Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование doi: 10.3791/51601 Published: September 9, 2014

Summary

Чтобы противодействовать распространению болезнетворных микроорганизмов, клетки-хозяева реорганизовать их цитоскелета по полочкам бактерии и вызывать аутофагии. Использование Shigella инфекция тканевых культур клеток, хозяина и возбудителем детерминант, лежащих в основе этого процесса были выявлены и охарактеризованы. Использование данио модели Shigella инфекции, роль обнаруженных молекул и механизмов исследуются в естественных условиях.

Abstract

Shigella flexneri является внутриклеточным патогеном, который может убежать от фагосом достичь цитозоль, и полимеризуется хозяина цитоскелета для содействия ее подвижность и распространение. Новая работа показывает, что белки, участвующие в актина основе подвижности также связаны с аутофагии, внутриклеточного процесса деградации решающее значение для клеток автономной иммунитета. Поразительно, клетки-хозяева могут предотвратить актина основе моторику S. flexneri по compartmentalizing бактерий внутри "septin клетки 'и ориентации их аутофагии. Эти наблюдения показывают, что более полное понимание septins, семейство нитевидных ГТФ-связывающих белков, обеспечит новый взгляд в процессе аутофагии. В этом докладе описывается протоколы для мониторинга аутофагии-цитоскелета взаимодействия, вызванные S. flexneri в пробирке с использованием тканевой культуры клеток и в естественных условиях с использованием данио личинки. Эти протоколы позволяют расследование внутриклеточных mechanisмс, которые контролируют бактериальную распространение на молекулярном, клеточном, и всей уровне организма.

Introduction

Shigella flexneri, грамотрицательная инвазивной энтеропатогенные бактерия, может уйти от фагосом в цитозоле, и полимеризации актина цитоскелета хоста уклониться цитозольные иммунные реакции и способствовать внутрирегиональной и межклеточной движение 1,2. Несмотря на понимание актина основе подвижности в пробирке 3,4, механизмы, ограничивающие бактериальной распространение в естественных условиях не были полностью определены. Это очень важно для более полного понимания врожденного иммунитета и защиты организма.

Septins, высококонсервативный семейство белков среди многоклеточных, являются гуанозинтрифосфат (GTP) -связывающий белки, которые собираются в гетеро-олигомерных комплексов и образуют неполярные нити, которые связывают с клеточных мембран и цитоскелета 5,6. Последние работы обнаружили, что инфицированные клетки-хозяева могут предотвратить моторику основе Shigella актина по compartmentalizing бактерий, направленных на autophAGY внутри 'septin клетки', раскрывающие первый клеточный механизм, что противодействует актина основе моторику 7,8. Широкий открытое поле исследования в настоящее время находится в 'septin биологии и инфекции ". Septin монтаж, вызванной различными патогенами (например, Listeria моноцитогенес 7,9,10, Mycobacterium Marinum 7,8, Candida Albicans 11), могут появиться в качестве ключевого вопроса в защите хозяина 5,12.

Аутофагия, высококонсервативный внутриклеточный процесс деградации, рассматривается как ключевой компонент клеточно-автономным иммунитета за его способности поставить цитозольные бактерии к лизосом 13,14. Тем не менее, роль бактериального аутофагии в естественных условиях, чтобы ограничить или продвижения бактериальной репликации остается плохо изученным 15,16. Данио (Danio rerio) возник как позвоночных модели для изучения инфекций, потому что это оптически доступнына личиночной стадии, когда врожденная иммунная система уже функциональная 17,18. Недавняя работа характеризуется восприимчивость данио личинки к S. flexneri, парадигма для бактериальной аутофагии 15, и использовал -zebrafish инфекции модель Shigella изучать манипуляции аутофагии для антибактериальной терапии в естественных условиях 19.

Этот отчет содержит новые инструменты и анализы для изучения S. flexneri взаимодействия с аутофагии и цитоскелета. В качестве первого шага, протоколы для мониторинга аутофагии-цитоскелета взаимодействия описываются с помощью Shigella инфекции человеческого эпителиальной клеточной линии HeLa. Для оценки роли аутофагии-цитоскелета взаимодействий на инфекционного процесса Shigella в пробирке, методы манипулировать аутофагии и цитоскелета компонентов (используя миРНК или фармакологических реагентов) предоставляются. Новая работа показывает, что с помощью Shigella инфекции OF данио личинки, подобные анализы могут быть применены для изучения клеточной биологии инфекции в естественных условиях. Протоколы подготовить и заразить данио личинки подробно, а также для оценки ответа хоста к Shigella инфекции в естественных условиях, протоколы для определения выживаемости хозяин и бактериальная бремя зараженного личинками предоставляются. Методы Регулирование найма septin и аутофагии маркеров к Shigella (с использованием либо фиксированную или живой личинки данио) и методы, чтобы проверить роль этих процессов в естественных условиях [используя морфолино олигонуклеотидов (введенный 1-4 клеточной стадии эмбрионов) или фармакологических реагентов ( добавляют непосредственно в данио воде ванны)], также обсуждаются. Эта программа работы, как ожидается, обеспечить для понимания механизмов, необходимых для контроля заражения цитозольными ответов принимающих.

