Summary
ゼブラフィッシュ胚は、発生生物学の研究のための優れたモデルである。胚発生の間に、ゼブラフィッシュは、試料観察および分析のための3次元の課題が卵黄塊で開発しています。このプロトコルは、その場でホールマウントの準備を取り付ける2次元の平面を作成する方法について説明します（WISH）は、ゼブラフィッシュ胚の標本を染色した。
Abstract
ゼブラフィッシュ胚は、現在一般的に発生過程の遺伝子制御を調査すると、先天性異常をモデル化するための基本的および生物医学研究のために使用されます。人生の最初の日の間に、ゼブラフィッシュ胚は受精、胸の谷間、原腸形成、セグメンテーション、および腎臓などの構造物の器官、心臓、中枢神経系を含む多くの発達段階を経て進行する。胚は丸い卵黄塊に関連して開発しているため、若いゼブラフィッシュ胚の解剖学は、これらのイベントの多くに関与した組織の可視化と分析のためのいくつかの課題を提示。したがって、このような全体のin situハイブリダイゼーション （WISH） でマウントを使用して染色ものと尾芽（それぞれ10および19時間後に受精（HPF）、）20体節期の間に一定の胚標本、実験の表現型の正確な分析とイメージングのためには、多くの場合、卵黄bから胚を除去することが望ましいすべてのスライドガラス上に平らに配置するために。しかし、フラットマウント手順を実行すると、面倒な場合があります。そのため、フラットな準備をマウントに成功し、効率的な大幅解剖技術の視覚的なデモンストレーションを通じて促進し、また、最適な組織の取り扱いを支援する試薬を使用することによって助けられる。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現の1つまたは2つの色検出のための私達のWISHプロトコルを提供し、平坦な取付手順は固定染色された標本の本実施例を行うことができる方法を実証する。この平坦な取付プロトコルは、初期のゼブラフィッシュの開発中に出現する多数の胚の構造の研究に広く適用可能であり、固定された胚のサンプルに対して実行される他の染色法と組み合わせて実施することができる。
Introduction
ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、発生生物学の研究に広く用いられている有機体になっています。ゼブラフィッシュは、家族コイ科に属する熱帯淡水脊椎動物種である。彼らは簡単に、得られる安価で、かつ1を維持することが容易であったとしてゼブラフィッシュは元々 、潜在的な水質汚濁物質の危険性についての情報を得るために環境調査のために使用された。最後の30年間で、ゼブラフィッシュは、理由のホストの遺伝学的に扱いやすい脊椎動物のモデルシステムとして認識されるようになった。ゼブラフィッシュは、哺乳類2,3を含む高等脊椎動物で解剖学や生理学的な保全の高いレベルを示している。近年のゲノム配列のアノテーションは、ヒト遺伝子の約70％が少なくとも一つのゼブラフィッシュ相手4を有することを明らかにした。例えば、腎臓発生の間に重要な役割を果たす多くのオーソログ遺伝子はこれらの種5-7との間に同定されている。このDRA細胞および分子生物学に関しての保全のマチック程度はゼブラフィッシュ8でのヒトの疾患の広い範囲のためのモデルを作成するために研究者を可能にしましたし、ゼブラフィッシュは、化学遺伝子スクリーニング9を使用して、潜在的な薬物療法を識別するための貴重なツールとなっている。
さらに、ゼブラフィッシュのモデルだけでなく、人間に見られる複雑な発生過程および種々の疾患状態を再現することができるが、いくつかの追加の属性も発生学的研究のためのモデル生物としての魅力を高める。ゼブラフィッシュは卵生であり、受精10の開始から胚への容易なアクセスを研究者に提供し、放送産卵を通じて再現。他の利点は、胚の大きさ、透明性、迅速な、外部開発10を含む。さらに、ゼブラフィッシュ大人高い繁殖力を有し、一般的に200〜500の範囲であり得る比較的大きなクラッチサイズを生成週、最終的に9とを容易に、そのような表現型基づく化学画面等のハイスループット実験を行う研究者を可能にする。
そうであっても、ゼブラフィッシュモデルによって展示されている利点の茄多にもかかわらず、初期の発達段階から得られた実験結果の分析やコミュニケーションに関連する課題がある。いくつかの場合において、ゼブラフィッシュ胚の固有の解剖学的構造は、一のデータの視覚化を不明瞭ことができる。開発が進むにつれて11は受精後、最初の細胞は、複数の切断事象を受ける。原腸形成後、胚軸が、それが卵黄11の周りに巻かれるように、尾芽段（10ゼブラ）に現れる。その後の開発は、セグメンテーション期間を経て進行すると、トランクが大量に成長し、また、卵黄の部分と一緒にテールが中央卵黄塊から自分自身を拡張する嚢ように、軸方向の伸びにより長くなります11。尾芽胚と20体節期（19 HPF）の間には、望むように種々の染色プロトコルの利用後に特定の発達の特徴を観察しようと、両方が原因の胚と不透明の形状に可視化し、写真に挑戦することができます卵黄嚢。これらの課題を解消する一つの方法は、卵黄を除去し、次いで、より直接的な方法で解析することができる二次元の検体中に胚を平坦化することである。
次のプロトコルおよびビデオリソースが正常deyolkとフラット1または2色のWISH染色の例を使用して、固定および染色後、胚をマウントする方法のためのガイドを提供する。 WISHは保存試料における特定の核酸の検出を可能にし、従って、組織内で検出される遺伝子発現の部位（単数または複数）を可能に広く使用される技術である。 WISH技術が広範に記載されており、並びにインフルエンザのような様々な色基質を用いて行うことができるorescent検知システム12月20日 。ここでは、開発の尾芽とセグメンテーションステージ間のゼブラフィッシュ胚に使用私たちの修正されたWISHプロトコルを提供。下のプロトコルの冒頭で述べたように、代替WISHプロトコルは、しかし、ここで説明するフラットマウント手順に対応しています。また、平坦な取り付けは、例えば、このプロトコルに記載されていない全載免疫組織化学、または細胞系統追跡ラベルのような既存の可視化技術の任意の数と組み合わせて利用することができる。全体的にフラットな実装技術は、より良いゼブラフィッシュ胚発生の初期段階での実験から得られたデータの優れた分析とプレゼンテーションを可能にすることができます。
