोट: वैकल्पिक ऐसे सैपोनिन या मेथनॉल के रूप में, permeabilization के लिए ethylene ऑक्साइड घनीभूत octylphenol करने, सेलुलर संरचनाओं 20 के विभिन्न संरक्षण के लिए लागू किया जा सकता है.
    3. पर (1x पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें और 30 मिनट के लिए (जैसे, p62 / SQSTM1) या septin cytoskeleton (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9, और SEPT11 HELA कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं) भोजी महत्वपूर्ण घटकों के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ गीला कक्ष में सेते रात भर के लिए कमरे के तापमान) (4 डिग्री सेल्सियस पर).
    4. (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए रात भर (कमरे के तापमान पर) 30 मिनट के लिए, phalloidin साथ filamentous actin (एफ actin) 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ गीला कक्ष में सेते हैं, और लेबल. मेजबान के धुंधला के लिए सेल नाभिक 4 ", 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) जोड़ें.
    5. 1x पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें और बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड पर कांच coverslips माउंट.
  5. संक्रमित HELA कोशिकाओं के सूक्ष्म इमेजिंग
    1. छवि inf के लिएected कोशिकाओं एक epifluorescence या confocal खुर्दबीन और DAPI लेबल शिगेला की पहचान करने के लिए एक 63X या 100X उद्देश्य का उपयोग करें.
      नोट: आंकड़े 1 ए में दिखाया गया है - 1 सी, septin पिंजरों, संरचनाओं की तरह अंगूठी के रूप में देखे जा सकते हैं ~ actin polymerizing और भोजी मार्कर (जैसे, p62 और LC3) 7,8 भर्ती साइटोसोलिक बैक्टीरिया आसपास के व्यास में 0.6 मीटर,. इसके विपरीत, actin पूंछ polymerizing बैक्टीरिया septin पिंजरों से बंटे होने नहीं देंगे और 7,8 भोजी के लिए लक्षित नहीं किया जाएगा.
    2. एक epifluorescence या confocal खुर्दबीन और एक 63X या 100X उद्देश्य का उपयोग, सूक्ष्म क्षेत्र प्रति intracellular जीवाणुओं की संख्या यों. इसके अलावा बैक्टीरिया septin पिंजरों में फँस और भोजी को निशाना बनाया, या actin पूंछ polymerizing और भोजी भागने की संख्या यों.
    3. Infe का एक z ढेर छवि श्रृंखला ले, septin पिंजरों या polymerizing actin पूंछ में फँस बैक्टीरिया का प्रतिशत निर्धारित करने के लिएकोशिकाओं, प्रक्रिया छवियों cted और कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रयोग कम से कम प्रति 500-1,000 बैक्टीरिया गिनती.

भोजी और cytoskeleton इन विट्रो में 2 कार्यात्मक विश्लेषण

नोट: आनुवंशिक और औषधीय दृष्टिकोण संक्रमित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में भोजी उपद्रव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और नजर रखी जा सकती संक्रमण के पाठ्यक्रम पर इन उपचार के प्रभाव दोनों.

  1. siRNA मध्यस्थता मुंह बंद
    1. पूरा मध्यम में 6 अच्छी तरह प्लेटों में कांच coverslips पर 0.8 x 10 5 HELA कोशिकाओं प्लेट.
    2. भोजी और / या cytoskeleton मार्करों के खिलाफ siRNA साथ एक लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर अगले दिन Transfect.
    3. खंड 1.3 में वर्णित के रूप में ऊष्मायन के वांछित अवधि के बाद, शिगेला के साथ कोशिकाओं को संक्रमित.
    4. फिक्स और धारा 1.4 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं लेबल.
  2. भेषज हेरफेर
    जैसे, औषधीय चालाकी से किया जा सकता है. भोजी rapamycin का उपयोग करके उत्तेजित या bafilomycin का उपयोग करके अवरुद्ध किया जा सकता है.
    1. बैक्टीरिया कोशिकाओं में प्रवेश और cytosol को फेगोसोम से बचने के लिए पहले पर्याप्त समय खंड 1.3 में वर्णित के रूप में शिगेला के साथ कोशिकाओं को संक्रमित और अनुमति देते हैं, शिगेला संक्रमण के दौरान cytoskeleton में हेरफेर करने के लिए (जैसे.,> 1.5 घंटा के बाद संक्रमण).
    2. 5 एम (cytochalasin डी, latrunculin बी, nocodazole), 20 एम (forchlorfeneuron) या 50 एम (blebbistatin) के अंतिम एकाग्रता के लिए सदस्य में [डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में निलंबित शेयर समाधान] शेयर समाधान से दवाओं पतला, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट का इलाज. दवा की कुल राशि (DMSO / डी की मात्रागलीचा मिश्रण) / कोशिकाओं की शीशी मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रति शेयर समाधान के आधार पर 1-5 μl () है थाली प्रति गयी. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सदस्य में पतला DMSO के एक समान मात्रा के साथ कोशिकाओं का इलाज.
    3. फिक्स और धारा 1.4 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं लेबल.
      नोट: (संक्रमित या noninfected कोशिकाओं में) autophagic प्रवाह में हेरफेर के लिए, 12 घंटा के लिए 4 से rapamycin (20 एनएम) या bafilomycin (160 एनएम) का उपयोग दवा इलाज का विस्तार.
  3. वेस्टर्न ब्लाट
    नोट: Autophagic गतिविधि ऐसे p62 और LC3 रूप भोजी मार्करों के प्रोटीन के स्तर को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
    1. ऊष्मायन के वांछित अवधि के बाद, इकट्ठा करने और immunoblotting के लिए कोशिकाओं lyse. 8, 10, या 14% acrylamide जैल पर चलने प्रोटीन अर्क.
    2. यानी Autophagic प्रवाह,. 21,22 में वर्णित के रूप में भोजी की दर का विश्लेषण किया जा सकता है.
  4. सूक्ष्म इमेजिंग और मात्रा का ठहराव
    1. एक epifluorescence या confocal खुर्दबीन और एक 63X या 100X वस्तु का उपयोगIve, शिगेला संक्रमण पर siRNA के प्रभाव या दवा इलाज मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (यानी, autophagosomes, septin पिंजरों और actin पूंछ की गिनती) खंड 1.5 में वर्णित है और आंकड़े 2A और 2B में दिखाया गया है.