Protocol

1 Мониторинг Аутофагия и цитоскелета In Vitro Использование культуры тканей

  1. Подготовьте S. flexneri
    1. Тарелка С. flexneri M90T (дикого типа) от -80 ° C глицерина складе перекинуть конго красного триптических казеин соевый (TCS) агаром. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С. То же пластина может быть использована для нескольких экспериментах.
    2. Выбор индивидуальный колонию и расти в 8 мл ТКС массовой информации в шейкере в течение ночи при 37 ° С.
      Примечание: Конго красный связывания указывает на то, что плазмида вирулентности была сохранена.
    3. Чтобы субкультура бактерии для экспоненциального роста, прививку свежего TCS с ночной бактериальной культуры в 1/80 разбавления и расти в шейкере при 37 ° С в OD 600 = 0,3-0,6.
    4. Крутить бактериальной субкультуру в 1000 мкг в течение 5 мин. Вымойте гранул с MEM и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 мин. Восстановить осадок в MEM, чтобы OD 600 = 0,3-0,6.
  2. Подготовьте HeLa Ceзаполняет для инфекции
    1. Grow HeLa клеток в полной среде ", т.е."., MEM, а также L-аланил-L-глутамина с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ раствор несущественных аминокислот и 10% фетальной телячьей сыворотки.
    2. Тарелка 1-1,5 х 10 5 клеток в 6-луночных планшетах 24 или 48 час до начала эксперимента. Табличка на покровные стекла в 6-луночные планшеты для микроскопии, или плиты на 35 мм со стеклянным дном посуды для подготовки к живого изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (. Например, актин хвосты, septin клетки) Чтобы следовать аутофагии (например, Atg8 / LC3 положительной аутофагосом) и цитоскелета динамику в реальном времени во время Shigella инфекции с помощью живого изображения, культуры тканей клетки могут быть трансфицированы с помощью GFP-, RFP- или CFP-меченые конструкции (см Обсуждение).
  3. Инфекция
    1. Инфицировать клетки с 100: 1 множественности заражения (МВД) из Shigella (OD 600 = 0,3 - 0,6), разбавленный в MEM; непосредственно добавить в HeLa посеянных клеток в 6-шELL пластины 24 - 48 ч до заражения (как описано в разделе 1.2) в 2 мл MEM (сыворотка) голодали.
    2. Чтобы максимизировать прикрепление бактерий к клеткам-хозяевам, центрифуги бактерий и клеток при 700 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. После центрифугирования, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, 5% СО 2 и позволить инфекции, чтобы продолжить.
    3. Промыть инфицированные клетки дважды свежей MEM и инкубировать с гентамицином полной среде, содержащей (50 мкг / мл, чтобы устранить внеклеточных бактерий) в течение 1-4 ч в зависимости от эксперимента.
  4. Фиксация и маркировки Зараженные клеток HeLa для микроскопии
    1. Промыть инфицированные клетки дважды с 1x PBS, и зафиксировать в течение 15 мин в 4% параформальдегид в 1х PBS при комнатной температуре. Для удаления параформальдегида, мыть клетки 2x с 1x PBS.
    2. Фиксированные клетки инкубируют в 50 мМ хлорида аммония в течение 10 мин при комнатной температуре. Вымойте один раз 1x PBS, и проницаемыми клетки в течение 4 мин с 0,1% оксида октилфенол этилена конденсата при комнатной темпера тура.
      Примечание: Альтернативы октилфенол этиленоксид конденсата для проницаемости, такие как метанол или сапонина, могут быть применены для различных сохранения клеточных структур 20.
    3. Промыть клеток в 1х PBS и инкубировали во влажной камере с первичными антителами против аутофагией критических компонентов (например, P62 / SQSTM1) или septin цитоскелета (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9 и SEPT11 выражены в клетках HeLa) в течение 30 мин (при при комнатной температуре) в течение ночи (при 4 ° С).
    4. Промыть клетки дважды с 1x PBS и инкубировали во влажной камере с вторичными антителами, и маркировать фибриллярного актина (F-актина) с фаллоидином, в течение 30 мин (при комнатной температуре) в течение ночи (при 4 ° С). Для окрашивания хозяина клеточные ядра добавить 4 ", 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
    5. Вымойте клеток в 1x PBS и смонтировать покровные стекла на слайды, используя монтажную среду.
  5. Микроскопических изображений из инфицированных клеток HeLa
    1. Для изображения инфected клетки использовать эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии и 63x или 100X цель Выявить DAPI-меченого Shigella.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунках 1А - 1С, septin клетки могут быть визуализированы как кольца, как структуры, ~ 0,6 мкм в диаметре, окружающих цитозольные бактерии полимеризующие актин и рекрутинговых аутофагии маркеров (например, P62 и LC3) 7,8. Напротив, бактерии полимеризующие актина хвосты не будет разобщенным по septin клетках и не будут направлены на аутофагии 7,8.
    2. Использование эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии и 63x или 100X цели, определить число внутриклеточных бактерий в поле микроскопа. Также определить число бактерий, захваченных в septin клетках и направленных на аутофагии, или полимеризацию актина хвосты и вылетающих аутофагии.
    3. Чтобы определить процент бактерий, захваченных в septin клетках или полимеризацию актина хвостами, принять ряд Z-стек изображения из инфеИДКТК клетки, процесс образы и рассчитывать по крайней мере, 500-1000 бактерий на эксперименте, по крайней мере 3 независимых экспериментов.

2 Функциональный анализ аутофагии и цитоскелета в Vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба генетических и фармакологических подходы могут быть использованы возмущать аутофагии в инфицированных клетках тканевой культуры, а также влияние этих методов лечения на течение инфекции может контролироваться.