Protocol
このプロトコルで説明するゼブラフィッシュ胚を操作するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。注：パート1-5に記載の手順を、代表的な結果にここで提供胚画像を生成するために使用した。代替WISH手順12から16まで 、またはそのような特異的な抗体を用いて、特定のタンパク質のための免疫組織化学的標識のような他の視覚化技術を必要に応じてパート1-5で説明する手順は、置き換えることができる。パート1-5に記載されているプロトコルは、初期胚の固定と最終染色の固定ステップでWISHのゼブラフィッシュの胚にフラットマウントを実行する際に、フラットマウントするためのサンプルから卵黄顆粒を除去する能力に影響を与える主要な操作があります。初期固定を解凍したての氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ 1×PBSとの固定が行われる場合に最良の平坦な取付結果が得られる（新たに解凍する必要はありません）氷冷4％PFA/1x PBSで最終ウィッシュ染色反応、およびそれが部品6-8との組み合わせで代替染色法を代入するとき、読者はこのことを考慮することをお勧めします。
1。胚の収集、ボール、およびストレージ
- 彼らは一晩分割器によって分離されるように、システムの水室に大人のゼブラフィッシュのオス（S）と女性（複数可）を配置することで、相手のケージを用意します。
- 大人の間の仕切りを取り外し、同等の胚の段階を持っているクラッチを収集するために、相手の〜15〜30分以内に細いワイヤメッシュ茶こしを使って受精卵を収集します。
- 逆さまにストレーナを回して、E3溶液約25ミリリットルを含むインキュベーション皿に胚を転送するために噴霧ボトルから分配E3の細い流れで表面を洗い流してください。
- クラッチを収集した後、約50〜60胚をインキュベートするようないくつかの皿に分割するE3溶液25mlを各皿中。注：胚の過密クラッチとケアが必要な段階（S）のタイムリーな収集を可能にするため、これを避けるために注意するべき以内劇的な発達の非同期につながることができます。
- ゼブラフィッシュ標準ステージングシリーズ11に応じて発達評価を可能にするために28.5℃で胚を培養する。
- 優しく平底マイクロ遠心チューブに、20体節期（19 HPF）まで、選択した時点で胚の希望数を配置するためにプラスチック製のトランスファーピペットを使用してください。注：これらは脆弱であり、容易にホールピペットで破砕や積極的な取り扱いによって損傷することができるので、若い胚の取り扱いに注意してください。あるいは、ガラスバイアルは、胚の固定および処理のために使用することができる。後続のすべてのプロトコルの洗浄用プラスチック移送ピペットはリボプローブを添加および除去する（ステップ3.11、3.14）を除いて、利用することができる。
- 氷冷4％PFA/1x PBSでE3を交換し、室温または4℃で一晩4時間、4％PFA/1x PBSに彼らの絨毛膜における胚を固定します。注意書き：PFAは毒性があり、手袋、白衣を含む適切な保護具を着用しながら、PFAのソリューションは、化学フードで処理する必要があります。ストック溶液を作る場合でも、造粒、PFAは、静電荷によって分散させる傾向があることができるように加えて、PFA粉末は、例外的な取り扱いに注意する必要があります。典型的には、PFA PFA粉末を溶解するために沸騰する1×PBSを加熱することによって調製し、次いで溶液を-20℃でアリコートで保存されている溶液を冷却した後、微細堆積物を4％PFA/1x PBS中に存在する場合、フィルターは、0.45μmのフィルターシステムを通すことにより、凍結保存のために小分けする前に冷却液を滅菌する。のみ新たに調製されたか、新たに解凍、PFAは、胚のこの最初の（ つまり一次）固定に使用されている。
- に譲渡して、修正プログラムを削除し、1X PBSTで二回の胚を洗うインキュベーション一品。
- 実体顕微鏡下で胚を表示し、二対がオープン絨毛膜を引き裂くために使用されている間1対が優しく胚を活用するために使用されるように、胚を取り巻く絨毛膜を除去するために細かい鉗子の2ペアを使用しています。
2。胚透過化
- 残っている絨毛膜片を除去するために1X PBSTで二回すすぎ、その後、バックマイクロチューブやガラス瓶に絨毛膜を除去した胚を転送します。
- 1X PBSTを削除し、100％メタノール（メタノール）で2回の胚を洗う。
- 少なくとも20分間-20℃で胚を置きます。注：胚は一年以上MeOH中-20℃で保存することができる。メタノールは絨毛膜が粘着性になり、絨毛膜が除去されない限り、そのため、このステップに進まないでください。
- 100％のメタノールを除去することによって、胚を再水和および1×PBSTで二回、その後、50％MeOH/1x PBST、30％MeOH/1x PBST中で各5分間、室温でそれらを洗ってください。</李>
- 1X PBST 50mlに新たに解凍プロテイナーゼKストック（10 mg / ml）を25μlのを追加することによって、新鮮なプロテイナーゼK作業溶液（5μg/ mlの）を準備します。
- 胚から1X PBSTを削除し、胚の段階に基づいてプロテイナーゼKで使用液を交換し、インキュベート<= 1分間5体節; 1.5分間の10から12体節; 2分間の15体節、および3分間20体節。
