Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51604

DOI

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Christina N. Cheng¹, Yue Li¹, Amanda N. Marra¹, Valerie Verdun¹, Rebecca A. Wingert¹

¹Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Abstract

Die Zebrafischembryo ist jetzt allgemein für die Grundlagenforschung und biomedizinische Forschung verwendet, um die genetische Kontrolle der Entwicklungsprozesse zu untersuchen und zu angeborenen Missbildungen zu modellieren. Am ersten Tag des Lebens, schreitet die Zebrafisch-Embryos durch viele Entwicklungsstadien einschließlich Düngung, Spaltung Gastrulation, Segmentierung und der Organogenese von Strukturen, wie den Nieren, Herz und Zentralnervensystem. Die Anatomie eines jungen Zebrafischembryos zeigt mehrere Herausforderungen für die Visualisierung und Analyse der in vielen dieser Ereignisse beteiligt, da das Gewebe Embryo in Verbindung mit einem Runddottermasse. So ist eine genaue Analyse und Abbildung von experimentellen Phänotypen in festen embryonalen Proben zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstufe (10 und 19 Stunden nach der Befruchtung (hpf), respectively), wie sie gefärbt mit ganzen mount in situ Hybridisierung (WISH), es Oft ist es wünschenswert, den Embryo aus dem Eigelb zu entfernen balle und zu positionieren, flach auf einem Glasträger. Allerdings Durchführung einer flachen Montageverfahren kann sehr mühsam sein. Daher erfolgreiche und effiziente Flachmontage Vorbereitung ist stark durch die visuelle Demonstration der Präparationstechnik erleichtert und auch mit Reagenzien, die in der optimalen Handhabung Gewebe unterstützen geholfen. Hier bieten wir unseren WISH-Protokoll für ein-oder zweiFarbErkennung der Genexpression im Zebrafischembryo, und zeigen, wie die flache Montageverfahren kann auf diesem Beispiel eines gefärbten fixierten Probe durchgeführt werden. Diese flachen Montage Protokoll ist breit anwendbar auf die Untersuchung von vielen embryonalen Strukturen, die während der frühen Zebrafischentwicklung entstehen, und kann in Verbindung mit anderen Färbemethoden auf fest Embryo Proben durchgeführt umgesetzt werden.

Introduction

Der Zebrafisch, Danio rerio, hat sich ein weit verbreiteter Organismus in der Studie der Entwicklungsbiologie. Zebrafische sind eine tropische, Süßwasser-Wirbeltierarten aus der Familie der Karpfenfische gehören. Zebrafisch wurden ursprünglich für Umweltforschung verwendet, um Informationen über die Gefahren von möglichen Wasserschadstoffe zu gewinnen, da sie leicht zugänglich, kostengünstig und einfach zu behalten ¹ waren. In den letzten dreißig Jahren hat der Zebrafisch werden als genetisch manipulierbaren Wirbeltier-Modellsystem für eine Vielzahl von Gründen anerkannt. Zebrafisch zeigen eine hohe anatomische und physiologische Erhaltung mit höheren Wirbeltieren einschließlich Säugetieren ^2,3. Jüngsten Genoms Annotation hat ergeben, daß etwa 70% aller menschlichen Gene mindestens eine Zebrafisch-Gegenstück ^4. Zum Beispiel haben viele orthologen Gene, die eine wichtige Rolle während der Nierenentwicklung spielen zwischen diesen Arten ^5-7 identifiziert worden. Diese dramatic Konservierungsgrad in Bezug auf Zell-und Molekularbiologie konnten die Forscher Modelle für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen in der ^Zebrafisch-8 erstellen und Zebrafisch haben ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle medikamentöse Therapien identifizieren, mit chemisch-genetischen Screens ⁹ geworden.

Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Modell nicht nur in der Lage, eine Vielzahl von komplexen Entwicklungsprozesse und Krankheitszustände, die in den Menschen gesehen werden rekapitulieren, sondern mehrere zusätzliche Attribute seine Attraktivität erhöhen auch als Modellorganismus für embryologische Studien. Zebrafische sind eierlegend und reproduzieren durch Broadcast Laich, die die Forscher mit einfachem Zugang zu den Embryonen vom Beginn der Befruchtung ¹⁰ liefert. Weitere Vorteile sind Embryo Größe, Transparenz und eine schnelle, externe Entwicklungs ^10. Zusätzlich Zebrafisch Erwachsenen besitzen eine hohe Fruchtbarkeit und erzeugen typischerweise relativ großen Kupplungsgrößen, die zwischen 200 bis 500 liegen kannpro Woche, so dass die Forscher schließlich Hochdurchsatz-Experimenten, wie Phänotyp Chemie Bildschirme, mit Leichtigkeit ⁹ durchzuführen.

Auch so, trotz der Fülle von Vorteilen, die durch die Zebrafisch-Modell gezeigt werden, gibt es Probleme, die mit der Analyse und Kommunikation der von der frühen Entwicklungsstadien erhaltenen Versuchsergebnisse beziehen. In einigen Fällen könnte die inhärente Anatomie des Zebrafischembryos der Visualisierung von Daten von einem zu verschleiern. Nach der Befruchtung der Ausgangszelle durchläuft mehrere Spaltungsereignisse wie die Entwicklung fortschreitet ^11. Nach Gastrulation tritt der embryonalen Achse an der Schwanzknospen-Stufe (10 HPF), so daß es um das Eigelb ¹¹ gewickelt. Als weitere Entwicklung schreitet durch die Segmentierung Zeitraum wird der Stamm in der Masse zu wachsen und auch verlängern durch axiale Dehnung, so dass ein Schwanz zusammen mit einem Teil des Dottersacks selbst erstrecken sich von der zentralen Dottermasse11. Zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstadium (19 hpf), versucht, spezifische Entwicklungsmerkmale nach der Nutzung der verschiedenen Färbemethoden wie WISH zu beobachten, kann eine Herausforderung sein, sowohl aufgrund der Geometrie des Embryos und Deckkraft zu visualisieren und zu fotografieren der Dottersack. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu beseitigen, ist das Eigelb zu entfernen, und dann abzuflachen des Embryos in einem zweidimensionalen Probe, die in einer einfacheren Weise analysiert werden kann.

Die folgenden Protokoll-und Video-Ressourcen bieten eine Anleitung, wie Sie erfolgreich deyolk und Flachmontage einen Embryo nach Fixierung und Färbung, am Beispiel von ein oder zwei-Farben-WISH Färbung. WISH ist eine weit verbreitete Technik, die den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren in Präparate ermöglicht und somit erlaubt die Stelle (n) der Genexpression in Geweben festgestellt werden. WISH Techniken sind ausführlich beschrieben und können mit verschiedenen Farbuntergründe sowie geführt werden Grippeorescent Detektionssysteme ^12-20. Hier bieten wir unseren für Zebrafischembryonen zwischen den Schwanzknospe und Segmentierung Entwicklungsstadien verwendet modifizierte WISH-Protokoll. Alternative WISH-Protokolle sind jedoch mit der flachen hier beschriebene Montageverfahren kompatibel ist, wie eingangs der unten Protokoll vermerkt. Zusätzlich könnte flache Montage in Verbindung mit einer beliebigen Anzahl von bestehenden Visualisierungstechniken wie whole mount Immunhistochemie oder Zelllinie Spurmarkierungen sind, die in diesem Protokoll beschrieben sind, verwendet werden. Insgesamt kann die Technik der flachen Montage besser ermöglichen eine optimale Analyse und Präsentation von Daten aus Versuchen mit den frühesten Stadien der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch erhalten.

Protocol

Die Verfahren für die Arbeit mit in diesem Protokoll beschriebenen Zebrafisch-Embryonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Notre Dame genehmigt. Hinweis: Die in den Teilen 1-5 beschriebenen Verfahren wurden verwendet, um die Embryo-Bilder hier in den repräsentativen Ergebnissen bereitgestellt generieren. Die in den Teilen 1-5 beschriebenen Verfahren könnte als mit alternativen Verfahren WISH ^12-16 oder anderen Visualisierungstechniken wie immunhistochemischen Markierung für bestimmte Proteine ​​mit spezifischen Antikörpern Bedarf eingesetzt werden können. Bei der Durchführung flachen Halterungen auf WISH Zebrafischembryonen mit der in den Teilen 1-5 beschriebenen Protokoll der ersten Embryo Fixierung und Färbung endgültige Fixierung Schritte sind die wichtigsten Manipulationen, die die Fähigkeit, Dotterkörnchen von der Probe für flache Montage zu entfernen beeinflussen. Die besten flachen Montage Ergebnisse werden erzielt, wenn die anfängliche Fixierung mit frisch aufgetaut eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) / 1x PBS und die Fixierung von geführtdie endgültige WISH Farbreaktion mit eiskaltem 4% PFA/1x PBS (die nicht braucht, um frisch aufgetaut werden), und es wird empfohlen, dass die Leser, dies bei der Substitution alternativen Färbemethoden in Kombination mit den Teilen 6-8 zu betrachten.

1. Embryonen, Fixierung und Lagerung

1. Planen Gegen Käfige indem erwachsenen männlichen Zebrafisch (e) und weiblichen (n) in den Kammern des Systems Wasser, so dass sie durch einen Teiler getrennt über Nacht.
2. Entfernen Sie die Teiler zwischen Erwachsenen und sammeln die befruchteten Eier mit einem feinen Drahtgeflecht Teesieb innerhalb von ~ 15-30 min von zusammenpassenden Kupplungen, die äquivalent embryonalen Stadien haben zu sammeln.
3. Schalten Sie den Filter auf den Kopf und spülen Sie die Oberfläche mit einem feinen Strahl von der E3 aus einer Spritzflasche, um die Embryonen in Kulturgefäße mit etwa 25 ml Lösung E3 übertragen verzichtet.
4. Nach dem Sammeln der Kupplungen, teilen sie in mehrere Gerichte, dass etwa 50 bis 60 Embryonen inkubiert werdenin jeder Schale aus 25 ml Lösung E3. Hinweis: Die Überbelegung von Embryonen kann zu dramatischen Entwicklungs Asynchronität innerhalb der Kupplung und sollte darauf geachtet werden, um dies zu vermeiden, um rechtzeitige Erhebung der gewünschten Stufe (n) aktivieren zu führen.
5. Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° C und Entwicklungsbeurteilung nach dem Zebrafisch-Standard Inszenierung Serie ¹¹ zu ermöglichen.
6. Mit einem Kunststofftransferpipette vorsichtig legen Sie die gewünschte Anzahl von Embryonen bei der gewählten Zeitpunkt, bis zu dem 20 Somitenstadium (19 hpf) in eine flache Bodenmikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Achten Sie bei der Handhabung von jungen Embryonen, wie sie sind empfindlich und können durch Zerkleinern oder aggressiven Umgang mit Pipetten leicht beschädigt werden. Alternativ können Glasfläschchen für die Fixierung und Bearbeitung von Embryonen verwendet werden. Für alle nachfolgenden Waschungen Protokoll Kunststoff Transferpipetten verwendet werden, mit Ausnahme der Ribosonde Zugabe und Entfernung (Schritte 3.11, 3.14).
7. Ersetzen Sie die E3 mit eiskaltem 4% PFA/1x PBS undfixieren die Embryonen in ihren Chorion in 4% PFA/1x PBS für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht. Hinweis zur Vorsicht: PFA ist giftig und PFA-Lösungen sollten in einem Chemieabzug behandelt werden, während das Tragen geeigneter Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen und Kittel. Darüber hinaus sollten PFA-Pulver mit außergewöhnlicher Sorgfalt bei der Herstellung der Stammlösung behandelt werden, da auch das granulierte PFA kann dazu neigen, durch statische Aufladung zu zerstreuen. PFA typischerweise durch Erhitzen des 1x PBS zu einem Erhitzen, um das Pulver zu lösen PFA hergestellt, und dann wird die Lösung bei -20 ° C gelagert Wenn Feinsedimente in der 4% PFA/1x PBS vorhanden sind, wenn die Lösung gekühlt, filtriert sterilisieren gekühlte Lösung vor Aliquotierung für Kühllager, indem sie durch einen 0,45 um-Filter-System. Nur frisch zubereitet oder frisch aufgetauten PFA ist für diese erste (dh primär) Fixierung des Embryos verwendet.
8. Entfernen Sie das Update und waschen die Embryonen zweimal mit 1x PBST, dann Transfer ineine Inkubation Gericht.
9. Sehen Sie sich die Embryonen unter einem Stereomikroskop und mit zwei Paaren von feinen Pinzette, um die Umgebung der Chorion-Embryonen, so dass ein Paar wird verwendet, um den Embryo schonend zu nutzen, während das zweite Paar wird verwendet, um das Chorion aufreißen zu entfernen.

2. Embryo Permeabilisierung

1. Übertragen Sie die dechorionated Embryonen wieder in den Mikrozentrifugenröhrchen oder Glasfläschchen, dann zweimal gründlich mit 1x PBST, um alle verbleibenden Chorion Trümmer zu entfernen.
2. Entfernen Sie die 1x PBST waschen und die Embryonen zweimal mit 100% Methanol (MeOH).
3. Zeigen die Embryonen bei -20 ° C für mindestens 20 min. Anmerkung: Die Embryonen können bei -20 ° C in MeOH für ein Jahr oder mehr gelagert werden. Methanol macht die Chorion klebrig, daher nicht zu diesem Schritt vor, wenn nicht die Chorion wurden entfernt.
4. Rehydrate die Embryonen durch Entfernen der 100% MeOH und waschen Sie sie bei Raumtemperatur für 5 min jeweils in 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, dann zweimal mit 1x PBST. </ Li>
5. Eine frische Proteinase K-Arbeitslösung (5 g / ml) durch Zugabe von 25 ul frisch aufgetaut Proteinase-K-Lager (10 mg / ml) zu 50 ml 1x PBST.
6. Entfernen Sie die 1x PBST aus den Embryos, dann ersetzen Sie mit der Proteinase K-Arbeitslösung und Inkubation auf der Grundlage der embryonalen Phase: <= 5 Somiten für 1 min; 10-12 Somiten für 1,5 min; 15 Somiten für 2 min und 20 Somiten 3 min.
7. Entfernen Sie die Proteinase K-Arbeitslösung und waschen die Embryonen zweimal mit 1x PBST.
8. Entfernen Sie die 1x PBST und ersetzen mit eiskaltem 4% PFA/1x PBS für mindestens 20 min bei Raumtemperatur.

3. Riboprobe Synthesis, Prähybridisierung, Hybridisierung und Sondenentfernung

1. Montage des Antisense-Ribosonde in vitro-Transkriptions-Reaktion bei Raumtemperatur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, während Enzyme auf Eis, durch Kombinieren einer DNA-Matrize, die Sequenz, die dem interessierenden Gen (entweder 100-200 ng PCRProdukt oder 1,5 &mgr; g linearisierter Plasmid-DNA, wie beschrieben, hergestellt ^12,13), 2 &mgr; l Digoxigenin oder Fluorescein markierten Ribonucleotiden, 2 ul der geeigneten RNA-Polymerase (SP6, T3, T7 je nachdem, welche Sequenz in das PCR-Produkt eingearbeitet oder auf dem DNA-Plasmid), 2 ul 10x Transkriptionspuffer, 0,5 ul RNase-Inhibitor, und bringt zu einem Gesamtvolumen von 20 ul mit molekularem Grad destilliertem Wasser (DNase, RNase-frei). Hinweis: Der 10x Transkriptionspuffer sollte, indem das Röhrchen in ein 37 ° C Wasserbad für 10-20 min vorgewärmt werden und danach geschüttelt, um sicherzustellen, dass alle Komponenten in Lösung. Wenn weiße Flocken vorhanden sind, bebrüten die Röhre für weitere 5-10 min und Wirbel wieder. Transcription Reaktionen können schlechte Ausbeuten, wenn der Transkriptionspuffer wird nicht vollständig gelöst und gründlich gemischt ausfallen oder haben.
2. Die Komponenten und Inkubieren jede Reaktion bei 37 º C für 2 Stunden in einem Wasserbad.
3. Entfernen Sie die Reaktion tu(S) aus dem Wasserbad und zerstören die DNA-Matrize in jeder Probe durch Zugabe von 5 ul 10x DNase I-Puffer, 2 &mgr; l DNAse-I-Enzym, und 23 ul der molekular reines destilliertes Wasser, um das Gesamtvolumen auf 50 ul zu bringen, und dann Inkubieren jedes Röhrchen bei 37 ° C für 20 min in einem Wasserbad.
4. Führen Sie eine Ethanol-Fällung in jedem Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 5 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 110 ul eiskaltem 100% Ethanol, gefolgt von 1 ul der Glykogen-Lager auf RNA-Pellet-Visualisierung in den nachfolgenden Schritten zu erleichtern, und dann die Inkubation Rohr bei -20 ° C für mindestens 1 h oder über Nacht.
5. Centrifuge jeder Mikrozentrifugenröhrchen mit maximaler Geschwindigkeit 4 ° C für 20 min, dann den Überstand 100% Ethanol und ersetzen mit 100 ul 70% eiskaltem Ethanol.
6. Centrifuge jeder Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 ° C für 5 min, dann entfernen Sie die 70% Ethanol Überstand und das Pellet an der Luft trocknen für 5 Minuten, dann endlich 100 l moMolekular Grad destilliertem Wasser, um das Pellet resuspendieren und Quantifizierung der Riboprobe Stammkonzentration mit Hilfe eines Nanodrop Spektralphotometer. Hinweis: Sobald das Pellet in Lösung gegangen ist, sollte die Riboprobe Lager auf Eis gehalten und bei -20 ° C gelagert werden.
7. Um die fixierte Embryonen für die Prähybridisierung Prozess vorzubereiten, entfernen Sie die 4% PFA/1x PBS aus jeder Probe und waschen die Embryonen zweimal mit 1x PBST.
8. Übertragen Sie zwischen 25-40 Embryonen in 1x PBST in jedem einzelnen flachen Boden-Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Die Überbelegung von Embryonen zu ungleichmäßiger Färbung später führen und sollte darauf geachtet werden, um die Stichprobengröße in jeder Röhre auf etwa 40 Embryonen zu begrenzen.
9. Ersetzen Sie die 1x PBST in jedem Röhrchen mit 500-1.000 ul HYB +.
10. Das Röhrchen (n) der Embryonen in einem Ofen bei 70 ° C eingestellt, und inkubieren sie bei dieser Temperatur 4 h bis Prähybridisierung durchzuführen.
11. Bereiten Sie die Riboprobe / HYB +-Lösung durch Zugabe von 100-500 ng Riboprobe (Digoxygenin und / oder fluoreszierEin-markiert) und 500 &mgr; l frisches HYB + und dann Inkubieren dieser Lösung bei 70 ° C für mindestens 20 min vor Schritt 3.11 um es vorzuwärmen. Hinweis: Um mehrere Gen-Transkripte zu erkennen, mit Einzel-und / oder Doppelfarbmetrische Kennzeichnung, jeder der Ribosonden entsprechend dieser Gene müssen in einem Riboprobe / HYB + Cocktail kombiniert werden.
12. Entfernen Sie die Prähybridisierung HYB + aus jedem Röhrchen von Embryonen und ersetzen mit ausreichender Riboprobe / HYB +, um die Embryonen zu decken. Hinweis: In der Regel notwendig, um Embryonen in einem flachen Boden-Mikrozentrifugenröhrchen abzudecken 200-250 ul Riboprobe / HYB +. Riboprobe / HYB + Hinzufügen und Entfernen wird typischerweise unter Verwendung einer Pipette und Barriere Tipps, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu verhindern.
13. Die Embryonen Inkubieren bei 70 ° C über Nacht mit ribroprobe / HYB +.
14. Bereiten Sie den folgenden Satz von Waschlösungen und Pre-wärmen sie über Nacht bei 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT und 0,2 x SSCT. Hinweis: Es ist einfach zuzubereiten 50 ml aliquots jedes Waschlösung, da der Überschuß kann bei Raumtemperatur gelagert und anschließend für die zukünftige Verwendung aufgewärmt.
15. Entfernen Sie die Riboprobe / HYB + mit einer Pipette und Barriere-Tipps und bei -20 ° C Hinweis: Typischerweise ist jedes Ribosonde / HYB + Mischung kann mehrmals (z. B. 3 oder mehr) ohne Verringerung des Signals verwendet werden. Während wiederverwendet Riboprobe / HYB + wird mit niedrigeren Hintergrund verbunden sind, jedoch im Auge behalten, die wiederverwendet Riboprobe Gemische, die eine Verschlechterung sein.
16. Waschen Sie die Embryonen mit 50% formamide/2x SSCT für 30 min bei 70 ° C.
17. Einmal Waschen der Embryos mit SSCT 2x 15 min bei 70 ° C.
18. Zweimal waschen mit 0.2x die Embryonen SSCT für 30 min bei 70 ° C.
19. Entfernen Sie den 0,2 x SSCT und waschen die Embryonen zweimal mit MABT bei Raumtemperatur.

4. Anti-Digoxygenin Antikörper Inkubation und Nachweis

1. Bereiten Sie frischen Blocklösung.
2. Entfernen Sie die MABT und ersetzen mit Block-Lösungtion.
3. Inkubieren der Embryonen in Blocklösung für 2-4 Stunden bei Raumtemperatur. Hinweis: Längere Inkubationen Block bieten optimale Ergebnisse mit jungen Zebrafischembryonen Stufen (<15 Somiten). Um die langwierige Prozedur Block über Nacht zu tun, führen Sie den Block Inkubation für 8-12 h bei Raumtemperatur oder einer Kombination von Raumtemperatur plus (bis zu ~ 8 Stunden) eine anschließende 4 ° C Inkubation.
4. Bereiten Sie den Anti-Digoxygenin-Antikörper-Lösung, indem eine 5000-fache Verdünnung in frischem Block-Lösung (z. B. 1 ul pro 5 ml-Block).
5. Entfernen Sie den Block und fügen Sie die Antikörper / Blocklösung.
6. Bedeckt das Probenfolie in beimpft und über Nacht bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur.
7. Entfernen Sie die anti-digoxygenin/block und waschen Sie die Embryonen mindestens 10-mal mit MABT. Hinweis: Übertragen Sie die Embryonen bis 12-Well-Platten für die MABT Wäschen. Dies erhöht die Geschwindigkeit, mit der die Embryonen kann gewaschen werden, was nützlich ist bei der Verarbeitung großer Probenmengen, einnd macht es einfach, den Fortschritt der Farbreaktion (Schritt 4.11) unter einem Stereomikroskop beobachten. Hinweis: Bei diesem Schritt Embryonen können "Super-gewaschen" werden durch Übernacht-Inkubation in MABT bei 4 ° C, bevor Sie mit Schritt 4,8, was eine nützliche Behandlung für Sonden, die zu hohen Hintergrund oder Flecken, die Überwachung während der langwierigen erfordern geben tendenziell ist arbeiten Tag.
8. Bereiten Sie die Pre-Färbepuffer und die gewünschte Farblösung (violett oder rot-Substrat).
9. Entfernen Sie die MABT und waschen die Embryonen in der Vor-Färbepuffer für 5 min bei Raumtemperatur.
10. Entfernen Sie die Pre-Färbepuffer und fügen Sie die Farblösung.
11. Überwachen Sie den Fortschritt der Raumtemperatur Färbereaktion alle 15-30 min, indem Sie das Aussehen der Embryonen unter einem Stereomikroskop. Anmerkung: Die Geschwindigkeit der Farbreaktion kann nach unten durch die Übertragung der Proben auf 4 ° C, wenn es notwendig ist, mehr Zeit für die Fertigstellung der Färbung geben verlangsamt werden. Nachdem bis 4 gekühlt° C, jedoch kann die Reaktion nicht durch Erwärmen auf Raumtemperatur beschleunigt werden.
12. Wenn die Farbreaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Farblösung und ersetzen mit 1x PBST.
13. Zweimal waschen mit 1x PBST für 5 min. Hinweis: Wenn nicht erkennt andere Gene mit einem anderen Substrat, dann fix die Proben in eiskaltem 4% PFA/1x PBS für mindestens 20 min, und gehen Sie zu Schritt 6.1. Ansonsten gehen Sie zu Schritt 5.1.

5. Anti-Fluorescein-Antikörper-Inkubation und Nachweis

1. Entfernen Sie die 1x PBST waschen und die Embryonen zweimal mit 0,1 M Glycin, pH 2,2 für 15 min jeweils bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Zeit für die Glycin wäscht ist wichtig, die ersten Farbreaktion vollständig zu deaktivieren.
2. Entfernen Sie die 0,1 M Glycin und waschen die Embryonen zweimal mit MABT für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie den Anti-Fluorescein-Antikörper-Lösung, indem eine 5000-fache Verdünnung in frischem Block-Lösung (z. B. 1 ul pro 5 ml-Block).
4. Entfernen Sie die MABT und fügen Sie die Antikörper / Blocklösung. Folgeschritte 4,6 bis 4,13, um die Detektion des Fluorescein-markierten ribroprobe zuführen. Hinweis: Wenn das endgültige Farbreaktion abgeschlossen ist, ist es wesentlich, dass die letzte Fixierung der Probe wird in eiskaltem 4% PFA/1X PBS durchgeführt. Befestigung mit wärmeren PFA Lösungen neigt dazu, mit klebrigen Eigelb, die schwer zu beim Präparieren und deyolking für die Flachmontage Verfahren aus dem Embryo entfernen zugeordnet werden.

6. Embryo Dissection und Initial Deyolking des Embryonen

1. Wählen Sie einen fixiert, gefärbt Embryo für flache Montage.
2. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den ausgewählten Embryo Probe in eine Kunststoff-oder Glaspetrischale mit 1x PBST zu platzieren.
3. Die Schale unter einem Stereomikroskop, und rollen Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette oder Wimpern Werkzeug so, dass eine Seitenansicht ist erhalten, und die Kopf-und Schwanzenden sichtbar gemacht werden.
4. Verwenden Sie einen feinen Pinzette, um einen Einschnitt in th machene Eigelb in einer Position, in zentraler Lage zwischen dem Kopf und der Schwanz des Embryos befindet, und in der Zwischenzeit mit einem zweiten feinen Pinzette, um den Embryo zu halten, um Hebelwirkung für die Dotter Schnitt bieten. Hinweis: Alternativ können Sie zwei große Einschnitte in die Eigelb, eine in der Nähe in den Kopf und die andere in der Nähe der Schwanz des Embryos.
5. Verwenden feinen Pinzette und / oder eine Peitsche Werkzeug, um aus dem Eigelb Zelle Hohlraum schaufelt aus dem Eigelb.
6. Spülen Sie den Embryo vorsichtig mit 1x PBST Streu Eigelb entfernen.

7. Fein Deyolking des Embryonen

1. Übertragen Sie den Embryo in eine flache Glasobjektträger mit 1-2 Tropfen 1x PBST.
2. Verwenden Sie eine Wimpern Werkzeug und feinen Pinzette vorsichtig positionieren Sie den Embryo mit der ventrale (Dotter)-Seite nach oben auf dem Glasträger.
3. Ziehen Sie den Embryo an den Rand des 1x PBST-Lösung mit der Peitsche Werkzeug, so dass der Embryo in eine flache Stellung gegen den Objektträger verbleibt.
4. Kratzen Sie die Bauchseite des Embryos sanft mit der Peitsche zuol, um die Dotterkörnchen ohne zu reißen, den Embryo zu entfernen. Gleichzeitig verwenden einen feinen Pinzette, um den Embryo zu verankern, während Schaben mit der Peitsche-Tool. Hinweis: Das Entfernen der Dotterkörnchen können sich wiederholende Kratzen für 5-10 min erfordern.
5. Wenn der PBST-Lösung vollgestopft mit Über Eigelb wird oder zu verdampfen beginnt, fügen Sie 1-2 Tropfen frisch 1x PBST auf den Objektträger mit einem Kunststoff-oder Glas-Transferpipette, und ziehen Sie dann den Embryo auf den Bereich mit der sauberen Lösung für die weitere Eigelb Granulat Entfernung.
6. Wenn das Eigelb zufriedenstellend entfernt wurden, verwenden Sie eine Transferpipette sanft bewegen den Embryo wieder in eine Kunststoff-oder Glaspetrischale mit 1x PBST für eine abschließende Spülung um Streudotterkörnchen entfernen.
7. Übertragen Sie die deyolked Embryo mit einem Kunststoff-oder Glas-Transferpipette in eine Kunststoff-oder Glaspetrischale mit 100% Glycerin.
8. Inkubieren des Embryos in 100% Glycerin für ~ 5 min, um den Embryo zu akklimatisieren.

8. Montage auf einem Glasobjektträger

1. Übertragen Sie die deyolked Embryo zu einem sauberen Glasobjektträger in 1-2 Tropfen 100% Glycerin.
2. Positionieren Sie den Embryo mit der ventrale (Eigelb) zugewandten Seite der Glasträger.
3. Mit einem Wimpern Werkzeug, ziehen Sie den Embryo an den Rand des Glycerinabfall, so dass der Embryo in einer flachen Position gegen die Glasobjektträger bleibt. Wenn die embryonale Achse gekrümmt ist, verwenden Sie die feinen Pinzette vorsichtig machen sehr kleine Schnitte in die restlichen Eigelb Zellmembran, Spannungen abzubauen, so dass der Embryo flach auf dem Objektträger mit einer geraden Achse positioniert werden.
4. Legen Sie kleine Einschläge von Modelliermasse an den vier Ecken eines 18 x 18 mm Deckglas. Hinweis: Alternativ können kleine Tropfen Vakuumfett ¹⁵ für Modelliermasse substituiert sein.
5. Platzieren des Deckglases langsam auf den Embryo, Abwinkeln des Deckglases, um die Erzeugung von Luftblasen in dem Glycerin um die Probe zu minimieren.
6. Fügen Sie einen zusätzlichen Rückgang von 100% Glycerinauf der Seite des Deckglases auf den Raum zwischen dem Deckglas und dem Objektträger zu füllen.
7. Drücken Sie langsam und vorsichtig an den vier Ecken des Deckglases, um fest zu positionieren, den Embryo zwischen dem Glas und beseitigen treiben. Hinweis: Achten Sie darauf, um den Embryo zu vernichten.
8. Wenn der Embryo nicht wie gewünscht positioniert, feinen Pinzette verwenden, um das Deckglas zu entfernen. Verwenden Sie die Peitsche Werkzeug, um den Embryo und / oder feinen Pinzette, um zusätzliche Einschnitte machen, so dass der Embryo kann neu positioniert werden neu zu positionieren. Wiederholen Sie die Schritte 8,4-8,7.
9. Beobachten und / oder Bild die Probe entweder mit einem Stereo-oder Compound-Mikroskop.
10. Bewahren Sie die Flachmontage Vorbereitung Wohnung mit einem Karton Diahalter im Dunkeln bei 4 ° C für mehrere Wochen oder vorübergehend bei Raumtemperatur. Hinweis: Die WISH Fleck wird schrittweise im Laufe der Zeit verblassen, vor allem rote Substrat-Reaktionen, und kann nicht in Glycerin auf unbestimmte Zeit erhalten bleiben. Lila Flecken verblassen auch leichter, wenn in Glycerin gehalten im Vergleich zuPFA (siehe Schritt 8.11). Interessanterweise wurde veröffentlicht, dass die Montage Embryonen in Permount statt Glycerin unbestimmte Lagerung bei Raumtemperatur ¹⁵ ermöglichen.
11. Für langfristige Lagerung von lila gefärbten Proben Substrat, entfernen Sie das Deckglas und spülen den Embryo zweimal in 1x PBST gespült, dann auf einem Mikrozentrifugenröhrchen übertragen mit 4% PFA/1x PBS für langfristige Lagerung. Hinweis: Alternativ können Embryonen in 1x PBST für weitere Analysen, wie z. B. DNA-Isolierung für die Genotypisierung verarbeitet werden.

Representative Results

Das flache Befestigungs Protokoll Verfahren beinhaltet Transformation des Zebrafischembryos aus seiner normalen Anatomie, wobei der Körperachse um einen zentral gelegenen Dotterkugel gewickelt, in einer zweidimensionalen Zubereitung (Fig. 1A). Whole mount Abbildung des jungen Zebrafischembryos durch die Art, wie der embryonalen Achse um den Dotter gewickelt beschränkt. Als Ergebnis, Seiten-oder Rückenansichten von ganzen montieren Bunt Embryo Proben können nur einen Teil der Achse oder obskuren bestimmten Geweben (Abbildung 1B) zu erfassen. Im Vergleich deyolking und Abflachung des Embryos kann die gesamte embryonalen Achse, die gleichzeitig (Fig. 1B) dargestellt werden. Diese Einschränkungen werden durch die Untersuchung einer WISH gefärbten Embryos, die mit Antisense-Ribosonden markiert war zu erkennen irx3b (lila), die eine Untergruppe der Nierenvorläuferzellen befinden, durch 13 neben Somiten 7 markiert und MyoD1 (rot), die Etiketten zeigte dieSomiten (Abbildung 1B). Der Bereich der irx3b + Nieren Vorläufern in dem gesamten verdeckt montieren Seitenansicht weil irx3b Transkripte sind reichlich vorhanden in dem Zentralnervensystem, so dass die Nieren Feld praktisch unmöglich, mit der seitlichen Kamerawinkel zu visualisieren; Ferner ist der Bereich der irx3b + Nieren Vorläufer nur teilweise sichtbar ist, wenn der Embryo wird in eine dorsale Ansicht der Kamera gedreht, da der Bereich um den Dotter (1B) gewickelt. , Eine Rückenansicht des gleichen Embryos folgenden flachen Montage ermöglicht es jedoch, den gesamten Bereich der irx3b + Nierenvorläuferzellen, um auf einfache Art und Weise in Bezug auf die Somiten entlang des Rumpfes und anderen embryonalen Strukturen (Abbildung 1B) analysiert werden. So können aufwendige Raum Domains idealerweise mit diesem Verfahren dokumentiert werden.

Mehrere große Schritte bei der erfolgreichen Durchführung der flachen Halterung Verfahren beteiligt. Um diese durchführen technique, muss das Eigelb Ball als Erster aus dem Embryo richtige (2A), die mit feinen Instrumenten wie einer feinen Pinzette getan werden kann, während der Embryo mit einem Stereomikroskop sichtbar gemacht werden gelöst werden. Nach der Entfernung des rohen Eigelb Ball wird eine feine Wimpern Werkzeug genutzt, um abkratzen Dotterkörnchen, die der Embryo (2B) befestigt geblieben. Die Entfernung der Restdotterkörnchen hilft, Visualisierung der embryonalen Geweben zu erleichtern. Schließlich wird der Embryo deyolked manipuliert, um es stabil auf einem Glasobjektträger (2C), die Beobachtung und Hilfsmittel Dokumentation der Probe mit Bildverarbeitungssoftware und eine Kamera an das Mikroskop angeschlossen ermöglicht positionieren. Die Peitsche Werkzeuge sind hausgemacht Geräte, die durch das Anbringen eines geeigneten Peitsche mit einer Pipettenspitze mit Sekundenkleber konstruiert werden können, die auf einem Handgriff, wenn gewünscht (3A, Materialien Tabelle) montiert werden kann. Verschiedene Peitsche Proben beschafft zu erzeugenpeitschen Werkzeuge mit leicht unterschiedlichen Eigenschaften in Bezug auf Länge und Verjüngung (3B), die die einzelnen Benutzer unterschiedliche Vorlieben für sobald sie mit der flachen Montageverfahren zu experimentieren beginnen haben. Beispiele für Wimpern Proben umfassen natürlich Schuppen menschlichen Wimpern, natürlich Schuppen Tier drahtige Haar-oder Barthaare und schließlich synthetischen Sorten von kommerziell erhältlichen Wimpern im Einzelhandel Kosmetik-Abteilungen gefunden.

Die lokale Umgebung und die Probe (n) auf einem Glasträger (4A) angeordnet enthält, kann für die hochauflösende Analyse abgebildet werden. Eine Kombination von Sonden wurden verwendet, um die Entwicklung von Nierenvorläuferzellen, die Anlass zu der Niere in der Wildtyp-Embryo im frühen Entwicklungsstadien mit zweifarbigen WISH beschriften und dann flach montieren Vorbereitungen wurden durchgeführt, um die Proben (4B, 4C ansehen ). Während der frühen Stadien Somiten sind Nierenvorläuferzellen in einem U-förmigen Muster von th abgegrenzteir Ausdruck pax2a Transkripte (lila), die die paraxiale Mesoderm, die gleichzeitig drückt Delta C (dlc) (rot) (linke Spalte, 4B) ^6,7. Im Vergleich dazu, wenn DLC-Transkripte wurden mit einem violetten Substrats nachgewiesen und wurden in Kombination mit dem Hinterhirn Marker Krox20 (rot) markiert, ein rostralen Subdomäne des Nieren Vorläufer wurde sichtbar gemacht, die DLC (rechte Spalte, 4B) exprimiert, wie zuvor angemerkt ^6,7. Wohnung montieren Zubereitungen können ähnlich verwendet werden, um später Somitogenese Stufen zu untersuchen. Am 14 Somitenstadium, analysierten wir die Expression von Marker der Nieren pax2a, slc4a4 und SLC12A3 (lila) zusammen mit smyhc1 (rot), die die Somiten (4C) markiert. Diese Kombinationen ermöglichen die Abbildung des gesamten Nierenvorläuferdomäne mit pax2a, während offenbart, dass eine Teilmenge der Zellen in einer rostralen Subdomäne exprEssed slc4a4a und wurden von einem nicht-überlappenden Schwanzdomäne der Nierenvorläuferzellen, die SLC12A3 ausgedrückt aus.

Zwei-Farben-WISH und die flache Montage Vorbereitung sind auch wertvoll für die Untersuchung der zellulären Domänen während der Organogenese im Zebrafisch mit genetischen Mutationen oder andere Störungen aus der Umwelt gegenüber kleinen Molekülen ^6,7 (Abbildung 5). Die Zebrafisch-Mutanten nls und lib Hafen Mutationen in Aldehyd-Dehydrogenase 1a2 (aldh1a2, früher als raldh2 bekannt), die ein Enzym für die Biosynthese von Retinsäure (RA) erforderlich kodiert. RA ist wichtig für die richtige Entwicklung der Nieren vielen Zelltypen, einschließlich der Bildung von Zellen, die Podozyten, um den Blutfilter der embryonalen Niere, als Glomerulus ^6,7 bekannt zu machen beitragen. WISH wurde durchgeführt, um die Vorläuferzellen mit Podozyten wt1a gleichzeitig mit Abgrenzung von T beschriftenentwickelt er Somiten mit smyhc1 und Hinterhirn mit Krox20 in Wildtyp-Embryonen, nls mutierten Embryonen lib mutierten Embryonen und Embryonen mit einem Enzym ALDH chemischer Inhibitor, DEAB (Abbildung 5) behandelt. Embryonen mit mangel aldh1a2 Ausdruck zeigte reduziert wt1a Expression im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen, während DEAB-behandelten Embryonen zeigten eine Aufhebung der wt1a Transkripte (Abbildung 5, rechte Spalte). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, wie repräsentativ die flache Halterung Technik kann verwendet werden, um zu analysieren und zu dokumentieren anatomischen Unterschiede mit Präzision im frühen Embryo und damit für wertvolle Entwicklungsstudien implementiert werden kann.

Abbildung 1. Übersicht der flachen Halterung VorbereitungRation für Zebrafisch-Embryonen. A) Das Verfahren des flachen Montage ermöglicht die gleichzeitige Ansicht von Geweben entlang der embryonalen Achse, weil die zentrale Dottermasse wird entfernt und auf einer flachen Oberfläche der Embryo stabil positioniert. B) Bilder einer ganzen montieren wollen Bunt Embryo in Quer-und Rückenansichten und dann nach einer flachen Montagevorbereitung wurde durchgeführt. Der Embryo wurde mit Antisense-Sonden gefärbt, um Gen-Transkripte irx3b (lila) und MyoD1 (rot) kodiert, zu erkennen.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des flachen Montageverfahren für Zebrafisch-Embryonen. A) Der Embryo wird zunächst grob deyolked, um die Mehrheit der Dottermasse zu entfernen, dann (B) die ventrale Oberfläche fein deyolked restlichen Dotterkörnchen zu entfernen, undNach dem Waschen der Embryos (C) montiert Rückenseite nach oben auf einem Glasobjektträger für die visuelle Analyse und / oder fotografische Bildgebung.

Abbildung 3. Fotografien von beispielsweise Wimpern Tools im Vergleich zu feinen Pinzette. A) Peitsche Hausgemachte Werkzeuge wurden neben einer Standard-feinen Pinzette abgebildet, neben einem Lineal, um eine Referenz. B) Vergrößerte Ansicht der Peitsche Werkzeuge neben den feinen Pinzette Verfügung zu stellen, mit dem Referenz Millimeter entlang der oben in der Ansicht bereitgestellt positioniert . Zwei verschiedene Wimpern Werkzeuge angezeigt, mit dem Stern (*) verwendet, um die von Wimpern markieren erhalten ein natürlich Schuppen menschlichen Wimper, und zwei Sternchen (**) verwendet, um eine Peitsche, die aus einer natürlich Schuppen Katzen-Whisker erhalten und getrimmt wurde markiert machen einen etwas stumpfen Ende. In jedem ca.se, die Peitsche wurde durch die Pipettenspitze eingefädelt und mit mehreren Schichten von Sekundenkleber befestigt, um eine starke Dichtung zu stabilisieren / verankern, die Peitsche in die Pipette in ein Handhabungsgerät angebracht zunehmend zu schaffen.

Abbildung 4. Charakterisierung der entwicklungsbedingten Veränderungen in der Nierenvorläufer Feld in der Wildtyp-Zebrafisch-Embryos. A) Bewegen schema, der den Bereich für die Analyse in (B, C). B) Wildtyp-Embryonen in der 1, 3 und 5 Somitenstufe wurden durch Zweifarben-WISH gefärbt, um die Zusammensetzung der Nierenvorläuferfeld, gibt beurteilen abzubildenden steigen, um die embryonale Niere oder Pronephros. (Linke Spalte) Transcripts den Transkriptionsfaktor pax2a (in lila gefärbt) kodiert markieren mehrere Populationen im Embryo, einschließlich der Nieren progenitor Feld, das von der Zwischen Mesoderm entsteht. Abschriften der Notch-Liganden dlc Codierung markieren die Somiten, die aus dem paraxialen Mesoderm (rot angefärbt) bilden. (Rechte Spalte) Wenn der Ausdruck der dlc-Transkripte (in lila gefärbt) und dem Hinterhirn Rhombomer Krox20 Marker (rot gefärbt) werden in den gleichen Embryonen untersucht, kann dlc Ausdruck in einer Subdomain rostral der Nierenvorläuferzellen befindet sich neben Somiten beobachtet werden 1-5, die bei der Co-Färbung der dlc mit pax2a. C) Wildtyp-Embryonen im 14 Somitenstadium verdeckt wurde, waren doppelt oder mit einer Kombination aus einem Nierenmarker (lila Dreifach-gefärbt), die Somiten smyhc1 Marker (rot) und das Hinterhirn Rhombomer Marker Krox20 (auch rot). (Top-Panel) In diesem Stadium pax2a Transkripte weiterhin die Nierenvorläuferzellen abzugrenzen. (Middle, Nieder Platten) Im Nierenvorläufer Gebiet, ein rostralen Subdomain ist markiertvon slc4a4 und Abschriften, die SLC12A3 kodieren markieren eine Schwanzdomäne.

Abbildung 5. Die Verwendung von Flach montiert Vorbereitungen, um die Phänotypen durch genetische Mutationen oder chemisch-genetischen Störungen, die Retinsäure Biosynthese modulieren verursacht charakterisieren. WISH Die Expressionsmuster bei den 15 Somitenstadium wt1a (lila) und smyhc1/krox20 (rot) wurde im Vergleich zwischen Wildtypen und Embryonen mit Defiziten in der Retinsäure (RA) Produktion aufgrund von Mängeln in Aldehyd-Dehydrogenase 1a2 (nls und lib-Mutationen) oder chemische Hemmung der Retinaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität mit Diethylaminobenzaldehyd (DEAB). Die Reduktion der RA-Produktion in lib ist etwas schwerer als nls, wielib, dass Embryonen zum Ausdruck leicht reduziert Färbung von wt1a Transkripte als ähnlich inszeniert nls mutierten Embryonen, während DEAB Behandlung von Wildtypen ist mit einer kompletten Aufhebung der wt1a Expression assoziiert.

Discussion

Zebrafische haben sich als ein äußerst wertvolles Modellorganismus in der gesamten Forschungsgemeinschaft in den letzten Jahren. Zebrafisch zeigen einen hohen Grad an genetischer Naturschutz mit der höheren Wirbeltieren und Vorteile in Bezug auf ihre Anatomie, Zucht-, und Lebenszyklus machen diese Spezies sehr zugänglich für experimentelle Untersuchungen. Darüber hinaus hat die Weiterentwicklung der molekularen Techniken für den Zebrafisch ferner die Verwendung dieser Modellorganismus in der wissenschaftlichen Forschung gefördert. Zum Beispiel, eine große Vielfalt von transgenen Zebrafischlinien erzeugt worden sind, den Krankheitsverlauf zu untersuchen und viele grundlegende Fragen, die die wichtigsten Mechanismen der Entwicklung zugrunde liegen, einschließlich der Organ beantworten.

Demzufolge, basierend auf dem dynamischen Verwendung eines Zebrafischs sowohl Erkrankung und des Entwicklungsforschung, Zellmarkierungsmethoden und Quantifizierung Signal sind ein wichtiger Aspekt der Datenanalyse. Während Methoden, die eine Leuchtstoff beschäftigenAntikörpern verwendet werden, um die Proteinexpression in transgenen Zebrafisch erkennen, Forschern der Regel verlassen sich auf Standard-Verfahren wie WISH ^12-16, um die raumzeitliche Lokalisierung von Gen-Transkripte in einer festen, nicht-transgenen Zebrafisch-Probe zu untersuchen. In der Tat ist WISH einer der am weitesten verbreiteten Techniken in der Biologie ^16, und ist ein wichtiges Werkzeug, um den Phänotyp von genetischen Mutationen und genetischen Störungen chemische Charakterisierung. Dennoch ist WISH mit einer Reihe von möglichen Gefahren und Herausforderungen verbunden. Um die Spezifität des Antisense-ribroprobe bestätigen, können Sinn Ribosonden als Kontrolle, um die Spezifität des Antisense-RNA-Sonde Färbungsmuster Beurteilung verwendet werden. Während die Abschnitte 4 und 5 sind in der Reihenfolge der Kennzeichnung und Erkennung einer Digoxygenin-markierten Sonde, gefolgt von Fluorescein-markierten Sonde präsentiert, kann diese Reihenfolge umgekehrt werden. Typischerweise werden schwächere Signale (Gene mit niedrigeren Expressionsniveaus) am besten mit Digoxygenin-markierten Sonden und diese Färbung nachgewiesenentwickelt, zuerst mit einem violetten Substrat, gefolgt von der Detektion und Färbung des stärkeren Signals (mehr reichlich exprimierten Gens) unter Verwendung des roten Substrat. Jedoch, wenn zwei Farbreaktionen gehen geführt werden soll, empfiehlt es sich, dass verschiedene Kombinationen von Markierungen und Substrate getestet, um die Verfahren, die am besten für die Datenerfassung und-analyse werden. Darüber hinaus können die Zeiten für das Sperren, Antikörper-Inkubation und Waschen in Abschnitten 4-5 sind Embryonen, die jünger als 24 Stunden nach der Befruchtung zugeschnitten vorgesehen; zeitlichen Abständen dieser gleichen Schritte mit älteren Embryonen zu Salzanreicherung auf der Probe führen. Umfangreiche Tipps zur Fehlerbehebung Standard Zebrafischembryo wollen, haben bereits in der Literatur ^12-16 dokumentiert. Wohl die häufigste Dilemma ist Hoch Hintergrund. Wir empfehlen die Erhöhung der Anzahl von MABT Waschungen in Schritt 4,7 bis 15-20 wäscht, wenn nötig, aber nach unserer Erfahrung die Zugabe der Nacht MABT "Super-Wash"gibt hervorragende Ergebnisse, wenn bevor Sie zu Schritt 4.8 in Verbindung mit 10 oder mehr kurze MABT Waschungen verwendet. Ein weiteres Beispiel ist schlecht Dilemma Sonde Infiltration, die mit langen Ribosonden auftreten können. Scheren der Riboprobe folgenden Schritt 3.6 durch alkalische Hydrolyse kann dem entgegenwirken. In unserer Erfahrung mit kleinen Proben wird Scher Sonde in der Regel nicht erforderlich. Allerdings sollte man bedenken, dass wie diese können Faktoren werden im Ergebnis eines Experiments WISH-Parameter zu halten, und wir schlagen vor Prüfung dieser nützlichen Anweisungen zur Fehlerbehebung bereits öffentlich in der Gemeinde bei Bedarf zur Verfügung, um die experimentellen Parameter für WISH in Ihrem eigenen zu verfeinern Forschungs ^12.

Neben den traditionellen Techniken WISH ^12-16, hat es eine kontinuierliche Fortschritte in der Entstehung von WISH Methoden und alternative Protokolle, die formuliert wurden. Dazu gehören neue Möglichkeiten der Signalerfassung, beispielsweise durch die Verwendung von FluoreszenzFluoreszenz ^17-19, zu Methoden, die die Lokalisierung von microRNAs ²⁰ zu ermöglichen. Auch so, trotz der vielen Verbesserungen, die Stromzelle Markierungsverfahren hergestellt wurden, die Wirksamkeit dieser Verfahren werden negiert, wenn der Fleck (en) kann nicht einfach in der Probe von Interesse zu einem beliebigen Zeitpunkt dargestellt werden. Diese Einschränkung ist problematisch für die Forscher vor allem, wenn es um die frühen embryonalen Stadien der Ontogenese Zebrafisch betrifft, die möglicherweise zu Lücken führen könnte in unserem Verständnis der verschiedenen Entwicklungsprozesse, die zu diesen Zeiten auftreten. Während des normalen Zebrafisch-Entwicklung, wird der Dottersack schrittweise zu verkleinern, wie die Embryo im Alter von ^11. Daher wird bei diesen späteren Entwicklungsstadien (> 24 Stunden nach der Befruchtung) ist WISH Färbung relativ einfach zu analysieren, weil der Embryo ist größer im Vergleich zu den angrenzenden Dottersack. Dies ist jedoch nicht der Fall von Schwanzknospenstadium früh Somitogenese (wenn der embryonalenMasse um das Eigelb positioniert), wobei die opake Dottersack kann manchmal verdecken die Visualisierung der Fleck. Folglich ist die Methode der flachen Montage wurde entwickelt, um die Bild-und Datenanalyseprobleme mit der Charakterisierung der frühen Zebrafischembryo Proben (in Fig. 1 und Fig. 2 schematisch dargestellt) verbunden zu lindern, und ist breit, da die systematischen Phänotypisierung von genetischen Mutationen isoliert verwendet von den ersten großen genetischen Bildschirme ^21.

Seit dem Aufkommen des flachen Befestigungstechnik hat sich die Analyse der frühen Entwicklungsstadien wurde erheblich verbessert. Sobald das Eigelb aus dem Embryo entfernt wird, ist es möglich, den Embryo flach auf einem Glasträger in der gewünschten Orientierung für die Bildgebung zu legen. Dieses zweidimensionale Position ermöglicht das Betrachten des gesamten Embryos auf einmal, wodurch die Notwendigkeit, die Probe zu drehen verhindert. Zahlreichen Geweben sind in breiten Bereichen des Embryos, wie sichdie Vorläufer, die die Blut-und Nieren bilden. Weiterhin kann man brauchen, um mehrere verschiedene Gewebe entwickeln auf einmal vergleichen. Flache Montage ermöglicht die Forscher gleichzeitig betrachten die gesamte Domäne solcher Zellgruppen, und kann somit große Hilfe Quantifizierungen wie einem Flächenmessung für ein Gewebe-oder Zellzahlen. Diese Technik hat sich letztlich dazu beigetragen, führte zu vielen Entdeckungen über eine Vielzahl von wichtigen Entwicklungsmechanismen Hämatopoese, Neurogenese und Organogenese zugrunde liegen. So, einmal gemeistert, die Anwendungen für diese einfache Technik für die Forscher sind ganz erheblich.

Zum Beispiel, in einer Studie, Abstammung Wahl während der Hämatopoese, flach montieren Zubereitungen von Zebrafischembryonen bei den 14 und 18 Somiten Stufen (ss) wurden verwendet, um die Änderungen, die in der Expressionsmuster des PU.1 Zinkfinger-Transkriptionsfaktor zwischen aufgetreten veranschaulichen Wildtyp-und GATA1 Morpholino injizierten Embryonen ^22.Dieses Verfahren ermöglichte die Detektion eines erweiterten PU.1-Domäne bei 18 ss, die anzeigt, dass GATA1 ist wahrscheinlich die Expression von PU.1 in der Zwischenzellmasse (ICM) um diesen Zeitpunkt. Zusätzliche flach montiert Embryonen für verschiedene erythroid Gene einschließlich gtpbp1 und Epsin gefärbt zeigte einen Verlust in der Expression dieser Gene in vlt Mutanten, die GATA1 waren ^{- / -.} Weitere Analysen zeigten keine Veränderung in der Expression von Genen wie erythoid biklf und testhymin, die bekannt waren, unabhängig von gata Aktivität sein. Daher wird in Verbindung mit ihren anderen experimentellen Ergebnissen wurde gezeigt, dass GATA1 wesentlich bei der Regulierung der Differenzierung von Zellen in der erythroiden Abstammungslinie Myelom. In einer Studie der Neuralleiste Entwicklung wurden flache Halterungen verwendet werden, um Crestin Ausdruck in mont blanc untersuchen (mob ^{m610)-Mutanten} in einer StudieUntersuchung der Rolle von Mont Blanc und tfap2a Genfunktion ^23. Bei 10 und 20 ss, wurde Crestin Ausdruck ganz in den Kopf aufgehoben und wurde im Rumpfbereich der Mob ^{m610-Mutanten} im Vergleich zu den normalen Wildtyp-Ausdruck zurück, schließlich Unterstützung bei dieser Gruppe, über die Bedeutung des Mont Blanc und tfap2a Regulierung schließen während Neuralleisteninduktion. Zusätzlich wird in Bezug auf Organ, Flachlager haben die Entdeckung der Anwesenheit von verschiedenen Domänen in den frühen Nierenvorläuferfeld während der Entwicklung des Zebrafisch embryonalen Niere, wie die Pronephros bekannt freigegeben. Die Zebrafischembryo bietet eine konservierte und doch anatomisch einfaches System zu untersuchen, wie Nierenvorläuferzellen führen zu den nephron Funktionseinheiten, die die Pronephros umfassen, ein Verfahren, wie bekannt Nephrogenese ^6,7 (Abbildung 4). Wohnung montieren Analyse hat sich als nützlich erwiesen, um Dokument-Domänen der Wiedernal-und Vorläuferzellen, um das Ergebnis von Veränderungen in RA-Signalisierung während Pronephros Strukturieren ^6,7 (Abbildung 5), die bisher unbekannt war sezieren. Zusammengenommen deuten diese Beispiele, dass es tatsächlich viele breite Anwendungen für diese Wohnung montieren Protokoll in der Studie der vielfältigen Prozesse, die während der normalen Entwicklung und Krankheitszuständen auftreten.

Konzeptionell ist diese flache Halterung Verfahren recht einfach insgesamt. Allerdings können die Manipulationen und der Grad der Finesse erforderlich, um dieses Verfahren beherrschen recht schwer zu meistern in der Abwesenheit von visuellen Demonstration sein. Daher wurde dieses Protokoll erstellt, um Forscher, vor allem diejenigen, die mit dem Zebrafisch-Modell, mit der Möglichkeit, besser zu verstehen, wie diese Technik durchführen und unsere Beratung zu den Reagenzien, Gewebe Handhabung optimieren können. Wir hoffen, dass dieses Protokoll wird letztlich anderen in der Gemeinschaft, die ideale Probenbedingungen zu verfeinern, um used für Premium-Bildgebung, Datenanalyse und Kommunikation der Ergebnisse in Publikationen. Letztlich sollte dies Forschern ermöglichen, die anatomischen Hindernisse des Zebrafisch während der frühen Embryogenese zu überwinden, welche die Darstellung der Versuchsergebnisse verschleiern kann, und lösen diese durch die Verwendung dieser einfachen, aber bedeutende Technik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 X E3			250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3			Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish	Falcon	35-1005
Transfer pipette	Samco	202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube	VWR	87003-300; 87003-298
Glass vial	Wheaton	225012
1x PBST			0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock	American Bioanalytical	AB02038
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	19210
4% PFA/1X PBS			Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit	Corning	430516	1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH	Sigma	34860-4L
Proteinase K	Roche	03-115-879-001	Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+			50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents	Roche	11175025910; 11685619910	Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase	Roche	11487671001
T7 RNA polymerase	Roche	10881775001
T3 RNA polymerase	Roche	11031171001
RNase 1 inhibitor	Roche	3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer	Roche	4716728001
Glycogen	Roche	10901393001
Ethanol (EtOH)	Sigma	E7023	Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water	Mediatech	25-055-CM
Waterbath	Thermo	51221073	Model 2831
Nanodrop	Thermo	ND-2000c
Formamide	American Bioanalytical	AB00600	Store at -20 °C.
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
MAB			2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT			MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution			We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock	Invitrogen	16140089	Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock	American Bioanalytical	AB00448	Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody	Roche	11-093-274-910	Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody	Roche	11-426-338-910	Store at 4 °C.
12-well staining dish	BD-Falcon	35-3225
Pre-staining buffer			100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple			For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red			For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock	Sigma	N6876	Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock	Sigma	I8377	Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock	Sigma	B8503	Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde)	American Bioanalytical	AB00450
Glycine	Sigma	G8898	0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish	Corning	430589, 430588
Glycerol	Sigma	G7893
Fine forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool			Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling clay	Hasbro	Playdoh	Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder	Thermo-Fisher	12-587-10	Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645, SMZ1000
Compound microscope	Nikon	80i, 90i