  1. миРНК опосредованного Сайленсинг
    1. Пластинчатый 0,8 х 10 5 клеток HeLa на покровные стекла в 6-луночных планшетах в полной среде.
    2. Трансфекции на следующий день с использованием липидной основе реагента для трансфекции с миРНК против аутофагии и / или цитоскелета маркеров.
    3. После необходимого периода инкубации, инфицировать клетки с Shigella, как описано в разделе 1.3.
    4. Fix и маркировать клетки, как описано в разделе 1.4.
  2. Фармакологическое Манипуляция
    например, деполимеризоваться актинового цитоскелета использование цитохалазин D или latrunculin B, деполимеризоваться микротрубочки использовать нокодазол, блокировать актомиозин активности использования blebbistatin, или сорвать septin использования сборка forchlorfeneuron. Аутофагия можно стимулировать с помощью рапамицина или заблокирован с помощью bafilomycin.
    1. Чтобы манипулировать цитоскелета во Shigella инфекции, в первую инфицировать клетки с Shigella, как описано в разделе 1.3 и обеспечивать достаточное время для бактерий проникать в клетки и сбежать из фагосомы в цитозоль (например.,> 1,5 сообщение инфекция ч).
    2. Развести наркотиков из исходного раствора [маточного раствора взвешенных в диметилсульфоксиде (ДМСО)] в MEM до конечной концентрации 5 М (цитохалазина D, latrunculin B, нокодазолом), 20 М (forchlorfeneuron) или 50 м (blebbistatin), и лечения элементов 30 мин при 37 ° С. Общий объем препарата (объем ДМСО / дковер смесь) добавляли на тарелку / флакон клеток 1-5 мкл (в зависимости от исходного раствора) за 2 мл среды. Treat клетки с аналогичной дозе ДМСО, разведенного в MEM в качестве отрицательного контроля.
    3. Fix и маркировать клетки, как описано в разделе 1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для манипулирования потока аутофагической (в зараженных или неинфицированных клеток), расширить медикаментозное лечение с помощью рапамицина (20 нМ) или bafilomycin (160 миль) от 4 до 12 часов.
  3. Вестерн-блот
    Примечание: аутофагической активность может быть определена количественно путем измерения уровня белка аутофагии маркеров, таких как p62 и LC3.
    1. После необходимого периода инкубации, собирать и лизиса клеток для иммуноблоттинга. Запуск белковые экстракты на 8, 10 или 14% гели акриламида.
    2. Аутофагической поток, т.е.. скорость аутофагии, могут быть проанализированы, как описано в 21,22.
  4. Микроскопических изображений и Количественное
    1. Использование эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии и 100X объект 63x илиIve, эффект миРНК или медикаментозное лечение на Shigella инфекции могут быть оценены с помощью количественной микроскопии (т.е. подсчет аутофагосом, septin клеток и актина хвостами), как описано в разделе 1.5 и показанных на рис 2А и 2В.

3 В естественных изображений из S. flexneri Взаимодействия с аутофагии и цитоскелета

ПРИМЕЧАНИЕ: Данио модель Shigella инфекции может быть использован для исследования septin арретирования и аутофагии в естественных условиях 19.