- プロテイナーゼKワーキング溶液を除去し、1×PBSTで二回の胚を洗う。
- 1X PBSTを削除し、室温で少なくとも20分間、氷冷4％PFA/1x PBSで交換してください。
3。リボプローブの合成、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびプローブの取り外し
- 氷上で酵素を保ちながら、目的の遺伝子に対応する配列（いずれかのPCRの100〜200ngのDNAを含有する鋳型を組み合わせることにより、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中で室温にてアンチセンスリボプローブのインビトロ転写反応を組み立てるジゴキシゲニンまたはフルオレセインラベルリボヌクレオチド、適切なRNAポリメラーゼどの配列に依存して（SP6、T3、T7の2μLの製品または線形化されたDNAプラスミド1.5μgの記載12,13のように調製した）、2μlをPCR産物またはに組み込まれているDNAプラスミド上に存在する）、10倍転写緩衝液の2液、RNase阻害剤の0.5μL、および分子グレード蒸留水（DNアーゼフリーRNアーゼ）との20 ULの総容積にもたらす。注：10倍転写緩衝液を10〜20分間37℃の水浴中でチューブを配置することによって、あらかじめ温めておいて、すべてのコンポーネントが溶液中にあることを保証するために、後にボルテックスする必要があります。白いフレークが存在する場合は、再度別の5〜10分間、ボルテックスチューブをインキュベートする。転写バッファーが完全に溶解し、十分に混合されていない場合は、転写反応は低い収率を失敗するか、持つことができます。
- 成分を混合し、水浴中で2時間、37℃で各々の反応をインキュベートする。
- 反応TUを削除水浴から（S）であること、および50μlの全量をI緩衝液10倍アーゼ、I酵素DNアーゼの2μlを5μL、および分子グレードの蒸留水23μLを追加することで、各サンプル中のDNAテンプレートを破壊する、した後、水浴中で20分間、37℃で各チューブをインキュベートする。
- 後の工程でRNAペレット視覚化を容易にするために、グリコーゲンストックを1μl、続いて、3 M酢酸ナトリウム、pH 5.2および氷冷100％エタノール110μlを5μLを添加し、次いでインキュベートすることにより、各マイクロ遠心チューブ内のエタノール沈殿を行う少なくとも1時間、または一晩のために-20℃でチューブ。
- 遠心機の最高速度20分間4℃で、各マイクロチューブは、その後、100％エタノールの上清を除去し、70％氷冷エタノール100μlで交換してください。
- 遠心機で5分間、4℃で各マイクロチューブは、次いで、カ月の100μlを添加し、次いで最終的に、5分間、ペレットを乾燥させ、70％エタノール上清および空気を除去する分子状グレードはペレットを再懸濁し、光度計分光光度計を用いてリボプローブのストック濃度を定量化するための蒸留水。注意：ペレットが溶液になった後は、リボプローブの株式を氷上に保持し、-20℃で保存する必要があります。
- プレハイブリダイゼーションプロセスのための固定胚を準備するために、各試料から4パーセントPFA/1x、PBSを除去し、1×PBSTで二回の胚を洗う。
- 各単一平底マイクロ遠心チューブに1×PBST中25〜40の胚の間で転送します。注：胚の過密は後に不均一な染色につながる、お手入れが約40の胚を各チューブ内のサンプルサイズを制限するために注意する必要があります。
- HYB +の500〜1,000μlの各チューブに1×PBSTを交換してください。
- 70°Cに設定したオーブン内に胚のチューブ（単数または複数）を配置し、プレハイブリダイゼーションを行うために4時間この温度でそれらをインキュベートする。
- リボプローブ（ジゴキシゲニンおよび/またはfluorescの100〜500 ngのを追加することにより、リボプローブ/ HYB +溶液を調製EIN-標識）の新鮮なHYB +の500μlにし、それを予熱しする3.11に移行する前に、少なくとも20分間70℃で、このソリューションをインキュベートする。注：単一および/または二重の比色標識を用いて、複数の遺伝子転写物を検出するために、これらの遺伝子に対応するリボプローブの各々は、1つのリボプローブ/ HYB +カクテルに結合する必要がある。
- 胚の各管から+プレハイブリダイゼーションHYBを削除し、胚をカバーするのに十分なリボプローブ/ HYB +と交換してください。注意：一般的に、リボプローブ/ HYB +の200〜250μlを1平底マイクロチューブ内の胚を覆う必要がある。リボプローブ/ HYB +添加および除去は、典型的には、サンプル間の交差汚染を防ぐために、バリアピペットチップを用いて行われる。
- ribroprobe / HYB +に一晩70℃で胚を培養する。
- 洗浄溶液の次のセットを準備し、70℃で一晩、それらを事前に温める：50 SSCT formamide/2x％、2倍SSCT、および0.2×SSCT。注意：これは、50ミリリットルらを用意すると便利です過剰は室温で保存し、その後、将来の使用のために再加熱することができるので、各洗浄溶液のiquots。
- リボプローブ/ HYB + -20℃でピペットやバリアヒントやストアを使用して削除する注：典型的には、各リボプローブ/ HYB +混合は、信号の減少なしに数回（ 例えば 、3以上）を使用することができる。再利用リボプローブ/ HYB +は低いバックグラウンドに関連付けられているが、しかし、リボプローブ混合物は分解を受けることができ、再利用に留意してください。
- 70℃で30分間、50％formamide/2x SSCTで二回、胚を洗浄
- 70℃で15分間2倍SSCTで一度胚を洗う