एस के vivo इमेजिंग में 3 भोजी और cytoskeleton साथ flexneri सहभागिता

नोट: शिगेला संक्रमण के zebrafish मॉडल विवो 19 में septin caging और भोजी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. एस तैयार flexneri
    1. संस्कृति एस flexneri के रूप में खंड 1.1 में वर्णित है.
    2. आयुध डिपो 600 = 0.3-0.6, 10 मिनट के लिए 1000 XG पर स्पिन 8 मिलीलीटर बैक्टीरियल उपसंस्कृति में. 10 मिनट के लिए 1000 XG पर 1x पीबीएस के साथ गोली और अपकेंद्रित्र धो लें.
    3. ~ 2,000 बैक्टीरिया / नाथन प्राप्त करने के लिए 0.1% फिनोल लाल 1x पीबीएस के 80 μl में गोली Resuspend. BACT रखेंबर्फ पर erial तैयारी वृद्धि को धीमा करने के लिए.
      नोट: फिनोल लाल जोड़ना लार्वा में इंजेक्शन जब inoculum कल्पना करने में मदद मिलेगी.
  2. इंजेक्शन के लिए zebrafish लार्वा की तैयारी
    नोट: Zebrafish अंडे के रूप में रखी हैं और वे लार्वा कहा जाता है जब 72 घंटे बाद निषेचन जब तक भ्रूण के रूप में पहचाने जाते हैं.
    1. (कि पैदा अंडे खाने से वयस्कों को रोकने जाएगा) पत्थर के साथ कवर नीचे के साथ एक अलग मछली टैंक में: (1 अनुपात आमतौर पर एक 2) 4 पुरुष और 8 महिलाओं रखकर Westerfield 23 में वर्णित के रूप में वयस्क zebrafish नस्ल. वैकल्पिक रूप से, रात से पहले प्रजनन टैंक के अंदर अंडा संग्रह टोकरी जगह है.
      नोट: अंडे रोशनी zebrafish सुविधा 23 में पर जाने के बाद ~ 30 मिनट निषेचित कर रहे हैं, और आचारण विकास को रोकने के लिए जल्द से जल्द एकत्र किया जाना चाहिए. अंडा संग्रह टोकरी वे आसानी से काटा जा सकता है ताकि अंडे इकट्ठा और भी वयस्कों से अंडे की रक्षा के लिए काम करते हैं.
    2. भ्रूण लीजिएएस और 10 मिनट के लिए 0.003% ब्लीच के साथ भ्रूण मीडिया (E2) में धोने से उन्हें साफ. भ्रूण E2 मध्यम में 5x धोने, ब्लीच के साथ E2 निकालें, और 28 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेमी पेट्री डिश (100 भ्रूण / 50 मिलीलीटर E2 मध्यम) में भ्रूण बढ़ता है.
    3. भ्रूण या लार्वा 24 घंटे के बाद निषेचन में, माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा melanization रोकने के लिए E2 मध्यम करने के लिए 0.003% एन phenylthiourea जोड़ें. सामान्य विकास के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रखें.
      नोट: zebrafish लार्वा 72 घंटे के बाद निषेचन में संक्रमण के लिए तैयार हैं.
    4. संक्रमण और माइक्रोस्कोपी प्रक्रियाओं के लिए, E2 में 200 ग्राम / मिलीलीटर tricaine में zebrafish लार्वा anesthetize.
  3. अंतःशिरा और स्थानीय संक्रमण के लिए zebrafish लार्वा की तैयारी
    नोट:, शिगेला संक्रमण के दौरान zebrafish अस्तित्व का आकलन दुम नसों में इंजेक्शन करने के लिए. शिगेला को septin और भोजी मार्कर की भर्ती कल्पना करने के लिए, इस तरह पूंछ पेशी के रूप में स्थानीय स्थलों पर संक्रमण प्रदर्शन करते हैं.
    1. एक दुम नसों में इंजेक्शन के लिए, सुई का सामना करना पड़ पृष्ठीय पक्ष के साथ पार्श्व anesthetized लार्वा की स्थिति. चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, दुम नस के लिए लक्ष्य, मूत्रजननांगी खोलने के लिए सुई टिप करीब (पीछे) जगह है, और त्वचा बेध और वांछित बैक्टीरियल खुराक (इंजेक्शन की मात्रा 1-5 NL) पहुँचा.
      नोट: अंतःशिरा संक्रमण प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है और इस प्रक्रिया के साथ सहज प्राप्त करने के लिए प्रशिक्षण की कई सप्ताह लग जाएगा. प्रशिक्षण के लिए (बैक्टीरिया) के बिना फिनोल लाल इंजेक्शन ठीक से इंजेक्शन साइट का आकलन करने में मदद मिलेगी.
      नोट: शिगेला के मामले में, खुराक निर्भर प्रयोगों एक कम खुराक संक्रमण (<1,000 CFU) 48 घंटा के भीतर मंजूरी दे दी है, और एक उच्च खुराक संक्रमण पता चला है कि (> 4000 CFU) 48 घंटा 19 भीतर मृत्यु दर की मेजबानी की ओर जाता है.
    2. खंड 3.3.1 में वर्णित के रूप में एक पूंछ पेशी संक्रमण के लिए, anesthetized लार्वा की स्थिति. चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, सुई carefull जगहपेशी somites (कंकाल की मांसपेशी यानी, वर्ग) और अधिक y एक छोटी मात्रा इंजेक्षन (यानी., 1 एन) बैक्टीरियल तैयारी की.
  4. लार्वा में बैक्टीरिया की नसों में इंजेक्शन
    1. 24 में वर्णित के रूप में borosilicate ग्लास microcapillaries खींचो.
    2. तीन आयामी मोटे पुस्तिका जोड़तोड़ के धारक को सुई कनेक्ट और ठीक चिमटी के साथ सुई टिप टूट गया.
    3. सुई लोड करने के लिए, एक coverslip पर जीवाणु संस्कृति की एक बूंद रखें. थोड़ा, microinjector और गैस सिलेंडर पर स्विच ड्रॉप में सुई टिप डूब, और बैक्टीरियल तैयारी के वांछित राशि के साथ सुई भरें.
    4. इंजेक्शन की मात्रा जांच करने के लिए, एक कवर पर्ची पर खनिज तेल की एक बूंद डाल दिया है और बैक्टीरियल तैयारी इंजेक्षन. एक माइक्रोमीटर का उपयोग बूंद के व्यास उपाय और इंजेक्शन की मात्रा की गणना [वी = (4/3) πr 3].
      नोट: एक bacteri साथ इंजेक्शन 40 साई की सेटिंग और 50 मिसे का प्रयोगके रूप में अल तैयारी ~ 2,000 CFU / नाथन दे देंगे धारा 3.1 में वर्णित है.
    5. Westerfield 23 में वर्णित के रूप में एक प्लास्टिक मोल्ड का उपयोग इंजेक्शन थाली तैयार करें.
    6. इंजेक्शन थाली को लार्वा स्थानांतरण और एक ठीक तूलिका का उपयोग कर उन्हें लाइन. खंड 3.3.1 में वर्णित के रूप में ओरिएंट लार्वा इंजेक्षन और.
    7. 1 E2 के मिलीग्राम / अच्छी तरह से और में व्यक्तिगत रूप से 24 अच्छी तरह प्लेटें में zebrafish अस्तित्व, स्थानांतरण संक्रमित लार्वा के आकलन के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. समय (3B चित्रा) से अधिक दैनिक अगले 2-5 दिन और साजिश अस्तित्व के लिए संक्रमित लार्वा मॉनिटर.
  5. बैक्टीरियल मात्रा के लिए zebrafish लार्वा चढ़ाना
    नोट: संक्रमण से बचने के लिए एक बाँझ हुड के तहत काम.
    1. (समय 0 घंटा बाद संक्रमण पर) और इच्छित समय बिंदुओं पर बैक्टीरियल मात्रा का ठहराव के लिए मछली में इंजेक्शन बैक्टीरिया की संख्या का मूल्यांकन करने के लिए, tricaine की अधिक मात्रा (200-500 मिलीग्राम / एल) के साथ zebrafish लार्वा बलिदान. 1.5 मिलीलीटर पीओएल में व्यक्तिगत लार्वा रखें200 0.1% octylphenol ethylene ऑक्साइड घनीभूत 1x पीबीएस के μl और यंत्रवत् साथ ypropylene microcentrifuge ट्यूब एक मूसल का उपयोग homogenize.