  1. Подготовьте S. flexneri
    1. Культура С. flexneri, как описано в разделе 1.1.
    2. В OD 600 = 0,3-0,6, спина 8 мл бактериальной субкультуры в 1000 мкг в течение 10 мин. Вымойте гранул с 1x PBS и центрифуги в 1000 мкг в течение 10 мин.
    3. Ресуспендируют осадок в 80 мкл 0,1% фенола красного 1x PBS, чтобы получить ~ 2000 бактерий / NL. Держите BacTПерс подготовка на льду, чтобы замедлить рост.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление фенол красный поможет визуализировать посевной при введении в личинок.
  2. Подготовьте данио рерио Личинки для инъекций
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данио рерио проложены как яйца и идентифицируются как эмбрионов вплоть до 72 ч после оплодотворения, когда их называют личинки.
    1. Порода взрослых данио, как описано в Уэстерфилд 23 путем размещения 4 мужчин и 8 женщин (как правило, в соотношении 2: 1) в отдельный садок для рыбы с нижней, покрытой мрамором (что предотвратит взрослых от еды породил яйца). Кроме того, разместить сбора яйцо корзины внутри племенных танков накануне вечером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца оплодотворяются ~ 30 мин после того, как гаснет свет на в данио объекта 23, и должны быть собраны как можно скорее, чтобы предотвратить рост плесени. Яйцо сбора корзины служат для сбора яйца, так что они могут быть легко собраны, а также защитить яйца от взрослых.
    2. Соберите эмбрионс и очистить их промывкой в ​​эмбриона СМИ (Е2) с 0,003% отбеливателя в течение 10 мин. Удалить E2 с отбеливателем, мыть эмбрионов 5x в Е2 среды, и выращивать эмбрионы в 10 см чашки Петри (100 эмбрионов / 50 мл E2 среднего) при 28 ° С.
    3. Если эмбрионы или личинки будут использоваться для микроскопических исследований, при 24 ч после оплодотворения добавить 0,003% N-фенилтиомочевины в среду Е2, чтобы предотвратить меланизации. Держите эмбрионов при 28 ° С для нормального развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данио рерио личинки готовы к инфекции в 72 ч после оплодотворения.
    4. Для инфекции и микроскопии процедур, обезболить данио личинки в 200 г / мл Tricaine в Е2.
  3. Подготовка данио рерио личинок для внутривенного и местной инфекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки данио выживания во Shigella инфекции, выполнить хвостовой внутривенные инъекции. Для визуализации вербовку septin и аутофагии маркеров к Shigella, выполнять инфекции на локализованных участках, таких как хвостовой мышцы.
    1. Для хвостового внутривенной инъекции, расположите наркозом личинок в боковом направлении спинной стороне, обращенной к иглу. Как показано на рисунке 3А, разместить кончика иглы рядом (задний) к мочеполовой открытия, стремясь к хвостовой вены, и проникнуть в кожу и обеспечивает желаемого бактериальной дозу (объем впрыска 1-5 NL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: внутривенное заражение является сложной задачей для выполнения и займет несколько недель тренировок, чтобы освоиться с этой процедурой. Инъекционных фенол красный (без бактерий) для обучения поможет оценить место инъекции правильно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае Shigella, в зависимости от дозы эксперименты показали, что инфекция низкая доза (<1000 КОЕ) очищается в течение 48 часов, и инфекция высокая доза (> 4000 КОЕ) приводит к хост смертности в 48 часов 19.
    2. Для мышц инфекции хвост, позиционировать наркозом личинок, как описано в разделе 3.3.1. Как показано на рисунке 3А, разместить иглы осторожныу более мышечных сомитов (т.е. сегменты скелетных мышц) и ввести небольшой объем (то есть., 1 NL) бактериального препарата.
  4. Внутривенного введения бактерий в личинок
    1. Потяните боросиликатного стекла микрокапилляров, как описано в 24.
    2. Подключите иглу обладателю трехмерного грубой ручной манипулятор и сломать кончик иглы с тонкой пинцетом.
    3. Чтобы загрузить иглу, поместить каплю бактериальной культуры на покровное. Включите microinjector и газового баллона, слегка погрузить наконечник в иглы, и заполнить иглу с желаемым количеством бактериального препарата.
    4. Для калибровки объем впрыска, поместите каплю минерального масла на покровным и ввести бактериальный препарат. Измерьте диаметр капли с помощью микрометра и рассчитать объем впрыскиваемого [V = (4/3) πr 3].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование настроек инжекцион- 40 фунтов на квадратный дюйм и 50 мс с bacteriаль подготовка, как описано в разделе 3.1 даст ~ 2000 КОЕ / NL.
    5. Подготовьте впрыска пластины с использованием пластиковых форм, как описано в Уэстерфилд 23.
    6. Перенести личинок впрыска пластины и выстроить их с помощью тонкой кисти. Ориент и привнести личинки, как описано в разделе 3.3.1.
    7. Для оценки выживаемости данио, передачи инфицированных личинок по отдельности в 24-луночных планшетах в 1 мл E2 / также и инкубируют при 28 ° С. В день в течение следующих 2-5 дней и выживания участка Монитор зараженный личинками с течением времени (Рисунок 3В).
  5. Покрытие данио рерио Личинки для бактериального количественной
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в стерильной капот, чтобы избежать загрязнения.
    1. Для оценки количества бактерий, введенных в рыбе (в момент времени 0 ч после заражения) и бактериального количественного в желаемых временных точках, пожертвовать данио личинки с передозировкой Tricaine (200-500 мг / л). Поместите индивидуальный личинок в 1,5 мл Polypropylene микроцентрифужных трубки с 200 мкл 0,1% октилфенол этиленоксид конденсата 1x PBS и механической гомогенизации при помощи пестика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения бактериальной нагрузки в объеме впрыска, насос равное дозу в стерильный 1x PBS капли и пластины его.
    2. Сделать серийные разведения данио личинки гомогенатах в стерильной воде и пластину на лизогении бульона (LB) чашках с агаром. Личинки могут быть покрыты альтернативно на Конго Красный TCS пластин различать Shigella сохранив вирулентного плазмиды или нет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Plate 3 или более неинфицированного рыбы в качестве контроля, чтобы проверить статус данио личинки, используемого для инфекции.
    3. После инкубации в течение ночи пластин при 37 ° С, рассчитывать бактериальных колоний. Как показано на фиг.3С, представляют с помощью логарифмической шкале.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальный нагрузки при заражении данио личинки также могут быть визуализированы с помощью флуоресцентно меченого Shigella и микроскопический Imaging, как описано в разделе 3.7 или 3.8 (Рисунок 3D).
  6. Данио рерио Личинки Иммуноокрашивание
    1. В желаемых временных точках, пожертвовать личинок с помощью передозировки Tricaine. Соберите рыбу в 1,5 мл полипропилен микропробирок (от 10 до 20 личинок / трубки).
    2. Закрепить личинок с использованием 4% параформальдегида с 0,4% октилфенол этиленоксида конденсата в 1х PBS и инкубируют в орбитальной мешалке (чтобы избежать личинок кластеризации) в течение 2 ч (при комнатной температуре) или на ночь (при 4 ° С).
      Примечание: электронной микроскопии может быть использован для анализа ультраструктурных зараженного данио личинки. В этом случае, анестезированных эмбрионы должны быть зафиксированы и обработаны в соответствии с Mostowy соавт 19.
    3. Промывочный 3x в 1X PBS +0,4% октилфенол этиленоксида конденсата в течение 5 мин, а затем блокируют в блокирующем растворе (10% фетальной телячьей сыворотки, 1% ДМСО, 0,1% полиоксиэтиленсорбитана монолаурат в 1х PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре.
    4. Diлютневая первичного антитела в блокирующем растворе. Добавить личинок разбавленного первичного антитела и инкубируют в течение ночи при 4 ° С в орбитальной мешалке. С помощью первичных антител, как описано выше в разделе 1.4.3.
    5. Вымойте личинки 4x в течение 15 мин в 0,1% полиоксиэтиленсорбитан монолаурата 1x PBS при комнатной температуре.
    6. Развести вторичные антитела в блокировании решения. Добавить личинок разбавленного вторичного антитела и инкубируют в течение ночи при 4 ° С в орбитальной мешалке. Используйте те же вторичные антитела и фаллоидина, как описано в разделе 1.4.4.
    7. Вымойте 4x в течение 15 мин в 0,1% полиоксиэтиленсорбитан монолаурата 1x PBS при комнатной температуре. Для окрашивания ядер клеток-хозяев добавить DAPI (150 нМ конечная концентрация) во время первого из этих 15 мин стирок.
    8. Для сохранения флуоресцентно-меченного личинок, инкубировать их постепенно в градиенте глицерина 15, 30, 60, и 80% разбавленного в 1х PBS и 0,1% полиоксиэтиленсорбитана монолаурат в течение 2 ч (при комнатной характеромратура) на ночь (при 4 ° С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Витражи личинки могут храниться в течение длительных периодов времени в 80% глицерина при 4 ° С (например, 4 месяца.).
  7. Микроскопических изображений из фиксированной данио рерио личинок
    1. Трансфер фиксированной глицерина встроенный личинок небольшую каплю 80% глицерина в 35 мм чашки Петри (для стереомикроскопии) или полный стеклянным дном блюдо (для конфокальной miscopy).
    2. Возьмите Z-стека изображений серию зараженных личинок и обработки изображений в соответствии с требованиями.
    3. Используйте эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии и цели 10X или 20X для визуализации всего организма. Затем с помощью конфокальной микроскопии и цели 40X, 63X, или 100X для визуализации отдельных клеток и способствуют вербовке аутофагии и цитоскелета маркеры для отдельных бактерий в естественных условиях 19 (4A и 4B).
      Примечание: Infect рыбу в хвостовой мышцы и смонтировать в квартире глицерина в нижней части со стеклянным дном тарелки, с тем чтобы EAсы внимание.
  8. Жить микроскопических изображений зараженных данио рерио личинок
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки оптически доступны, таким образом, в естественных условиях аутофагосом могут быть визуализированы с помощью GFP-LC3 данио трансгенной линии 25. Инфекция данио личинки, как описано в разделе 3.3 и крепление, как описано в этом разделе.
    1. Подготовьте легкоплавких 1% агарозы (LMA) в Е2 и дать остыть до 35-37 ° С, чтобы избежать повреждения личинки / убийство. Распределите капель LMA в 35 мм чашки Петри (для стереомикроскопии) или полный стеклянным дном блюдо (для конфокальной микроскопии).
    2. Передача под наркозом данио личинки индивидуально (с минимальным воды, как это возможно) к LMA падает. Orient личинки в нужное положение с помощью кисти и ждать агарозы затвердеть.
    3. Обложка весь блюдо поверхность с LMA, и наложение с E2, содержащий 200 мкг / мл Tricaine избежать препарат от высыхания и позволить рыба обменять кислород из воды.
    4. Используйте эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии и 10X или 20X цели для визуализации всю данио личинки. Используйте конфокальной микроскопии и цели 40X, 63X, или 100X визуализировать бактериальных authopagosomes (т.е., GFP-LC3 положительной вакуоли окружающие Shigella) в естественных условиях.
    5. Возьмем Z-стек инфицированных личинок в течение долгого времени (например,., Каждые 2 мин в течение нескольких часов), чтобы визуализировать аутофагосом, и их динамика в режиме реального времени.