- 70℃で30分間0.2×SSCTで二回胚を洗う
- 0.2×SSCTを外し、室温でMABTで二回の胚を洗う。
4。抗ジゴキシゲニン抗体インキュベーションおよび検出
- 新鮮なブロック溶液を調製する。
- MABTを外し、ブロックソリューションと交換TiONから。
- 室温で2〜4時間、ブロック溶液中で胚をインキュベートする。注意：長いブロックインキュベーションは若いゼブラフィッシュ胚の段階（<15体節）で最適な結果を提供します。長時間のブロックの手順を実行するには、室温または室温の組み合わせでプラス（〜8時間まで）8月12日時間、その後の4℃のインキュベーションを一晩をブロックインキュベーションを行う。
- 新鮮なブロック溶液（ 例えば 、ブロックの5ミリリットルあたり1μL）中の5000倍希釈することにより、抗ジゴキシゲニン抗体溶液を準備します。
- ブロックを削除して、抗体/ブロック溶液を加える。
- 箔のサンプルをカバーし、4℃でまたは室温で4時間撹拌を一晩インキュベートする。
- anti-digoxygenin/blockを削除し、MABTで胚を少なくとも10回洗浄する。注意：MABTの洗浄用に12ウェル皿に胚を転送します。これは、大きなサンプル量を処理するときに有用である胚を洗浄することができる速度を増加し、ndは、それが容易に立体顕微鏡下で染色反応（4.11ステップ）の進行をモニターすることができる。注：このステップでは胚は4.8の手順に進む前に、4℃でMABT中で一晩、それらをインキュベートすることにより、「超洗浄」することができ、中に時間のかかる監視を必要とする高いバックグラウンドを与える傾向があるプローブまたは汚れのために有用な治療法である仕事の日。
- 前染色バッファーと希望染色液（紫や赤基板）を準備します。
- MABTを除去し、室温で5分間プレ染色緩衝液中で胚を洗浄する。
- 前染色バッファーを削除し、染色液を追加。
- 実体顕微鏡下で胚の外観をチェックすることで、すべての15〜30分間、室温で染色反応の進行状況を監視します。注：染色の完了のために多くの時間を与える必要がある場合、染色反応の速度は、4℃にサンプルを移すことによって遅くすることができる。かつて4に冷却°Cただし、反応物を室温に加温することにより加速することができない。
- 染色反応が完了したら、染色溶液を除去し、1×PBSTに置き換える。
- 5分間1X PBSTで二回洗浄します。注：別の基板に他の遺伝子を検出していない場合は、少なくとも20分間、氷冷4％PFA/1x PBS中のサンプルを修正し、6.1に進みます。それ以外の場合は5.1に進みます。
5。抗フルオレセイン抗体のインキュベーションおよび検出
- 1X PBSTを削除し、室温で15分間ずつ、0.1Mグリシン、pHが2.2で二回の胚を洗う。注：グリシン洗浄の時間は、完全に第染色反応を失活することが不可欠である。
- 0.1 Mグリシンを除去し、室温で5分間MABTで二回、胚を洗浄する。
- 新鮮なブロック溶液（ 例えば 、ブロックの5ミリリットルあたり1μL）中の5000倍希釈することにより、抗フルオレセイン抗体溶液を準備します。
- MABTを削除して、抗体/ブロック溶液を加える。フォローフルオレセイン標識ribroprobeの検出を行うように4.6から4.13までを繰り返す。注：最終染色反応が完了した時点で、それは、サンプルの最後の定着氷冷4％PFA/1X PBSで行われることが必須である。暖かいPFAソリューションとの固定は、フラットマウント手順のための切開およびdeyolking中に胚から除去することは困難である粘着性の卵黄と関連付けられる傾向がある。
6。胚の解剖、胚の初期Deyolking
- フラット実装固定、染色された胚を選択します。
- 1X PBSTを含むプラスチックやガラスのペトリ皿に選択された胚のサンプルを配置するトランスファーピペットを使用してください。
- 実体顕微鏡下でお皿を置き、横ビューが取得され、頭と尾の端を可視化されるように、細かい鉗子やラッシュツールのペアを使用して胚をロールバックします。
- 目の切開を作るために細かい鉗子の1ペアを使用一方、Eヘッドと胚の尾の間の中央に位置した位置に卵黄と卵黄切開のためのレバレッジを提供するために、胚を保持するために細かい鉗子の第二の対を使用しています。注：または、卵黄2つの主要な切開、1頭に近く、胚の尾への他近づける。
- 細かい鉗子および/または卵黄セル空洞から卵黄をかき出すためにラッシュツールを使用します。
- 浮遊卵黄を削除するには、1X PBSTで優しく胚を洗浄します。
胚の7。ファインDeyolking
- 1X PBSTを1〜2滴でフラットなガラススライドに胚を移す。
- 優しく腹側（卵黄）、スライドガラス上に面した側に胚を配置するためにラッシュツールと細かい鉗子を使用してください。
- 胚は、スライドガラスに対して平らな位置に残るようにまつげのツールを使用して、1×PBST溶液中の端に胚をドラッグします。
- にラッシュを使用して静かに胚の腹側表面をこすり胚をリッピングすることなく、卵黄顆粒を除去するために、オール。同時にラッシュツールでこするながら胚を固定する細いピンセットを使用しています。注意：卵黄顆粒の除去は、5〜10分間繰り返しスクレイピングが必要になる場合があります。
- PBST溶液が過剰卵黄と雑然となったり、蒸発が開始された場合は、プラスチックまたはガラス転移ピペットを用いてスライドに1X PBSTを1〜2滴、新鮮を追加し、さらに卵黄顆粒のためのきれいな水でエリアに胚をドラッグ除去。
- 卵黄が十分に除去されたときに、穏やかに浮遊卵黄顆粒を除去するために、最終すすぎのための1×PBSTを含有するプラスチック又はガラスのペトリ皿に戻って胚を移動させるためにトランスファーピペットを使用。
- 100％のグリセロールを含有するプラスチック又はガラスのペトリ皿にプラスチックまたはガラストランスファーピペットを用いてdeyolked胚を移す。