      नोट:, इंजेक्शन की मात्रा में बैक्टीरियल लोड पुष्टि एक बाँझ 1x पीबीएस ड्रॉप में एक समान खुराक पंप और इसे बाहर की थाली के लिए.
    2. बाँझ पानी में zebrafish लार्वा homogenates के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ और प्लेट अगर lysogeny शोरबा (पौंड) पर थाली. लार्वा विषमय प्लाज्मिड बनाए रखा या नहीं होने शिगेला के बीच विभेद करने के लिए कांगो लाल टीसीएस प्लेटों पर वैकल्पिक रूप से चढ़ाया जा सकता है.
      नोट: थाली 3 या अधिक noninfected मछली एक नियंत्रण के रूप में संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया zebrafish लार्वा की स्थिति की जांच करने के लिए.
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की रात ऊष्मायन के बाद, बैक्टीरियल कालोनियों गिनती. चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, एक लॉग पैमाने का उपयोग प्रतिनिधित्व करते हैं.
      नोट: zebrafish लार्वा के संक्रमण के दौरान बैक्टीरियल लोड भी fluorescently लेबल शिगेला और सूक्ष्म मैं उपयोग कर देखे जा सकते हैंखंड 3.7 या 3.8 (चित्रा 3 डी) में वर्णित के रूप में maging.
  6. Zebrafish लार्वा Immunostaining
    1. वांछित समय बिंदुओं पर, tricaine की अधिक मात्रा का उपयोग लार्वा बलिदान. 1.5 मिलीलीटर polypropylene microcentrifuge ट्यूबों (10 से 20 लार्वा / ट्यूब) में मछली ले लीजिए.
    2. (4 डिग्री सेल्सियस) 2 (कमरे के तापमान पर) घंटा या रात भर के लिए (लार्वा क्लस्टरिंग से बचने के लिए) 1x पीबीएस में 0.4% octylphenol ethylene ऑक्साइड घनीभूत के साथ 4% paraformaldehyde का उपयोग लार्वा फिक्स और एक कक्षीय आंदोलनकारी में सेते हैं.
      नोट: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संक्रमित zebrafish लार्वा की ultrastructural विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, anesthetized भ्रूण Mostowy एट अल 19 के अनुसार तय की और कार्रवाई की जानी चाहिए.
    3. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस 0.4% octylphenol ethylene ऑक्साइड घनीभूत में धो 3x, तो कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (1x पीबीएस में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% DMSO, 0.1% polyoxyethylenesorbitan monolaurate) अवरुद्ध समाधान में ब्लॉक.
    4. डिवीणा अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए लार्वा जोड़ें और एक कक्षीय आंदोलनकारी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. खंड 1.4.3 में ऊपर वर्णित के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें.
    5. कमरे के तापमान पर पीबीएस 1x 0.1% polyoxyethylenesorbitan monolaurate में 15 मिनट के लिए लार्वा 4x धो लें.
    6. अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला. पतला एंटीबॉडी के लिए लार्वा जोड़ें और एक कक्षीय आंदोलनकारी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. खंड 1.4.4 में वर्णित के रूप में एक ही माध्यमिक एंटीबॉडी और phalloidin का प्रयोग करें.
    7. कमरे के तापमान पर पीबीएस 1x 0.1% polyoxyethylenesorbitan monolaurate में 15 मिनट के लिए धो 4x. मेजबान सेल नाभिक धुंधला के लिए इन 15 मिनट washes की पहली दौरान DAPI (150 एनएम अंतिम एकाग्रता) जोड़ें.
    8. Fluorescently लेबल लार्वा के संरक्षण के लिए, 15, 30, 60 के एक ग्लिसरॉल ढाल में उत्तरोत्तर उन्हें सेते हैं, और 80% कमरे गुस्सा में 2 घंटे के लिए 1x पीबीएस और 0.1% polyoxyethylenesorbitan monolaurate (में पतलाature) को रात भर () 4 डिग्री सेल्सियस पर.
      नोट: सना हुआ लार्वा को लंबे समय के लिए भंडारित किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर 80% ग्लिसरॉल में (उदाहरण के लिए, 4 महीने.).
  7. निश्चित zebrafish लार्वा की सूक्ष्म इमेजिंग
    1. एक 35 मिमी (stereomicroscopy के लिए) पेट्री डिश या (confocal miscopy के लिए) पूरा गिलास नीचे डिश में 80% ग्लिसरॉल की एक छोटी सी बूंद के लिए तय ग्लिसरॉल एम्बेडेड लार्वा स्थानांतरण.
    2. संक्रमित लार्वा के Z-ढेर छवि श्रृंखला लेने और आवश्यक के रूप में छवियों की प्रक्रिया.
    3. एक epifluorescence या confocal खुर्दबीन और पूरे जीव इमेजिंग के लिए एक 10x या 20x उद्देश्य का प्रयोग करें. फिर एक confocal खुर्दबीन और व्यक्ति की कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक 40X, 63X, या 100X उद्देश्य और भोजी की भर्ती का उपयोग करें और इन विवो में 19 व्यक्ति बैक्टीरिया को मार्करों cytoskeleton (आंकड़े -4 ए और 4 बी).
      नोट: पूंछ मांसपेशियों में मछली संक्रमित और ईए सक्षम करने के लिए गिलास नीचे पकवान के नीचे के साथ ग्लिसरॉल फ्लैट में माउंटएसवाई फोकस.
  8. संक्रमित zebrafish लार्वा की सूक्ष्म इमेजिंग जीते
    नोट: लार्वा इस प्रकार विवो autophagosomes में GFP-LC3 zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन 25 का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं, ऑप्टिकली पहुंच रहे हैं. खंड 3.3 में वर्णित है और के रूप में इस खंड में वर्णित माउंट के रूप में zebrafish लार्वा को संक्रमित.
    1. E2 में कम पिघलने 1% agarose (LMA) तैयार करें और लार्वा क्षति / हत्या से बचने के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. एक 35 मिमी (stereomicroscopy के लिए) पेट्री डिश या (confocal माइक्रोस्कोपी के लिए) पूरा गिलास नीचे डिश में LMA की बूंदों बांटो.
    2. स्थानांतरण LMA को (जितना संभव हो कम पानी के साथ) व्यक्तिगत रूप से zebrafish लार्वा anesthetized चला जाता है. एक तूलिका का उपयोग और agarose जमना के लिए इंतजार इच्छित स्थान पर ओरिएंट लार्वा.
    3. E2 बाहर सुखाने से तैयारी से बचने के लिए और मछली पानी से ऑक्सीजन का आदान प्रदान करने के लिए अनुमति देने के लिए 200 माइक्रोग्राम / एमएल tricaine युक्त साथ पूरी पकवान LMA साथ सतह, और ओवरले कवर.
    4. एक epifluorescence या confocal खुर्दबीन और पूरे zebrafish लार्वा इमेजिंग के लिए एक 10x या 20x उद्देश्य का प्रयोग करें. एक confocal खुर्दबीन और बैक्टीरियल authopagosomes कल्पना करने के लिए एक 40X, 63X, या 100X उद्देश्य का उपयोग करें विवो में (यानी, GFP-LC3 + शिगेला आसपास के रिक्तिकाएं ve).
    5. वास्तविक समय में, (उदाहरण के लिए., कई घंटे से अधिक हर 2 मिनट) समय के साथ संक्रमित लार्वा की एक z ढेर ले लो autophagosomes कल्पना करने के लिए, और उनकी गतिशीलता.