4 Функциональный анализ аутофагии и цитоскелета в Vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие фармакологических и генетических возмущений аутофагии на течение инфекции может контролироваться на уровне целого животного, и на уровне одной клетки.

  1. Аутофагия Манипуляция Морфолино инъекций
    1. Развести морфолино олигонуклеотидов в стерильной воде до исходного раствора 1 мМ при нагревании при 65 ° С в течение 10 мин. Магазинпри комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: морфолиновые Олигонуклеотидные инъекции должны выполняться в 1-4 клеточной стадии эмбрионов.
    2. Подготовьте морфолиновое олигонуклеотидную рабочего раствора стерильным 0,1% фенола красного в фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко. Загрузите иглу, как описано в разделе 3.4.2., Морфолино олигонуклеотид объем впрыска может быть откалиброван, как описано в разделе 3.4.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный поможет визуализировать объем введенного.
    3. Подготовьте камеру эмбрион-позиционирования (т.е.., Стекло микроскопа склеены цианоакрилата на 10 см Петри крышкой в с краев, стоящих иглу частично удалены). Передача 1-4 клеточной стадии эмбрионов в камеру с небольшим количеством воды и приведения их в соответствие с тонкой кистью.
    4. Проникнуть хориона и желток гладко. Оказавшись внутри, нажать на педаль, чтобы придать нужный объем морфолиногруппу олигонуклеотидным решения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать объем инъекции до 0,5 - 2 NL; Объемы выше тхан 5 NL может вызвать дефекты развития и увеличения смертности икры.
    5. После микроинъекции, чистые эмбрионы (по отбеливания, как описано в разделе 3.2) и инкубировать их в чашку Петри с Е2 на 28 ° C.
    6. Инфекция 72 ч контроль сообщение оплодотворения (т.е., данио личинки вводили контроль морфолинодоксорубицин олигонуклеотида) или P62 морфантов (т.е.., Данио личинки вводили p62 морфолинодоксорубицин олигонуклеотида) с Shigella, как описано в разделе 3.4. Оценка выживаемости и бактериальной нагрузки в течение следующих 2-5 дней, как описано в разделе 3.5. Изображение фиксируется данио личинки, как описано в разделе 3.7 и выделены фиг.4С, или живой образ данио личинки, как описано в разделе 3.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная доза морфолиногруппу олигонуклеотид может быть оценена на основе ее эффективности ингибировать транскрипция сплайсинга или трансляции белка (см Обсуждение).

Representative Results

После заражения культуры тканей в пробирке, S. flexneri может уйти от фагосомы и вторгнуться в цитозоль. В цитозоле клетки-хозяева могут предотвратить актина основе моторику Shigella по compartmentalizing бактерии внутри septin клетках (1А). Бактерии захваченные septin клетках также может быть помечены аутофагии маркеров p62 (Рисунок 1В) и LC3 (Рисунок 1C). Эти наблюдения выделить новый механизм иммунной защиты, который ограничивает распространение инвазивных патогенов, а также выявить новые связи между аутофагии и цитоскелета. Поразительно, истощение аутофагии маркеров значительно снижает septin арретирования бактерий (рисунок 2А), и работа также показала, что истощение septin арретирования значительно снижает вербовку аутофагии маркеров 8. Таким образом, по крайней мере, в случае Shigella, septin сепаратором и аутофагосом формирования кN можно рассматривать как взаимозависимых процессов. Другие сотовые требования к компартментализации Shigella по septin клетках включают полимеризацию актина и актомиозина деятельности (Рисунок 2B).