- 胚を順応さ〜5分間、100％グリセロール中に胚を培養する。
8。スライドガラス上にマウントする
- 100％のグリセロールの1〜2滴での清浄なガラススライドにdeyolked胚を転送します。
- 腹側（卵黄）側は、スライドガラスを向くように胚を置きます。
- 胚はスライドガラスに対して平坦な位置に残るように、ラッシュツールを使用して、グリセロール滴の縁部に胚をドラッグ。胚軸が湾曲している場合は、ゆっくりと胚が直軸をスライド上に平らに配置することができるように、張力を緩和するために、残りの卵黄細胞膜に非常に小さな切開を作るために、微細鉗子を使用する。
- 18 X 18ミリメートルのガラスカバースリップの四隅に粘土の小さなくぼみを配置します。注意：代替として、真空グリース15の小滴の粘土の代わりに用いることができる。
- 試料周辺のグリセロール中の気泡の発生を最小にするためにカバースリップを釣り、胚にゆっくりとカバーガラスを配置します。
- 100％グリセロールのさらなる低下を入れるカバーガラスのカバースリップ側へとスライドガラスとの間の空間を充填する。
- を押し下げ、ゆっくりと慎重にカバースリップの四隅をしっかりとガラスの間に胚を配置し、ドリフトを排除する。注：胚を粉砕しないように注意してください。
- 必要に応じて、胚が配置されていない場合は、カバーガラスを除去するための細かい鉗子を使用しています。胚は再配置することができるように、追加の切開を作るために、胚および/または罰金鉗子の位置を変更するためにラッシュツールを使用します。繰り返して8.4から8.7を繰り返します。
- ステレオまたは複合顕微鏡のいずれかを用いて試料を観察および/または画像。
- フラットは、室温で一時的に数週間、4℃で暗所に段ボールスライドホルダー付きフラット準備をマウントまたは保管してください。注：WISH染色は、時間の経過とともに徐々に、特に赤色の基質の反応をフェードし、無期限にグリセロール中で保存することができません。グリセロールに保管した場合、紫色のシミにもに比べてより容易に消えPFA（ステップ8.11参照）。興味深いことに、それはむしろグリセロールよりもパーマウントの取り付け胚は、室温15で無期限の貯蔵を可能にすることができることを出版されました。
- 紫色の基板染色したサンプルの長期保存のために、長期保存のために4％PFA/1x PBSでマイクロ遠心チューブに移し、その後、カバーガラスを削除し、1X PBST中で二回リンスした胚をすすぐ。注：または、1×PBST中の胚は、このような遺伝子型解析のためのDNAの分離などの追加の分析のために処理することができます。
Representative Results
平坦な取付プロトコル手順は、体軸が二次元の調製（ 図1A）内に、中央に位置する卵黄球に巻き付けされたその正常な解剖学的構造から、ゼブラフィッシュ胚の形質転換を含む。若いゼブラフィッシュ胚のホールマウントイメージングは、胚軸が卵黄の周りに巻かれている方法の性質によって制限されます。その結果、全体の横方向または背側のビューはステンド胚標本をマウントのみの軸の部分をキャプチャしたり、特定の組織（ 図1B）を不明瞭にすることができます。比較すると、胚のdeyolkingと平坦化は1時間（ 図1B）で視覚化されるために全体の胚軸を可能にします。これらの制限は、13を通って体節7に隣接して位置し、腎前駆細胞のサブセットをマークirx3b（紫）を検出するために、アンチセンスリボプローブで標識したWISH染色胚を、調べることによって証明され、ラベルMYOD1（赤）している体節（ 図1B）。 irx3b転写物は、中枢神経系に豊富に存在するので、irx3b +腎前駆細胞のフィールドは横方向のカメラアングルで可視化する腎フィールドが事実上不可能に、側面図をマウント全体に隠されている。フィールドは卵黄（ 図1B）の周りに巻き付けられるので、胚の背側のカメラビューに回転させると、さらに、irx3b +腎前駆細胞の分野は部分的にしか表示されます。しかし、フラットマウント以下同じ胚の背側のビューはirx3b +トランクや他の胚の構造（ 図1B）に沿って体節に関連して簡単な方法で分析しようとする腎前駆細胞のフィールド全体を可能にします。このように、精巧な空間領域は、理想的には、この方法で文書化することができます。
いくつかの主要なステップがフラットマウント手順の実行が成功に関与している。このtechniquを実行するにはE、卵黄球は、最初の胚を実体顕微鏡を用いて可視化している間このような微細なピンセットなど細かい楽器で行うことができ、適切な胚（ 図2A）から切り離されなければならない。卵黄球の粗除去した後、微細なラッシュツールは胚（ 図2B）に取り付けられたままである卵黄顆粒を削り取るために利用される。残りの卵黄顆粒の除去は、胚組織の視覚化を容易にするために役立つ。最後に、deyolked胚イメージングソフトウェア、顕微鏡に取り付けられたカメラを用いて試料の観察を助けるドキュメントを可能にガラススライド（ 図2C）上に安定的に位置決めするように操作される。ラッシュツールは、所望であれば、ハンドル（ 図3A、材料テーブル）の上に取り付けることができる瞬間接着剤を使用して、ピペットチップに好適なラッシュを取り付けることによって構成することができる自家製の装置である。異なるラッシュサンプルが生成するように調達することができます長さと、各ユーザーは、彼らがフラットなマウント手順を試して始めるとは異なるpredilectionsを持っていることがテーパー（ 図3B）、という点でわずかに異なる特性を持つツールをラッシュ。ラッシュサンプルの例は、当然、人間のまつげを当てる自然動物針金髪の毛やウィスカーを流し、最終的には市販のまつ毛の合成品種は小売化粧品部門で見つかったが含まれています。