भोजी और cytoskeleton इन विवो के 4 कार्यात्मक विश्लेषण

नोट: संक्रमण के पाठ्यक्रम पर भोजी के औषधीय और आनुवंशिक perturbations के प्रभाव पूरे जानवर स्तर पर नजर रखी, और एकल कोशिका के स्तर पर जा सकता है.

  1. Morpholino इंजेक्शन द्वारा भोजी हेरफेर
    1. 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग से 1 मिमी के एक शेयर के समाधान के लिए बाँझ पानी में morpholino oligonucleotides पुनर्गठित. स्टोरकमरे के तापमान पर.
      नोट: morpholino oligonucleotide इंजेक्शन 1-4 सेल चरण भ्रूण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
    2. Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा में बाँझ 0.1% फिनोल लाल के साथ morpholino oligonucleotide काम कर समाधान तैयार है. खंड 3.4.3 में वर्णित के रूप में खंड 3.4.2 में वर्णित के रूप में सुई लोड., Morpholino oligonucleotide इंजेक्शन की मात्रा calibrated किया जा सकता है.
      नोट: Phenol लाल इंजेक्शन मात्रा कल्पना करने में मदद मिलेगी.
    3. एक भ्रूण स्थिति कक्ष तैयार (यानी., सुई का सामना करना पड़ किनारों के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश ढक्कन पर cyanoacrylate साथ चिपके एक खुर्दबीन स्लाइड आंशिक रूप से हटाया). पानी की एक छोटी राशि के साथ चैम्बर के लिए 1-4 सेल चरण भ्रूण स्थानांतरण और एक ठीक तूलिका के साथ उन्हें पंक्ति.
    4. जरायु और सुचारू रूप से जर्दी घुसना. एक बार अंदर, morpholino oligonucleotide समाधान के वांछित मात्रा इंजेक्षन पेडल दबाएँ.
      नोट: 0.5 करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा को कम - 2 नाथन; संस्करणों उच्चतर था5 एन एन विकास संबंधी दोषों के कारण और अंडे मृत्यु दर में वृद्धि हो सकती है.
    5. Microinjection के बाद, (धारा 3.2 में वर्णित के रूप में विरंजन से) और 28 डिग्री सेल्सियस पर E2 के साथ एक पेट्री डिश में उन्हें सेते साफ भ्रूण.
    6. 72 घंटे के बाद निषेचन नियंत्रण संक्रमित (यानी, नियंत्रण morpholino oligonucleotide इंजेक्शन के साथ zebrafish लार्वा) या p62 morphants (यानी., P62 morpholino oligonucleotide इंजेक्शन के साथ zebrafish लार्वा) खंड 3.4 में वर्णित के रूप में शिगेला के साथ. खंड 3.5 में वर्णित के रूप में अगले 2-5 दिनों के लिए अस्तित्व और बैक्टीरियल बोझ का आकलन करें. खंड 3.7 में वर्णित और चित्रा 4C में डाला, या खंड 3.8 में वर्णित के रूप में छवि zebrafish लार्वा रहने के रूप में छवि zebrafish लार्वा तय की.
      नोट: प्रभावी morpholino oligonucleotide खुराक प्रतिलेख splicing या प्रोटीन अनुवाद (चर्चा देखें) को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता.

Representative Results

इन विट्रो, एस में टिशू कल्चर कोशिकाओं का संक्रमण होने पर flexneri फेगोसोम से बचने के लिए और cytosol आक्रमण कर सकते हैं. Cytosol में, मेजबान कोशिकाओं septin पिंजरों (चित्रा 1 ए) के अंदर बैक्टीरिया compartmentalizing द्वारा शिगेला की actin आधारित गतिशीलता रोका जा सकता है. Septin पिंजरों द्वारा फँस जीवाणु भी भोजी मार्करों p62 (चित्रा 1 बी) और LC3 (चित्रा 1C) द्वारा लेबल किया जा सकता है. इन टिप्पणियों आक्रामक रोगजनकों के प्रसार को प्रतिबंधित कि मेजबान रक्षा का एक उपन्यास तंत्र पर प्रकाश डाला, और भी भोजी और cytoskeleton के बीच नए संबंधों का पता चलता है. आश्चर्यजनक, भोजी मार्करों की कमी काफी बैक्टीरिया (2A चित्रा) के septin caging कम कर देता है, और काम भी septin caging की कमी काफी भोजी मार्करों 8 की भर्ती कम कर देता है कि दिखाया गया है. इस प्रकार, कम से कम शिगेला के मामले, पिंजरे विधानसभा और autophagosome रचना septin मेंn अन्योन्याश्रित प्रक्रियाओं के रूप में देखा जा सकता है. Septin पिंजरों द्वारा शिगेला की compartmentalization के लिए अन्य सेलुलर आवश्यकताओं actin polymerization और actomyosin गतिविधि (चित्रा 2B) शामिल हैं.

संक्रमण का एक नया पशु मॉडल, zebrafish लार्वा 19 से फायदा हो सकता है कोई प्राकृतिक माउस shigellosis के मॉडल, और शिगेला रोगजनन, septin जीव विज्ञान और vivo में जीवाणु भोजी की जांच कर रहे है. यह ऐसे में विवो माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) के लिए दुम नसों में अस्तित्व प्रयोगों के लिए इंजेक्शन, और पूंछ पेशी इंजेक्शन के रूप में विभिन्न संरचनात्मक साइटों में बैक्टीरिया इंजेक्शन द्वारा zebrafish लार्वा को संक्रमित करने के लिए संभव है. खुराक, एस के आधार पर flexneri या तो 48 घंटे के बाद संक्रमण के भीतर मंजूरी दी जा सकती zebrafish लार्वा में इंजेक्शन, या एक प्रगतिशील और अंततः घातक संक्रमण (आंकड़े -3 बी - 3 डी) में हो सकता है. शिगेला डाह पिताctors 28 डिग्री सेल्सियस, zebrafish के इष्टतम विकास तापमान में व्यक्त कर रहे हैं, और शिगेला द्वारा zebrafish संक्रमण अपने प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS) 19, मानव रोग में एक आवश्यक डाह निर्धारक पर सख्ती से निर्भर है. लिया साथ में, इन टिप्पणियों zebrafish लार्वा शिगेला संक्रमण के vivo विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान नए मेजबान का प्रतिनिधित्व करता है कि संकेत मिलता है.

zebrafish लार्वा की ऑप्टिकल अभिगम्यता विवो (चित्रा -4 ए) में septin caging, पहले स्तनधारी मेजबान मॉडल का उपयोग कर पूरा नहीं किया गया है कि एक उपलब्धि के दृश्य में सक्षम बनाता है. Septin पिंजरों विवो में भोजी के लिए लक्षित बैक्टीरिया फंसाने सबूत है कि पूरक करने के लिए, एक GFP-LC3 व्यक्त ट्रांसजेनिक Zebrafish लार्वा को संक्रमित और शिगेला (चित्रा 4 बी) को भोजी मार्कर भर्ती निरीक्षण कर सकते हैं. विवो, एल में शिगेला autophagosomes के ultrastrucutral विश्लेषण के लिएectron माइक्रोस्कोपी स्पष्ट रूप से डबल झिल्ली रिक्तिकाएं 19 से बैक्टीरिया के साइटोसोलिक ज़ब्ती दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भोजी सेल स्वायत्त उन्मुक्ति का एक प्रमुख घटक है और intracytosolic बैक्टीरिया 14-16 के खिलाफ एक महत्वपूर्ण रक्षा तंत्र के रूप में देखा जाता है. विवो में भोजी समारोह चिह्नित करने के लिए, p62 morpholino इलाज zebrafish लार्वा इस्तेमाल किया जा सकता है. कोर भोजी मशीनरी के विपरीत [जैसे., 36 भोजी से संबंधित प्रोटीन (ATGs) 26], p62 संक्रमण के लिए सामान्य रूप से पूर्व विकसित कर सकते हैं हड्डीवाला विकास 27 और इस प्रकार zebrafish लार्वा के लिए आवश्यक नहीं है. आश्चर्यजनक, p62 समाप्त लार्वा एस के साथ टीका काफी वृद्धि हुई मृत्यु दर और बढ़ बैक्टीरियल बोझ 19 में flexneri परिणाम. कि septin पिंजरे विधानसभा दिखा इन विट्रो काम के साथ समझौते में autophagosome गठन 7,8 साथ अन्योन्याश्रित है, शिगेला को septin भर्ती स्पष्ट रूप से (p62 समाप्त लार्वा में कम है