Там нет естественного мышиная модель дизентерии, и исследование Shigella патогенеза, septin биологии и бактериальной аутофагии в естественных условиях могут воспользоваться новой модели животных инфекции, данио личинки 19. Можно заразить данио личинки путем введения бактерий в различных анатомических участках, таких как хвостовых внутривенных инъекций для экспериментов выживания, и хвостовой мышечных инъекций для микроскопии в естественных условиях (Рисунок 3А). В зависимости от дозы, S. flexneri вводят в данио личинки могут быть очищен в течение 48 ч после заражения, или может привести к прогрессивным и в конечном счете смертельной инфекции (Цифры 3B - 3D). Shigella вирулентность фаctors выражены при 28 ° С, оптимальная температура роста рыбок данио, и данио инфекция Shigella строго зависит от его типа III системы секреции (T3SS) 19, необходимо вирулентность определяющим в человеческой болезни. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что данио личинка представляет собой ценный нового хозяина для анализа в естественных условиях Shigella инфекции.

Оптический доступность данио личинок позволяет визуализировать septin арретирования в естественных условиях (рисунок 4А), достижение, что никогда прежде не было осуществлено с использованием млекопитающих модели хостов. В дополнение доказательства того, что septin клетки завлечь бактерии, ориентированные на аутофагии в естественных условиях, можно заразить трансгенных данио личинки выражая GFP-LC3 и наблюдать вербовки аутофагии маркера для Shigella (Рисунок 4B). Для ultrastrucutral анализа Shigella аутофагосом в естественных условиях, элectron микроскопия может быть использована, чтобы четко показать цитозольную секвестр бактерий двойным мембранных вакуолей 19. Аутофагия рассматривается как ключевой компонент клеточно-автономным иммунитета и решающий механизм защиты против intracytosolic бактерий 14-16. Чтобы охарактеризовать функцию аутофагии в живом организме, P62 морфолино, обработанных данио личинки могут быть использованы. В отличие от основной аутофагии техники [например., В 36 аутофагии связанные белки (ATGs) 26], p62 не является необходимым для развития позвоночных 27 и, таким образом, данио личинок может нормально развиваться до заражения. Поразительно, p62 обедненного личинки заражают S. flexneri результат в значительно повышенной смертностью и повышением бактериальной нагрузки 19. В соответствии с работой в пробирке, показывающие, что septin сепаратором взаимосвязано с аутофагосом формирования 7,8, septin набор в Shigella заметно снижается в p62 обедненного личинок (

Рисунок 1
Рис.1 septin клетке в пробирке. (A) HeLa клетки были инфицированы S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, помечены с антителами к SEPT9 и фаллоидином, и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Шкала бар, 1 мкм. (B) HeLa клетки были инфицированы S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, помечены с антителами к p62 и SEPT2, и изображается флуоресцентного световой микроскопии. Шкала бар, 1 мкм. (С) HeLa клетки трансфицировали GFP-Atg8 / LC3, инфицированных S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, помечены с антителами к SEPT2, и изображается люминесцентных мимикроскопия. Шкала бар, 1 мкм. Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 7.

Рисунок 2
Рисунок 2 Сотовые требования для формирования Shigella -septin клетки. (А) HeLa клетки были обработаны с контролем (CTRL), P62, ATG5, ATG6 или ATG7 миРНК. Всего-клеточные лизаты из миРНК-обработанных клеток были иммуноблоттингу для GAPDH, p62, ATG5, ATG6 или ATG7 показать эффективность миРНК истощения (вверху). миРНК обращению клетки были инфицированы S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, и маркируется при количественной микроскопии. Графики (внизу) представляют собой средние значения ± SEM% от Shigella внутри SEPT2 клеток из н ≥3 экспериментов в лечении. (B), HeLa клетки были инфицированы S. еlexneri, обрабатывают ДМСО, цитохалазин D (CytD), latrunculin B (LATB), нокодазол (NOCO), или blebbistatin (Bleb) и после 4 часов 40 мин были зафиксированы и маркируется при количественной микроскопии. Графики представляют среднее% ± SEM из Shigella внутри SEPT2 клетках от двух независимых экспериментов в лечении. Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 7.

Рисунок 3
Рисунок 3 данио модель Shigella инфекции. (A) изображения для иллюстрации ориентацию данио личинки под стереомикроскопом. (Левая панель) Данио рерио Личинки 72 часов после оплодотворения были расположены горизонтально в инъекции пластины с их спинной стороной инъекционной иглой. (Средняя панель) инфекции кровотока проводили инъекциюкаждым из бактерии (красный раствор) в хвостовую вену, задняя на открытие мочеполовой. (Справа) Заражение в хвостовой мышцы проводили путем инъекции бактерий (красный раствор) в течение сомитов. (В) Выживание кривые 72 часов после оплодотворения личинок вводили различные дозы S. flexneri и инкубировали при 28 ° С в течение после инфицирования 48 час. Эффективная Инокулят классифицируется как низкий (<10 3 КОЕ, белые кружки), средних (~ 4 х 10 3 КОЕ, открытые треугольники) или высокой (~ 10 4 КОЕ, светлые квадраты). Средний% ± SEM (турники) от п ≥3 экспериментов в классе посевной. (C) Перечень живых бактерий в гомогенатах индивидуального личинок в разное время после заражения, измеренное при посеве на LB. Обратите внимание, только личинки пережив инфекции включены в анализ перечисления. Среднее ± SEM (горизонтальные полосы) также показано. (D) Распределение GFP- Shigella определяетсяЖивая съемка с использованием флуоресцентного стереомикроскопа в разное время после заражения, используя низкий, средний или высокий дозы инокулята (хвостовые внутривенных инъекций). Наложение изображения передачи (серый) и GFP флуоресценции (зеленый) (B) -. (D) Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 19.