周囲のガラススライド（ 図4A）上に位置するサンプルを含有する局所領域を高分解能分析のために画像化することができる。プローブの組み合わせは、サンプル（ 図4B、4Cを表示するために行われた2色の願いを込めて早期の発達段階での野生型胚における腎臓を引き起こす発展途上腎臓前駆細胞を標識した後、平らな準備をマウントするために使用された）。初期の体節段階では、腎前駆細胞は、目でU字型のパターンで区画されている付随してデルタC（DLC）（赤）（左の列、 図4B）6,7 を表現近中胚葉を囲む（紫）pax2a転写物の EIR式。 DLC転写物が紫色の基質を用いて検出し、後脳マーカーkrox20（赤）との組み合わせで標識した場合に比較して、腎前駆細胞の吻側サブドメインは、先に述べたように、DLC（右欄、 図4B）を発現することを可視化した6,7。フラットマウント調製物は、後に体節形成段階を研究するために同様に使用することができる。 14体節の段階では、体節（ 図4C）をマークし、腎マーカーpax2a、slc4a4、およびsmyhc1（赤）と一緒に（紫）slc12a3の発現を解析した。吻側サブドメインexprの中の細胞のサブセットを明らかにしながら、これらの組み合わせは、pax2a全体腎前駆細胞ドメインのマッピングを可能にslc4a4aを essedとslc12a3を表明し、腎前駆細胞の非オーバーラップ尾のサブドメインによって区別された。
二色WISHとフラットマウント調製物はまた、小分子への環境暴露6,7（ 図5）からの遺伝変異または他の摂動とゼブラフィッシュにおける器官形成中の細胞外ドメインの研究に貴重なものです。ゼブラフィッシュNLSとlibの変異体は、レチノイン酸（RA）の生合成に必要な酵素をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A2（旧RALDH2として知らaldh1a2、）に突然変異を保有する。 RAは、糸球体6,7として知られている胚腎臓の血液フィルターを作ることに寄与有足細胞の形成を含む多くの腎細胞型の適切な発達に必須である。願いがTの境界と同時にwt1aで足細胞前駆細胞を標識するために実施した彼は野生型胚におけるkrox20とsmyhc1と後脳と体節を開発し、変異胚、LIB変異胚、およびALDH酵素化学的阻害剤、DEAB（ 図5）で処理された胚をNLS。 DEABで処理した胚はwt1a転写物の抑止（ 図5、右欄 ） を示しながら、欠損aldh1a2発現を有する胚は、野生型の胚と比較して減少wt1a発現を示した。まとめると、これらの代表的な結果は、平らなマウント技術が初期胚での精度の解剖学的な違いを分析し、文書化するために使用することができ、貴重な発達の研究のために実施される方法を示しています。
図1。フラットマウントPREPAの概要ゼブラフィッシュ胚のための配給。中央卵黄塊を除去し、胚が安定的に平らな表面上に配置されているため、A）フラット取り付ける手順は、胚軸に沿った組織の同時表示を可能にします。B）全体の画像が、横方向と背側のビューでWISH染色胚をマウントし、した後、フラットマウントの準備を行った後に。胚はirx3b（紫色）およびMYOD1（赤色）をコードする遺伝子の転写産物を検出するためのアンチセンスプローブで染色した。
図2。ゼブラフィッシュ胚フラットマウント手順の概略。 A）胚が第著しく（B）は、卵黄の質量の大部分を除去するdeyolkedれる腹側表面を微細残りの卵黄顆粒を除去するためにdeyolkedされ、そして胚を洗浄した後、（C）は、視覚分析および/ または写真画像形成用のガラススライド上に背側を上に取り付けられている。
図3。例ラッシュツールの写真は細かい鉗子と比較。 A）自家製ラッシュツールは、ビューの上部に沿って設けられたミリ参照し、参照。B）細かい鉗子の隣にラッシュのツールの拡大図を提供するためのメトリック定規に隣接して配置され、細かい鉗子の標準組と一緒に画像化した。二つの異なるラッシュツールは、アスタリスク（*）で示されている自然ネコウィスカーを当てるから得られ、にトリミングしたラッシュをマークするために使用される、自然に流され、人間のまつげ、および二重アスタリスク（**）から入手したラッシュをマークするために使用やや平滑末端を作る。各カリフォルニア州SE、ラッシュはピペットチップに通すと、徐々にハンドリング装置に付着したピペットにラッシュを固定/安定化するための強力なシールを作成するために瞬間接着剤のいくつかのコートで貼り付けた。
図4。野生型ゼブラフィッシュ胚における腎前駆細胞分野における発達的変化の解析。 A）（B、C）に分析のために像形成されるエリアを示す概略をスライドさせて図1におけるB）野生型の胚、3、および5体節期を与える腎前駆フィールドの組成を評価するために二色WISHによって染色し胎児腎臓、または前腎に上昇。 （紫に染色された）転写因子pax2aをコードする（左の列）転写物は腎臓のPを含む胚のいくつかの集団をマーク中間中胚葉から出rogenitorフィールド。ノッチリガンドDLCをコードする転写は（赤く染色された）近軸中胚葉から形成体節をマーク。 （紫色に染色された）DLC転写物の発現および後脳rhombomereマーカーkrox20（赤色染色）が同じ胚で検査された場合（右カラム）、DLC発現は、体節に隣接して配置腎前駆細胞の吻側サブドメインで観察することができる）14体節段階で野生型胚は、体節マーカーsmyhc1（赤）腎マーカー（紫）の組み合わせで、二重または三重染色したpax2aとDLCの共染色中に隠された、C 1-5、 、および後脳rhombomereマーカーkrox20（赤色）。 （トップパネル）、この段階では、pax2a転写物は腎臓前駆細胞の境界を定めるために続けています。 （ミドル、下のパネル）の腎臓前駆細胞の領土内では、吻側サブドメインがマークされているslc4a4とslc12a3をエンコード転写産物で尾サブドメインをマーク。