चित्रा 1
इन विट्रो में septin पिंजरे 1 चित्रा. (ए) HELA कोशिकाओं एस से संक्रमित थे flexneri 4 घंटा 40 मिनट के लिए, तय, SEPT9 और phalloidin के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और confocal microcopy ने उतारी. स्केल बार, 1 माइक्रोन. (बी) HELA कोशिकाओं एस से संक्रमित थे flexneri 4 घंटा 40 मिनट के लिए, तय, p62 और SEPT2 के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी ने उतारी. स्केल बार, 1 माइक्रोन. (सी) HELA कोशिकाओं, GFP-ATG8 / LC3 साथ ट्रांसफ़ेक्ट एस से संक्रमित थे 4 घंटा 40 मिनट के लिए flexneri, तय, फ्लोरोसेंट रोशनी मील से SEPT2 के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और imagedcroscopy. स्केल बार, 1 माइक्रोन. ये आंकड़े Mostowy एट अल 7 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 2
शिगेला -septin पिंजरे गठन के लिए चित्रा 2 सेलुलर आवश्यकताओं. (ए) HELA कोशिकाओं पर नियंत्रण के साथ इलाज किया गया (Ctrl), p62, ATG5, ATG6 या ATG7 siRNA. SiRNA इलाज कोशिकाओं के पूरे सेल lysates siRNA कमी (ऊपर) की दक्षता दिखाने के लिए GAPDH, p62, ATG5, ATG6, या ATG7 लिए immunoblotted गया. siRNA इलाज कोशिकाओं एस से संक्रमित थे तय है, और मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी के लिए लेबल, 4 घंटा 40 मिनट के लिए flexneri. रेखाचित्र (नीचे) उपचार प्रति n ≥3 प्रयोगों से SEPT2 पिंजरों के अंदर शिगेला के SEM मतलब ±% का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) HELA कोशिकाओं एस से संक्रमित थे डी (CytD) cytochalasin, DMSO के साथ इलाज lexneri, latrunculin बी (LatB), nocodazole (Noco), या blebbistatin (छाला) और 4 घंटे के बाद 40 मिनट तय किया गया और मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी के लिए लेबल. रेखांकन उपचार प्रति दो स्वतंत्र प्रयोगों से SEPT2 पिंजरों के अंदर शिगेला के SEM मतलब ±% का प्रतिनिधित्व करते हैं. ये आंकड़े Mostowy एट अल 7 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 3
चित्रा 3 शिगेला संक्रमण के zebrafish मॉडल. (ए) छवियाँ stereomicroscope के तहत zebrafish लार्वा के उन्मुखीकरण को वर्णन करने के लिए. (बाएं पैनल) zebrafish लार्वा 72 घंटे के बाद निषेचन उनकी पृष्ठीय पक्ष इंजेक्शन सुई का सामना करना पड़ के साथ इंजेक्शन थाली में पार्श्व तैनात थे. (मध्यम पैनल) खून संक्रमण inj द्वारा किया गया थादुम नस में बैक्टीरिया (लाल समाधान) ecting, मूत्रजननांगी उद्घाटन करने के पीछे. पूंछ मांसपेशियों में (सही पैनल) संक्रमण एक विखंड अधिक बैक्टीरिया (लाल समाधान) इंजेक्शन लगाने के द्वारा किया गया था. (बी) 72 घंटा बाद निषेचन लार्वा की जीवन रक्षा घटता एस के विभिन्न खुराक के साथ इंजेक्शन flexneri और 48 घंटे के बाद संक्रमण के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर incubated. प्रभावी inoculum कम (<10 3 CFU, खुला हलकों), मध्यम (~ 4 x 10 3 CFU, खुला त्रिकोण) या उच्च (~ 10 4 CFU, खुला वर्गों) के रूप में वर्गीकृत किया गया था. Inoculum वर्ग प्रति n ≥3 प्रयोगों से SEM ±% (क्षैतिज सलाखों) मीन. (सी) गणन व्यक्ति लार्वा से homogenates में जीवित बैक्टीरिया के विभिन्न समय पौंड पर चढ़ाना द्वारा मापा के बाद संक्रमण पर ध्यान दें, केवल लार्वा गणन विश्लेषण में शामिल कर रहे हैं संक्रमण से बच रही है. यह भी दिखाया ± SEM (क्षैतिज सलाखों) मीन. (डी) GFP- शिगेला का वितरण द्वारा निर्धारितकई बार एक कम, मध्यम या उच्च खुराक inoculum (दुम नसों में इंजेक्शन) का उपयोग कर के बाद संक्रमण पर एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग रहते इमेजिंग. . संचरण छवि (ग्रे) और GFP प्रतिदीप्ति (हरा) (बी) के ओवरले - (डी) ये आंकड़े Mostowy एट अल 19 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 4
चित्रा 4 विवो में शिगेला संक्रमण की कोशिका जीव विज्ञान. (ए) zebrafish लार्वा 24 घंटा, तय, GFP SEPT7 (लाल) के खिलाफ और एंटीबॉडी के साथ लेबल (हरे रंग के लिए GFP- शिगेला (कम खुराक) के साथ पूंछ मांसपेशियों में संक्रमित थे ), और confocal माइक्रोस्कोपी ने उतारी. स्केल बार, 5 माइक्रोन. (बी) GFP-LC3 zebrafish लार्वा mCherry- शिगेला (मध्यम खुराक) के लिए से संक्रमित थे4 घंटा, तय, mCherry (लाल) के खिलाफ और GFP (हरा) के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और confocal माइक्रोस्कोपी ने उतारी. . या p62 (सही छवि) morpholinos SEPT7 खिलाफ एंटीबॉडी (के साथ लेबल, तय, 4 घंटे के लिए GFP- शिगेला (मध्यम खुराक) से संक्रमित थे, स्केल बार, 1.5 माइक्रोन (सी) zebrafish लार्वा या तो नियंत्रण (बाएं छवि Ctrl) के साथ इलाज लाल) और GFP (हरा) के लिए, और confocal माइक्रोस्कोपी ने उतारी. तीर septin पिंजरों (Ctrl) या नहीं में फँस शिगेला के कुछ उदाहरण उजागर 4 घंटा बाद संक्रमण (p62 समाप्त). स्केल बार, 5 माइक्रोन. ये आंकड़े Mostowy एट अल 19 से संशोधित किया गया है.

Discussion

टिशू कल्चर कोशिकाओं का उपयोग कर इन विट्रो में भोजी और cytoskeleton की निगरानी करते हैं, वर्गों 1 और 2 में वर्णित प्रोटोकॉल टिशू कल्चर सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, भोजी का पालन करने के लिए (जैसे, ATG8 / LC3 autophagosomes ve +) और cytoskeleton (जैसे., Actin पूंछ, septin पिंजरों) लाइव इमेजिंग का उपयोग शिगेला संक्रमण के दौरान वास्तविक समय में गतिशीलता, टिशू कल्चर कोशिकाओं क्षणिक GFP- का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है, पहले से ही RFP- या पाकिस्तानी टैग निर्माणों 7,8 वर्णित. (. यानी, शिगेला 100 में HELA कोशिकाओं का 5-30% पर आक्रमण कर सकते हैं पर वास्तविक समय विश्लेषण के लिए आम तौर पर वांछनीय: 1 MOI) शिगेला से संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ाने के लिए (आयुध डिपो सीधे शिगेला के 400 μl जोड़ने, 600 = 0.3 -0.6) 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को सदस्य (सीरम की कमी से जूझ) और पर्याप्त जीवाणु प्रवेश के लिए कम से कम 1.5 घंटा के बाद संक्रमण इंतजार फेगोसोम, प्रतिकृति, Au से बचtophagy मान्यता और septin caging. वैकल्पिक रूप से, एक adhesin AfaE व्यक्त किया और उपकला कोशिकाओं में बहुत अधिक आक्रमण क्षमताओं M90T तनाव 28 की तुलना में है कि शिगेला M90T AfaI तनाव का उपयोग कर सकते हैं. ध्यान से, M90T AfaI तनाव अभी तक zebrafish का उपयोग vivo में परीक्षण नहीं किया गया. शिगेला कालोनियों की प्लेट्स 2-3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा और कई प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, समय के साथ, यह भी कांगो लाल अवशोषित और प्रदर्शित कर सकते हैं डाह प्लाज्मिड खो दिया है कि शिगेला की कालोनियों उनकी डाह प्लाज्मिड बरकरार रखा गया है. इस कारण से हम जब संभव ताजा बैक्टीरियल शेयरों का उपयोग करने की सलाह देते हैं.

Vivo में संक्रमण की कोशिका जीव विज्ञान की निगरानी करते हैं, प्रोटोकॉल धारा 3 और 4 का उपयोग wildtype एबी लाइन zebrafish में वर्णित है. दृश्य को DsRed: GFP या Lyz: शिगेला -leukocyte बातचीत पर नजर रखने के लिए, ट्रांसजेनिक Zebrafish लाइनों, जैसे, MPX इस्तेमाल किया जा सकता हैneutrophils 19,29,30 या MPEG1 ize: mCherry मैक्रोफेज 19,31 कल्पना करने के लिए. खंड 3.8 में वर्णित के रूप में vivo में भोजी कल्पना, GFP-LC3 zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन 19,24 इस्तेमाल किया जा सकता है.

विवो में भोजी उपद्रव, प्रभावी morpholino oligonucleotide खुराक प्रतिलेख splicing या प्रोटीन अनुवाद को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर प्रयोगात्मक मूल्यांकन किया जाना है. यह एक अनुमापन प्रयोग को करने के लिए और (ब्याह morpholino oligonucleotide के लिए) आरटी पीसीआर द्वारा कमी की पुष्टि करने के लिए या (translational morpholino oligonucleotide के लिए) एसडीएस पृष्ठ 32 द्वारा सलाह दी जाती है. Zebrafish भ्रूण या लार्वा से शाही सेना अलगाव guanidinium thiocyanate-फिनोल के क्लोरोफॉर्म निकासी का उपयोग किया जा सकता है. Zebrafish लार्वा (8 से 15 लार्वा / ट्यूब) से प्रोटीन निकालने के लिए, यंत्रवत्, 0.01% octylphenol ethylene ऑक्साइड condensat 200 μl lysis बफर (1 एम Tris, 5 एम NaCl, 0.5 एम EDTA में एक मूसल का उपयोग homogenizeई, और protease अवरोध). 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 19,000 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब और एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना Laemmli बफर जोड़ें और गर्मी. Lysates की जरूरत तक -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, और धारा 2.3 में वर्णित के रूप में पश्चिमी सोख्ता द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

zebrafish में विवो दवा आवेदन के लिए एक शानदार मॉडल है. Morpholino oligonucleotides विश्लेषण का उपयोग भोजी (जैसे, rapamycin और bafilomycin) हेरफेर करने के लिए स्थापित दवाओं के साथ पूरक किया जा सकता है. असंक्रमित और / या संक्रमित लार्वा rapamycin (1.5 माइक्रोन) या bafilomycin (80 एनएम) E2 में पतला और 25,33 में वर्णित के रूप में autophagic प्रवाह पश्चिमी सोख्ता द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ इलाज किया जा सकता है. खंड 3.5 में वर्णित के रूप में संक्रमित लार्वा के संक्रमण और अस्तित्व के परिणाम पर भोजी हेरफेर के परिणाम का मूल्यांकन किया जा सकता है.

मेजबान सेल का अध्ययन करने के अलावाइन विट्रो में और vivo प्रोटोकॉल में निर्धारकों, उदा., शिगेला ΔicsA (शिगेला प्रोटीन आईसीएसए एन ततैया रंगरूटों और फिर Arp2 / 3, विभिन्न भोजी द्वारा मान्यता प्राप्त हैं कि बैक्टीरियल उत्परिवर्ती उपभेदों का उपयोग, भोजी मान्यता के लिए आवश्यक बैक्टीरियल निर्धारकों का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है इसके अभाव में, इसके अभाव में कोई actin पूंछ, कोई septin पिंजरों) और ShigellaΔicsB (शिगेला आईसीएसए को भोजी मशीनरी की भर्ती को रोकता है जो बैक्टीरियल effector प्रोटीन ICSB, के माध्यम से autophagic प्रतिक्रिया से बचा जाता है वहाँ हो सकता है, actin पूंछ और septin पिंजरे गठन के लिए अधिक septin पिंजरों, अधिक भोजी) 7,8 हो सकता है.

शिगेला zebrafish के एक प्राकृतिक रोगज़नक़ नहीं है और 37 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर होती है. हालांकि, काम CY में phagocytic रिक्तिका और नकल से बचने, शिगेला आक्रमण के लिए आवश्यक है कि डाह कारकों दिखाया गया हैtosol व्यक्त की और 28 डिग्री सेल्सियस 19 पर zebrafish लार्वा में कार्य कर रहे हैं किया जा सकता है. 28 डिग्री सेल्सियस सामान्य zebrafish विकास 23 सुनिश्चित करने के लिए zebrafish पालन और मानक तापमान के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तापमान है. आश्चर्यजनक, मनुष्यों में shigellosis के लिए नेतृत्व कि प्रमुख रोगजनक घटनाओं (उपकला कोशिकाओं के भीतर यानी, बृहतभक्षककोशिका कोशिका मृत्यु, आक्रमण और गुणा, सेल करने वाली सेल प्रसार, मेजबान उपकला के भड़काऊ विनाश) ईमानदारी शिगेला संक्रमण के zebrafish मॉडल में प्रतिलिपि हैं 19.

भोजी और cytoskeleton जीन सर्वत्र व्यक्त की और जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है. माउस अध्ययन 5 भ्रूण घातक हैं आवश्यक भोजी 26 या septin जीनों की कि पीटकर पता चला है, और यह इस समस्या zebrafish कई तथ्य यह है कि द्वारा कम किया जा सकता है, हालांकि इन जीनों में से कुछ भी (zebrafish विकास के लिए आवश्यक हो जाएगा संभावना हैparalogous जीन 33). यदि हां, तो morpholinos नीचे titrated किया जा सकता है (द्वितीय) भोजी और cytoskeleton को विनियमित करने के लिए (मैं) औषधीय अभिकर्मकों का उपयोग, सहित इस समस्या को दूर करने के लिए कई विकल्प हैं, जीन (iii) पीटकर केवल विशेष सेल के लिए तैयार किया जा सकता है प्रकार, और / या (iv) पशु विकास के लिए आवश्यक नहीं हैं कि autophagic मान्यता में शामिल जीनों (जैसे., p62) लक्षित किया जा सकता है.

Zebrafish भोजी और शिगेला संक्रमण के दौरान cytoskeleton की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है, आणविक उपकरण वर्तमान में कमी कर रहे हैं. क्षेत्र नए उपकरणों और ब्याज की प्रोटीन की ड्राइव सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति उत्पन्न करने की जरूरत है. भोजी / cytoskeleton जीनों की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के लिए, नई morpholino दृश्यों के लिए आवश्यक हैं, और जीनोम इंजीनियरिंग के लिए उपन्यास तरीकों (जैसे, TALEN, CRISPR / Cas9) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस बीच, कई उपकरण पहले से मानव या माउस के अध्ययन के लिए उत्पन्नसमान रूप से zebrafish के लिए काम कर सकते हैं.

intracellular बैक्टीरिया एस flexneri प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2 द्वारा मान्यता प्राप्त होना बैक्टीरिया की क्षमता सहित जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण मुद्दों को संबोधित करने के लिए एक असाधारण मॉडल जीव के रूप में उभरा है. मेजबान सेल एस की गतिशीलता को प्रतिबंधित करने septins रोजगार flexneri और भोजी के लिए उन्हें निशाना, सेल स्वायत्त उन्मुक्ति 7,8 का एक महत्वपूर्ण घटक है. इन टिप्पणियों भोजी और साइटोसोलिक बैक्टीरिया नीचा करने के लिए अपनी क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक नया आणविक ढांचे का सुझाव. एक प्रमुख मुद्दा पूरी तरह से अंतर्निहित आणविक और सेलुलर घटनाओं को समझने के लिए, और प्रासंगिक पशु मॉडल का उपयोग vivo में बैक्टीरिया के संक्रमण के दौरान इन विट्रो में विश्लेषण इन घटनाओं को मान्य करने के लिए अब है. यह अंत करने, zebrafish एस के विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान नए मेजबान के रूप में स्थापित कर दिया गया है flexneri संक्रमण 19. बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के बीच सहभागिता उच्च संकल्प पर imaged किया जा सकता हैzebrafish मॉडल विवो में शिगेला संक्रमण की कोशिका जीव विज्ञान को समझने के लिए उपयोगी साबित करना चाहिए. Zebrafish लार्वा मेजबान बचाव में जीवाणु भोजी की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और काम भोजी की गड़बड़ी पर प्रतिकूल शिगेला संक्रमण 19 के जवाब में मेजबान अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं कि पता चला है कि.

टिप्पणियों मेजबान रक्षा समझने में मौलिक अग्रिमों प्रदान हो सकता है zebrafish लार्वा का उपयोग टिशू कल्चर कोशिकाओं और vivo में उपयोग कर इन विट्रो में caging और भोजी septin, शिगेला के अध्ययन से उत्पन्न. उन्होंने यह भी संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के उद्देश्य से नई रणनीति के विकास का सुझाव सकता है.

इस रिपोर्ट का एक महत्वपूर्ण उद्देश्य इन विट्रो में विश्लेषण आणविक और सेलुलर घटनाओं को समझने के लिए है (यानी, भोजी, actin पूंछ, caging septin) एक ईएनटी के संदर्भ में vivo में बैक्टीरिया के संक्रमण के दौरानzebrafish लार्वा का उपयोग गुस्सा जीव,. Zebrafish जीव विज्ञान और हैंडलिंग के साथ परिचित नहीं हैं, तो एक उचित zebrafish पशुपालन 23 के लिए और zebrafish संक्रमण 19,35 के vivo विश्लेषण में गहराई प्रोटोकॉल में उल्लेख कर सकते हैं.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

एसएम प्रयोगशाला में काम एक वेलकम ट्रस्ट रिसर्च कैरियर विकास फैलोशिप [WT097411MA] द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 

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References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4, (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4, (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2, (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61, (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5, (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25, (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).
का प्रयोग करें<em&gt; शिगेला flexneri</em&gt; भोजी-cytoskeleton बातचीत का अध्ययन
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Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).More

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).

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