Рисунок 4
Рисунок 4 клеточной биологии из Shigella инфекции в естественных условиях. () Данио рерио Личинки были инфицированы в хвостовой мышцы с GFP- Shigella (низкой дозы) в течение 24 часов, фиксированной, помечены с антителами против SEPT7 (красный) и GFP (зеленый ), и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Шкала бар, 5 мкм. (B) GFP-LC3 данио личинки были инфицированы mCherry- Shigella (средняя доза) для4 ч, фиксированной, помечены с антителами против mCherry (красный) и GFP (зеленый), и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. . Шкала бар, 1,5 мкм (C) Данио рерио Личинки обрабатывали либо контроля (CTRL; левого изображения) или p62 (правое изображение) морфолины были инфицированы GFP- Shigella в течение 4 ч (средняя доза), фиксированной, помечены с антителами против SEPT7 ( красный) и GFP (зеленый), и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Стрелки выделить некоторые примеры Shigella захваченные в septin клетках (Ctrl) или нет (p62 истощены) почтовое инфекции с 4 часами. Шкала бар, 5 мкм. Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 19.

Discussion

При мониторинге аутофагию и цитоскелета в пробирке с помощью культуры тканей, протоколы, описанные в разделах 1 и 2 могут быть применены к широкому кругу видов ткани клеточной культуре. Кроме того, следить аутофагии (например, Atg8 / LC3 положительной аутофагосом) и цитоскелета (например., Актин хвосты, septin клетки) динамика в режиме реального времени во время Shigella инфекции с использованием живого изображения, культуры тканей клетки могут быть трансфицированы с помощью GFP-, RFP- или CFP-меченые конструкции, как описано выше 7,8. Чтобы увеличить процент клеток, инфицированных Shigella (т.е., как правило, желательно, чтобы в режиме реального времени анализа, учитывая, что Shigella могут вторгнуться 5-30% от HeLa клеток на 100:. 1 МВД), непосредственно добавить 400 мкл Shigella (OD 600 = 0,3 -0,6) к клеткам в 2 мл MEM (с недостатком сыворотки) и подождите не менее 1,5 часа после инфицирования в течение достаточного бактериальной вступления, вырваться из фагосом, репликации, AUtophagy признание и septin арретирования. Альтернативно, можно использовать напряжение Shigella M90T AfaI, выражающую адгезина AFAE и гораздо более высокие способности вторжения в эпителиальных клетках по сравнению с M90T штамма 28. Следует отметить, что штамм M90T AfaI еще не был протестирован на крысах с данио. Плиты Shigella колоний можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2-3 дней и использовали в течение нескольких экспериментах. Тем не менее, с течением времени, колонии Shigella, потерявшие плазмиды вирулентности также может поглощать Конго красным и, кажется, сохранили свою плазмиды вирулентности. По этой причине мы рекомендуем использовать свежие бактериальные акции, когда это возможно.

При контроле клеточной биологии инфекции в естественных условиях, протоколы описаны в разделах 3 и 4 использования дикого типа AB линии данио. Для мониторинга Шигеллы -leukocyte взаимодействия, трансгенные данио линии могут быть использованы, например, MPX: GFP или Lyz: DsRed чтобы визуальнаяИзе нейтрофилы 19,29,30 или MPEG1: mcherry визуализировать макрофаги 19,31. Для визуализации аутофагию в живом организме, GFP-LC3 данио трансгенной линии 19,24 могут быть использованы, как описано в разделе 3.8.

Возмущать аутофагию в естественных условиях, эффективная доза морфолино олигонуклеотид должен быть оценена экспериментально на основе его эффективности ингибировать транскрипция сплайсинга или трансляции белка. Желательно, чтобы выполнить эксперимент титрования и подтвердить истощение помощью ОТ-ПЦР (для сращивания морфолино олигонуклеотида), или с помощью SDS-PAGE (для поступательного морфолино олигонуклеотида) 32. Выделение РНК из эмбрионов данио рерио или личинок может быть выполнена с использованием экстракции гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ. Для извлечения белка из данио личинок (от 8 до 15 личинок / трубки), механически гомогенизации с помощью пестика в 200 мкл буфера для лизиса (1 М Трис, 5 М NaCl, 0,5 М ЭДТА, 0,01% октилфенол окись этилена для конденсатае и ингибитор протеазы). Пробирки центрифужные на 19 000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин и передать супернатант в новую пробирку. Добавить буфере Лэммли и нагрева образца при 95 ° С в течение 15 мин. Лизаты можно хранить при -80 ° С до тех пор, пока это необходимо, и может быть оценена с помощью Вестерн-блоттинга, как описано в разделе 2.3.

Данио является прекрасной моделью для в естественных условиях применения препарата. Анализ с помощью морфолино олигонуклеотиды могут быть дополнены с установленными наркотиков манипулировать аутофагии (например, рапамицин и bafilomycin). Неинфицированные и / или инфицированных личинок можно лечить с помощью рапамицина (1,5 мкМ) или bafilomycin (80 нМ), разведенным в E2 и аутофагической поток может быть оценена с помощью Вестерн-блоттинга, как описано в 25,33. Следствием аутофагии манипуляции на исходе инфекции и выживания инфицированных личинок можно оценить, как описано в разделе 3.5.

В дополнение к изучению клетки-хозяинадетерминанты, в пробирке и в естественных условиях протоколов могут быть применены для оценки бактериальной детерминанты, необходимые для распознавания аутофагии, с помощью бактериальных мутантные штаммы, которые по-разному распознаваемых аутофагии, например., Shigella ΔicsA (белок Shigella ICSA набирает N-оса и затем Arp2 / 3 для актина хвост и формирования septin клетки; в его отсутствие не может быть никаких актина хвосты, не septin клетках) и ShigellaΔicsB (Shigella избегает аутофагической ответ по бактериальной эффекторной белка ICSB, что предотвращает вербовку аутофагии техники в ICSA, в его отсутствие может быть больше septin клетки, более аутофагии) 7,8.