（紫）wt1aの15体節段階で図5。遺伝的変異またはレチノイン酸の生合成を調節し、化学遺伝的摂動によって引き起こされる表現型を特徴付けるためのフラットマウント調製物の使用。WISH発現パターンとsmyhc1/krox20（赤）を比較したレチノイン酸（RA）生産における欠損を有する野生タイプと胚の間に起因するアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A2（NLSおよびLIBの変異）またはジエチルアミノ（DEAB）とレチナール脱水素酵素活性の化学阻害の欠陥に。 lib内のRA産生の減少は、このような、NLSよりも若干厳しいですLIB胚は野生型のDEAB処理をwt1a発現の完全な廃止に関連している同様に、NLSの変異胚を上演したよりもwt1a転写物のわずかに減少し染色を発現していること。
Discussion
ゼブラフィッシュは、ここ数年の間に、研究コミュニティ全体に非常に貴重なモデル生物であることが証明された。ゼブラフィッシュは、高等脊椎動物のそれと遺伝的保全の実質的な程度を示し、彼らの解剖学、繁殖、およびライフサイクルに関連する利点は、実験解析へのこの種は非常に従順にする。さらに、ゼブラフィッシュに適用できる分子技術の進歩は、さらに科学的研究で、このモデル生物の使用を推進してきました。例えば、トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の多種多様な疾患の進行を研究すると、器官形成などの開発の重要なメカニズムの基礎となる多くの基本的な質問に答えるために生成されています。
したがって、病気や発達研究の両面でのゼブラフィッシュの動的な使用に基づいて、細胞標識の方法論と信号定量化は、データ分析の重要な側面である。しばらく蛍光ANを利用する方法tibodiesトランスジェニックゼブラフィッシュにおけるタンパク質発現を検出するために使用することができ、研究者は、典型的には固定され、非トランスジェニックゼブラフィッシュ試料中の遺伝子転写の時空間的局在を調べるためにWISH 12-16のような標準的な手順に依存している。実際には、WISH 16は、生物学において最も広く使用される技術の一つであり、遺伝子変異、遺伝的および化学的摂動の表現型を特徴付けるために使用される重要なツールである。それにもかかわらず、願いが潜在的な落とし穴や課題の数に関連している。アンチセンスribroprobeの特異性を確認するために、センスリボプローブは、アンチセンスリボプローブ染色パターンの特異性を評価するための対照として使用することができる。セクション4及び5は、標識およびフルオレセイン標識プローブ、続いてジゴキシゲニン標識プローブの検出の順序で提示されているが、この順序を逆にすることもできる。典型的には、弱い信号（低い発現レベルを有する遺伝子）が最高のジゴキシゲニン標識プローブと、この染色で検出される検出と赤の基板を用いた強い信号（より豊富に発現された遺伝子）の染色に続いて紫色の基板で最初に開発しました。二色反応が行われようとしている場合は、その標識および基質の様々な組合せは、データ収集および分析のために最も適している手順を見つけるためにテストされることをお勧めします。また、セクション4-5に提供される抗体のインキュベーションおよび洗浄をブロックするために提供時間は、24時間後に受精より若い胚に合わせて調整されます。古い胚と同じ手順に長い間隔は、試料上の塩類集積につながることができます。標準ゼブラフィッシュ胚の願いをトラブルシューティングするための大規模なヒントは既に文献12から16に記載されています。おそらく最も一般的なジレンマが高い背景である。私たちは、必要に応じて、4.7、15〜20回の洗浄工程でMABT洗浄の数を増やすことをお勧めします、しかし、我々の経験を一晩MABT「スーパーウォッシュ」の他に、4.8の手順に進む前に、10以上の短MABT洗浄と併用すると優れた結果が得られます。別の例のジレンマは、長いリボで発生する可能性が貧弱なプローブ浸潤である。アルカリ加水分解によってリボプローブ次のステップ3.6をせん断して、これを相殺することができます。若いサンプルとの我々の経験では、プローブの毛刈りは通常、必要ありません。しかし、1本が望む実験の結果に寄与因子が可能のようなパラメータということを覚えておいてください、そしてあなた自身の中でWISHの実験パラメータを調整するために、必要に応じて、我々はコミュニティに既に公的に利用可能なこれらの有用なトラブルシューティングの指示の検討を示唆研究12。
伝統WISH技術12月16日に加えて、ウィッシュの方法論と策定されている別のプロトコルの進歩の継続的な出現があった。これらは、fluoresの使用などの信号検出のための新しい方法を含み、cence 17〜19、マイクロRNA 20の局在を可能にする方法に関するものである。染色（s）は、容易に所望の時点で関心対象の試料内で視覚化することができない場合にそうであっても、現在のセルの標識方法に加えられた多くの改良にもかかわらず、これらの手順の有効性は否定される。この制限は、それが潜在的にこれらの時間に発生する様々な発生過程の理解のギャップにつながる可能性がゼブラフィッシュ個体発生の初期胚の段階に関係する場合は特に、研究者のための問題である。正常なゼブラフィッシュの開発中に、卵黄嚢は、徐々に胚の年齢11としてサイズが減少します。胚がその隣接する卵黄嚢に比べて大きいため、したがって、これらの後の発達段階（> 24時間後に受精）で、ウィッシュ染色は分析する非常に簡単です。しかし、これは（初期の体節形成に尾芽段階からそうではないときに、胚質量は、不透明な卵黄嚢が時々汚れの視覚化を不明瞭にすることができる卵黄）の周りに配置されている。従って、フラットマウントの方法は（ 図1および図2に図式化）初期のゼブラフィッシュ胚サンプルの特徴付けに関連付けられた画像化およびデータ分析の問題を軽減するために考案された、単離され、広く遺伝的変異の系統的な表現型から使用されている最初の大規模な遺伝子スクリーニング21から。
フラットマウント技術の登場以来、初期の発達段階の分析が大幅に強化されました。卵黄は、胚から除去されると、撮像のための所望の向きにスライドガラス上に平らに胚を置くことができる。この二次元位置は、試料を回転させる必要がなくなり、これ全体を一度胚の観察を可能にする。多くの組織は、次のような胚の幅広いドメインに位置しています血液や腎臓を形成する前駆体。さらに、1は1度に複数の異なる開発組織を比較する必要があります。フラットマウントは、同時にこのような細胞群のドメイン全体を表示するには、研究者を可能にし、大幅な組織や細胞数のエリア測定などの定量化を支援することができます。この手法は、最終的には造血、神経発生、および器官形成の基礎となる重要な発達のさまざまなメカニズムについて多くの発見につながる支援してきました。このように、一度マスターして、研究者のためのこの簡単な技術のためのアプリケーションは、非常に充実しています。
例えば、造血時の系統の選択を検討する研究において、14及び18体節段階（■）でのゼブラフィッシュ胚のマウント平坦な製剤は、間にPU.1ジンクフィンガー転写因子の発現パターンで発生した変更を説明するために使用された野生型およびGATA1モルホリノ胚22を注射した。この方法は、GATA1はおそらくこの時点周り中間細胞塊（ICM）にPU.1の発現を調節していることを示す、18カテゴリーに展開PU.1ドメインの検出を可能にした。 - / - gtpbp1とエプシンを含むさまざまな赤血球系の遺伝子のために染色し、追加のフラットマウント胚はGATA1たVLT変異体におけるこれらの遺伝子の発現の低下を示した。さらなる分析は、 潟活性とは無関係であることが知られていたbiklfとtesthymin等erythoid遺伝子の発現の変化を示さなかった。したがって、それらの他の実験結果と併せて、それはGATA1は骨髄赤血球系統内の細胞の分化の調節に必須であることが判明した。神経堤開発の研究では、フラットマウントは、研究中の（ 暴徒M610）変異モンブランにcrestinの発現を試験するために使用されたモンブランとtfap2a遺伝子機能23の役割を調べる。 10と20のSSで、crestin式は完全に頭の中で抑制された、最終的にはモンブランとtfap2a規制の重要性について結論を下すには、このグループを支援する、正常な野生型の式と比較して暴徒M610変異体のトランク領域で減少した神経堤形成中。さらに、器官形成の観点から、フラットマウントは前腎として知られている、ゼブラフィッシュ胚腎臓の開発中に、早期の腎前駆分野で異なるドメインの存在の発見を可能にした。ゼブラフィッシュ胚は、腎臓前駆細胞が前腎を構成するネフロン機能ユニットを生じさせるか研究する保存されており、まだ、解剖学的に単純なシステム、腎形成6,7として知られているプロセス（ 図4）を提供します。フラットマウント分析では、Reのドキュメントドメインに有用であったNAL前駆細胞および未知だった（ 図5）、6,7 をパターニングする前腎の間に、RAのシグナル伝達の変化の結果を分析する。まとめると、これらの実施例では、この平坦な正常な発生および疾患状態の間に発生する多様なプロセスの研究にプロトコルを実装するための多くの広範なアプリケーションが実際に存在することを示唆している。
概念的には、このフラットマウント手順は、全体的に非常に簡単です。しかし、この方法を習得するために必要な操作とフィネスの程度は、視覚的なデモが存在しない場合に、マスターに非常に困難な場合があります。したがって、このプロトコルは、より良い、この手法を実行し、組織の処理を最適化できる試薬に関するアドバイスを共有する方法を理解する機会を、研究者は、ゼブラフィッシュモデルに新しい特にを有効にするためにコンパイルされています。我々は、このプロトコルは、最終的には、コミュニティ内の他の人がUであることが最も理想的なサンプルの条件を絞り込むことができますことを願っていますSEDプレミアムイメージング、データ解析、および刊行物に、それらの結果を通信するため。最終的に、これは、実験結果のプレゼンテーションを不明瞭にし、この単純だが重要な技術を利用して、これらを解決することができ、初期胚発生時のゼブラフィッシュの解剖学的支障を克服するために研究者を有効にする必要があります。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究の一部は、以下のそれぞれからRAWに資金によってサポートされていました：NIHの助成金K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237;ダイムバジルオコナースターターScholarの助成賞＃5-FY12-75年の3月。科学と生物科学専攻のノートルダム大学の大学から資金を起動してください。我々は特に、幹細胞研究促進するノートルダム大学に寛大な贈り物を与えられた全ギャラガー家族と一緒に、エリザベスとマイケル·ギャラガーに感謝したいと思います。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。私たちは、ゼブラフィッシュのコロニー·福祉での顕著な献身のために彼らのサポートのために生物科学の部門のスタッフに感謝し、ノートルダム寺院でのゼブラフィッシュ研究センター。最後に、私たちは、彼らのコメント、議論や、この作品についての洞察のために私たちの研究室のメンバーに感謝だけでなく、マリーゴールド（Maripooka）およびジニアWingert研究のための最も優れたラッシュのツールを作るためにネコウィスカーを流し、自然に提供するため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
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