Shigella не является естественным возбудитель данио и растет оптимально при 37 ° С. Тем не менее, исследования показали, что факторы вирулентности, необходимые для Shigella вторжения, вырваться из фагоцитарной вакуоли и репликации в сутосол может быть выражена и функциональны в данио личинки при 28 ° С 19. 28 ° С является наиболее часто используемым температура для выращивания и данио стандартной температуре, чтобы обеспечить развитие нормального данио 23. Поразительно, основные патогенные события, которые приводят к дизентерии у человека (т.е. макрофагов гибели клеток, инвазии и размножения в эпителиальных клетках, распространение от клетки к клетке, воспалительные разрушение эпителия хозяин) достоверно воспроизводит в данио модели Shigella инфекции 19.

Аутофагии и цитоскелета гены экспрессируются повсеместно и имеют широкий спектр биологических функций. Исследования мыши показали, что нокаут важно аутофагии 26 или septin генов 5 эмбриональные смертельным, и вполне вероятно, что некоторые из этих генов также будет иметь важное значение для рыбок данио развития (хотя эта проблема может быть уменьшена на то, что данио имеют несколькопаралогичных гена 33). Если это так, есть несколько альтернатив, чтобы преодолеть эту проблему, в том числе (I) с использованием фармакологических реагентов для регулирования аутофагии и цитоскелета, (II) морфолины можно титрованным вниз, (III) нокаут генов может быть предназначен только для конкретной ячейки типы, и / или (IV) гены, вовлеченные в аутофагической признания, которые не являются необходимыми для развития животных (например,., p62) могут быть направлены.

В то время как данио является идеальной моделью системы для расследования аутофагии и цитоскелета во Shigella инфекции, молекулярные инструменты в настоящее время нет. Поле должна разрабатывать новые инструменты и привод клеток конкретное выражение белков, представляющих интерес. Чтобы сбить экспрессию генов аутофагии / цитоскелета, новые последовательности морфолиновые требуются, и новые методы генной инженерии (например, Talen, CRISPR / Cas9) также может быть использован. В то же время, несколько инструментов, ранее Генерация человека или мыши исследованийможет одинаково работать для рыбок данио.

Внутриклеточные бактерии S. flexneri стала исключительной модельного организма для решения ключевых вопросов в биологии, в том числе способности бактерий быть признанной иммунной системы 1,2. Клетка-хозяин использует septins ограничить подвижность S. flexneri и нацелить их на аутофагии, одним из важнейших компонентов клеток автономной иммунитета 7,8. Эти наблюдения позволяют предположить новую молекулярную структуру для изучения аутофагии и его способностью разрушать цитозольные бактерии. Одним из основных вопросов в настоящее время в полной мере расшифровать основные молекулярные и клеточные события, и для подтверждения этих событий, проанализированных в пробирке в течение бактериальной инфекции в естественных условиях, используя соответствующие модели животных. С этой целью, данио был создан в качестве ценного нового хозяина для анализа S. flexneri инфекция 19. Взаимодействия между бактериями и клетками-хозяевами могут быть отображены в высоком разрешении, имодель данио должна оказаться полезной для понимания клеточной биологии из Shigella инфекции в естественных условиях. Данио рерио Личинки могут быть использованы для изучения роли бактериальной аутофагии в защите хозяина, и исследования показали, что, что возмущение аутофагии может отрицательно повлиять на выживание хозяина в ответ на Shigella инфекции 19.

Наблюдения, полученные от изучения Shigella, septin арретирования и аутофагии в пробирке с помощью культуры ткани клеток и в естественных условиях, используя данио личинки могут обеспечить фундаментальные достижения в понимании защиту хозяина. Они могли бы также предложить разработку новых стратегий, направленных на борьбу с инфекционными заболеваниями.

Критический Целью данного отчета является разобраться в молекулярных и клеточных событий, проанализированных в пробирке (т.е., аутофагии, актин хвосты, septin арретирования) во время бактериальной инфекции в естественных условиях в контексте ЛОРГнев организм, используя данио личинки. Если не знакомы с данио биологии и обращения, можно сослаться на в протоколах глубины для правильного данио хозяйства 23 и в естественных условиях анализа данио инфекции 19,35.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Работа в лаборатории SM поддерживается Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B1793 
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Borosilicate glass microcapillars  Harvard Apparatus 30038
Coarse manual manipulator  Narishige M-152
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C6762
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes D1306
Dumont #5 fine tweezers Fine Science Tools 11254-20
Forchlorfeneuron  Sigma-Aldrich 32974
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A 
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probes N/A
JetPEI transfection reagent Polyplus transfection 101-01N
Latrunculin B Sigma-Aldrich L5288
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
Low melting agarose Promega V2111
MatTek glass bottom dish MatTek corporation P35G-1.0-14
MEM plus L-alanyl-L-glutamine  GIBCO 41090028
MEM non-essential amino acids solution GIBCO 11140-035
Microinjector  Narishige IM-300
Micropipette puller device  Sutter Instrument Co., Novato, P-87 
Mineral oil Sigma-Aldrich P35G-1.0-14
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody  Sigma-Aldrich T6793
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
N-phenylthiourea  Sigma-Aldrich P7629
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Phalloidin  Molecular Probes A12379
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Protease inhibitor cocktail Roche 4693116001
p62/SQSTM1 antibody Cliniscience PM045
Rapamycin Sigma-Aldrich R8781
Sodium pyruvate GIBCO 11360039
Transfection reagent Life Technologies 12252-011
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI  Vector Laboratories H-1500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4, (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4, (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2, (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61, (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5, (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25, (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).
Использование<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Для изучения аутофагии-Цитоскелет взаимодействий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).More

Mazon Moya, M. J., Colucci-Guyon, E., Mostowy, S. Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions. J. Vis. Exp. (91), e51601, doi:10.3791/51601 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter