Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51604
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

Abstract

עובר דג הזברה הוא כעת בשימוש נפוץ למחקר בסיסי ויו לחקור את הבקרה הגנטית של תהליכים התפתחותיים ולמודל מומים מולדים. במהלך היום הראשון לחייהם, עובר דג הזברה מתקדם דרך שלבי התפתחות רבים כולל הפריה, מחשוף, gastrulation, פילוח, וorganogenesis של מבנים כגון מערכת עצבים מרכזית בכליות, לב, ו. האנטומיה של עובר דג הזברה צעיר מציגה כמה אתגרים להדמיה והניתוח של הרקמות מעורבות ברבים מהאירועים האלה כי העובר מתפתח בשיתוף עם מסת חלמון עגולה. לפיכך, לניתוח והדמיה של פנוטיפים ניסיוניים בדגימות עובריים קבועות בין tailbud ו20 שלב somite (10 ו19 שעות שלאחר הפריה (hpf), בהתאמה), כמו אלה מוכתמים באמצעות מדויקים הר שלם הכלאה באתרו (לוואי), זה הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסיר את העובר מן החלמון בכל וכדי למקם אותו שטוח בשקופית זכוכית. עם זאת, ביצוע הליך הר שטוח יכול להיות מייגע. לכן, מוצלח ויעיל שטוח הר ההכנה היא הקל מאוד דרך ההפגנה החזותית של הטכניקה לנתיחה, וגם עזרו באמצעות חומרים כימיים המסייעים בטיפול ברקמות אופטימליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול הרצון שלנו לגילוי אחד או בשני צבעים של ביטוי גנים בעובר דג הזברה, ולהדגים כיצד הליך ההרכבה השטוח יכול להתבצע על דוגמא זו של מוכתמת דגימה קבועה. פרוטוקול הרכבה שטוח זה החלים רחב לחקר מבנים רבים עובריים העולות במהלך פיתוח דג הזברה מוקדם, ויכול להיות מיושם בשיתוף עם שיטות צביעה אחרות שבוצעו על דגימות עובר קבועות.

Introduction

דג הזברה, Danio rerio, הפכה לאורגניזם בשימוש נרחב בחקר הביולוגיה התפתחותית. דג הזברה הם טרופי מיני חוליות של מים מתוקים, השייכת למשפחה Cyprinidae. דג הזברה שימשו במקור למחקר סביבתי כדי להשיג מידע על הסיכונים של מזהמי מים פוטנציאליים, כפי שהיו השגה בקלות, זולים, וקל לתחזוקת 1. בשלושים השנים האחרונות, דג הזברה הפכה מוכרת כמערכת מודל חוליות גנטית צייתנית עבור שורה של סיבות. דג הזברה מראה רמה גבוהה של שימור אנטומיים ופיזיולוגי עם חוליות גבוהות כולל יונקי 2,3. ביאור רצף הגנום לאחרונה גילה כי כ -70% מהגנים באדם יש מקבילה דג הזברה אחד לפחות 4. לדוגמא, רבים גנים orthologous כי לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות כליות זוהו בין המינים אלה 5-7. חדר כל זהתואר Matic של שימור בכל הקשור לביולוגיה תאית ומולקולרית אפשר לחוקרים ליצור מודלים עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם בדג הזברה 8, ודג זברה הפכו כלי רב ערך כדי לזהות טיפולים תרופתיים פוטנציאליים באמצעות מסכי גנטיים כימיים 9.

יתר על כן, מודל דג הזברה הוא לא רק מסוגל לשחזר מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים מורכבים ומדינות מחלה כי הם ראו בבני אדם, אבל כמה תכונות נוספות גם להגביר את האטרקטיביות שלו כאורגניזם מודל למחקרים עובריים. דג הזברה הוא מטיל ביצים ומתרבה באמצעות השרצה שידור, המספקת לחוקרים עם גישה קלה לעוברים מהתחלתה של הפריה 10. יתרונות נוספים כוללים גודל עובר, שקיפות, והתפתחות מהירה, חיצונית 10. בנוסף, מבוגרים דג הזברה יש פוריות גבוהה ובדרך כלל לייצר בגדלים מצמד גדולים יחסית שיכול לנוע בין 200-500בשבוע, סופו של דבר מאפשר לחוקרים לבצע ניסויי תפוקה גבוהים, כגון מסכי כימיים פנוטיפ מבוסס, בקלות 9.

אף על פי כן, למרות שפע של יתרונות שמוצגים על ידי מודל דג הזברה, ישנם אתגרים הנוגעים לניתוח והתקשורת של תוצאות הניסוי המתקבלות משלבי התפתחות מוקדמים. במקרים מסוימים, את האנטומיה הפנימית של עובר דג הזברה יכולה לטשטש ויזואליזציה של נתונים של אחד. לאחר הפריה, התא הראשוני עובר אירועי מחשוף מרובים כפיתוח מתקדם 11. בעקבות gastrulation, הציר העוברי מתגלה בשלב tailbud (10 hpf), כך שהוא עוטף את החלמון 11. כפיתוח הבא מתקדם דרך תקופת הפילוח, תא המטען יגדל במסה וגם להאריך ידי התארכות צירית כך שזנב יחד עם חלק מצק החלמון עצמו להאריך מ המוני החלמון המרכזי11. בין tailbud ו20 שלב somite (19 hpf), מנסה להתבונן בתכונות התפתחותיים ספציפיות לאחר הניצול של פרוטוקולי צביעה שונים, כגון רוצה, יכול להיות מאתגר גם כדי לחזות ולצלם בשל הגיאומטריה של העובר ואטימות של שק החלמון. דרך אחת לחסל את האתגרים הללו היא להסיר את החלמון ולאחר מכן לשטח את העובר למדגם דו ממדים שניתן לנתח באופן ישיר יותר.

משאבי הפרוטוקול והסרטון הבאים מספקים מדריך לאיך deyolk בהצלחה ושטוח הר עובר הבא קיבוע וצביעה, תוך שימוש בדוגמא של אחד או הכתמה מאחלת בשני צבעים. רצון הוא טכניקה בשימוש נרחב, המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין ספציפיות בדגימות נשמרו ובכך מאפשרת לאתר (ים) של ביטוי גנים כדי להתגלות בתוך רקמות. טכניקות מאחלות כבר תוארו בהרחבה, וניתן לבצעו עם מצעים בצבע שונים, כמו גם שפעתמערכות גילוי orescent 12-20. כאן אנו מספקים פרוטוקול המאחלים שונה שלנו המשמש לעוברי דג הזברה בין שלבי tailbud ופילוח של פיתוח. פרוטוקולים מאחלים אלטרנטיביים, לעומת זאת, עולים בקנה אחד עם הליך ההר השטוח שתואר כאן, כפי שציינו בתחילת דבריו של הפרוטוקול בהמשך. בנוסף, הרכבה שטוחה יכולה להיות מנוצל בשיתוף עם מספר כלשהו של טכניקות הדמיה קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה ההר שלמה, או תוויות מעקב שושלת תא, שאינם מתוארות בפרוטוקול זה. בסך הכל, בטכניקה של הרכבה שטוחה יכולה יותר לאפשר ניתוח והצגה מעולים של נתונים המתקבלים מניסויים בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות עוברית בדג הזברה.

Protocol

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת נוטרדאם. הערה: ההליכים המתוארים בחלקי 1-5 שימשו כדי ליצור תמונות עוברים ניתנות כאן בתוצאות הנציג. ההליכים המתוארים בחלקים 1-5 יכולים להיות תחליף כרצוי עם הליכים חלופיים מאחלים 12-16 או טכניקות הדמיה אחרות, כגון תיוג immunohistochemical לחלבונים ספציפיים באמצעות נוגדנים ספציפיים. בביצוע mounts שטוח על עוברי דג הזברה רוצה עם הפרוטוקול המתואר בחלקי 1-5, קיבעון העובר הראשוני וצעדי קיבעון צביעה סופיים הן המניפולציות העיקריות המשפיעות על היכולת להסיר גרגרי חלמון מהמדגם להרכבה שטוחה. תוצאות ההרכבה שטוחה הטובות ביותר מתקבלות כאשר הקיבוע הראשוני מתבצע עם קרח מופשר טרי paraformaldehyde 4% הקרים (PFA) / 1x PBS והקיבוע שלהתגובה הסופית המאחלת צביעה עם 4% הקרח קר PFA/1x PBS (מה שלא צריך להיות מופשר טרי), ומומלץ כי קוראים לשקול את זה כשמחליף שיטות צביעה חלופיות בשילוב עם חלקי 6-8.

1. אוסף עובר, קיבוע, ואחסון

  1. הכן את כלובי הזדווגות על ידי הצבת זכר בוגר דג הזברה (ים) ונקבה (ים) בתאים של מים במערכת, כך שהם מופרדים על ידי חוצץ בין לילה.
  2. הסר את המחיצות שבין מבוגרים ולאסוף את הביצים המופרות באמצעות מסננת תה משובחת רשת תיל בתוך ~ 15-30 דקות של הזדווגות לאסוף ציפורניים שיש לי שלבים עובריים מקבילים.
  3. הפעל את המסננת הפוכה ולשטוף את המשטח עם זרם עדין של E3 לוותר מבקבוק להשפריץ להעביר את העוברים לתוך צלחות דגירה המכילות כ 25 מיליליטר של תמיסת E3.
  4. לאחר האיסוף מאחיזתו, יש לחלק אותם לכמה מנות כגון שכ 50-60 עוברים מודגרתבכל מנה של 25 מיליליטר של תמיסת E3. הערה: צפיפות יתר של עוברים יכול להוביל לasynchrony התפתחותיים הדרמטי בתוך צריך לקחת את המצמד והטיפול כדי למנוע זאת כדי לאפשר גבייה בזמן של השלב (ים) הרצוי.
  5. דגירה את העוברים על 28.5 ° C כדי לאפשר הערכה מתפתחת בהתאם לסדרת הבימוי סטנדרטי דג הזברה 11.
  6. השתמש פיפטה העברה פלסטיק למקום בעדינות את המספר הרצוי של עוברים בtimepoint הנבחר, עד שלב 20 somite (19 hpf), לתוך צינור microcentrifuge תחתון שטוח. הערה: תשמור על עצמך בטיפול בעוברים צעירים, כפי שהם שבירים ויכולים להיפגע בקלות על ידי ריסוק או טיפול אגרסיבי עם טפטפות העברה. לחלופין, צלוחיות זכוכית יכולות לשמש לקיבוע ועיבוד של עוברים. לכל שטיפות הפרוטוקול שלאחר מכן יכולה להיות מנוצל טפטפות העברת פלסטיק, למעט בנוסף riboprobe וההסרה (שלבי 3.11, 3.14).
  7. החלף את E3 עם 4% הקרח קר PBS PFA/1x, ולתקן את העוברים בchorions ב 4% PBS PFA/1x עבור 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה. הערה אזהרה: PFA היא רעילה ויש לטפל פתרונות PFA במנדף כימי בעת לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כוללים כפפות וחלוק מעבדה. בנוסף, אבקת PFA יש לטפל בטיפול יוצא דופן בעת ​​ביצוע פתרון המניות, כמו גם PFA המגורענים יכול נוטה לפזר באמצעות מטען סטטי. בדרך כלל PFA מוכן על ידי חימום PBS 1x לרתיחה לפזר אבקת PFA, ואז הפתרון מאוחסן בaliquots ב -20 ° C. אם משקעים דקים נמצאים ב4% PBS PFA/1x פעם הפתרון הוא מקורר, מסנן לעקר את הפתרון מקורר לפני aliquoting לאחסון בהקפאה ידי העברתו דרך מערכת סינון 0.45 מיקרומטר. רק מוכן טרי או PFA מופשר טרי משמש לקיבוע הזה ראשוני (כלומר ראשוני) של העובר.
  8. הסר את התיקון ולשטוף את העוברים פעמיים עם 1x PBST, ולאחר מכן להעביר לתוךצלחת דגירה.
  9. הצג את העוברים תחת סטראו ולהשתמש בשני זוגות של מלקחיים בסדר להסיר את chorions המקיף את העוברים, כך שזוג אחד משמש ללמנף את העובר בעדינות ואילו הזוג השני משמש לקורע סיסית.

2. Permeablization העובר

  1. מעביר את עוברי dechorionated בחזרה לתוך בקבוקון צינור microcentrifuge או זכוכית, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 1x PBST כדי להסיר כל פסולת סיסית שנותרה.
  2. הסר את PBST 1x ולשטוף את העוברים פעמיים עם מתנול 100% (MeOH).
  3. מניחים את העוברים ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות. הערה: ניתן לאחסן את עוברים ב-20 מעלות צלזיוס בMeOH במשך שנה אחת או יותר. מתנול עושה chorions דביק, ולכן לא ימשיך לשלב זה, אלא אם כן chorions הוסר.
  4. רעננותם את העוברים על ידי הסרת MeOH 100% ולשטוף אותם בטמפרטורת חדר במשך 5 דקות כל אחד ב50% MeOH/1x PBST, 30% PBST MeOH/1x, ולאחר מכן פעמיים עם 1x PBST. </ Li>
  5. הכן פתרון proteinase הטרי K עובד (5 מיקרוגרם / מיליליטר) על ידי הוספת 25 μl של מניות מופשרים טרי proteinase K (10 מ"ג / מיליליטר) ל50 מיליליטר של 1x PBST.
  6. הסר את PBST 1x מהעוברים, ואז להחליף עם proteinase K פתרון עובד ודגירה המבוססת על השלב העוברי: <= 5 somites דקות 1; 10-12 somites ל1.5 דקות; 15 somites למשך 2 דקות, ו20 somites במשך 3 דקות.
  7. הסר את פתרון K proteinase העבודה ולשטוף את העוברים פעמיים עם 1x PBST.
  8. הסר את PBST 1x ולהחליף עם 4% הקרח קר PBS PFA/1x לפחות 20 דקות בטמפרטורת חדר.

3. Riboprobe סינתזה, Prehybridization, הכלאה, והסרת Probe

  1. להרכיב את antisense riboprobe תגובת שעתוק במבחנה בטמפרטורת חדר בצינור 1.5 microcentrifuge מיליליטר, תוך שמירה על אנזימים על קרח, על ידי שילוב של תבנית ה-DNA המכילה רצף המתאים לגן של עניין (בין 100-200 ng של ה-PCRמוצר או 1.5 מיקרוגרם של פלסמיד-DNA לינארית, שהוכן כ12,13 תאר), 2 μl של digoxygenin או ribonucleotides והעמסת שכותרתו, 2 μl של RNA פולימראז המתאים (SP6, T3, T7 תלוי באיזה רצף הוא שולב המוצר או PCR בהווה על פלסמיד דנ"א), 2 μl של 10x חיץ שעתוק, 0.5 μl של מעכב RNase, ומביא להיקף כולל של 20 ul עם מים מזוקקים כיתה מולקולרית (DNase, RNase חינם). הערה: חיץ שעתוק 10x יש prewarmed על ידי הנחת הצינור בwaterbath 37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות, ולאחר מכן vortexed כדי להבטיח שכל הרכיבים נמצאים בפתרון. אם פתיתים הלבנות נמצאות, דגירה הצינור לעוד דקות 5-10 ומערבולת שוב. תגובות תמלול יכולות להיכשל או שיש לי תשואות עניות אם חיץ השעתוק לא נמסו לגמרי ומעורב באופן יסודי.
  2. מערבבים את הרכיבים ודגירה כל תגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בwaterbath.
  3. הסר את התגובה tuלהיות (ים) מwaterbath, ולהרוס את תבנית ה-DNA בכל דגימה על ידי הוספת 5 μl של 10x DNase אני חיץ, 2 μl של DNase אני אנזים, ו23 μl של מים מזוקקים כיתה המולקולרית כדי להביא את הנפח הכולל עד 50 μl, ואז דגירה צינור אחד על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בwaterbath.
  4. בצע משקעים אתנול בצינור אחד microcentrifuge ידי הוספת 5 μl של 3 אצטט M נתרן, pH 5.2 ו110 μl אתנול 100% קרח קר, ואחריו 1 μl של מניית גליקוגן כדי להקל הדמיה גלולה RNA בשלבים הבאים, ואז דגירה צינור ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 או למשך הלילה.
  5. צנטריפוגה כל צינור microcentrifuge במהירות המרבית 4 ° C עבור 20 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant 100% אתנול ולהחליף עם 70% אתנול קר כקרח 100 μl.
  6. צנטריפוגה כל צינור microcentrifuge ב-C ° 4 למשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant 70% אתנול והאוויר יבש גלולה במשך 5 דקות, ולבסוף מוסיף של מו 100 μlכיתה lecular מים מזוקקת לresuspend את הכדור ולכמת את ריכוז מניית riboprobe באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop. הערה: לאחר גלולה הושקעה פתרון, מניית riboprobe צריכה להיות כל הזמן על קרח ואוחסנה ב -20 מעלות צלזיוס.
  7. כדי להכין את העוברים הקבועים לתהליך prehybridization, הסר את 4% PBS PFA/1x מכל מדגם ולשטוף את העוברים פעמיים עם 1x PBST.
  8. העבר בין 25-40 עוברים ב1x PBST לתוך צינור אחד microcentrifuge אחת שטוח תחתון. הערה: צפיפות יתר של עוברים יוביל לצביעה אחידה לאחר מכן, ויש להקפיד להגביל את הגודל המדגם בכל צינור כ 40 עוברים.
  9. החלף את PBST 1x בצינור אחד עם 500-1,000 μl של היב +.
  10. מניחים את הצינור (ות) של עוברים לתוך תנור ב 70 מעלות צלזיוס, ודגירה אותם בטמפרטורה זו למשך 4 שעות כדי לבצע prehybridization.
  11. הכן את riboprobe / היב + פתרון על ידי הוספת 100-500 ng של riboprobe (digoxygenin ו / או fluorescשכותרתו עין) ל500 μl של טרי היב + ואז דגירה פתרון זה על 70 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות לפני שלב 3.11 לprewarm זה. הערה: כדי לזהות תעתיקי גנים מרובים, תוך שימוש בתיוג יחיד ו / או כפול colorimetric, כל אחד מriboprobes המתאימה לגנים אלה צריכים להיות משולבים לתוך riboprobe אחד / היב + קוקטייל.
  12. הסר את היב prehybridization + מצינור אחד של עוברים ולהחליף עם riboprobe מספיק / היב + לכסות את העוברים. הערה: בדרך כלל, 200-250 μl של riboprobe / היב + יש צורך לכסות את העוברים בצינור microcentrifuge אחד שטוח תחתון. Riboprobe / היב + חיבור והסרה מבוצע בדרך כלל באמצעות פיפטה טיפים ומחסום על מנת למנוע זיהום צולב בין דגימות.
  13. דגירה את העוברים ב70 מעלות צלזיוס לילה עם + ribroprobe / היב.
  14. הכן את הסט של פתרונות לשטוף ומראש לחמם-הבא לילה בשעה 70 C °: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT, וSSCT 0.2X. שים לב: זה נוח להכין 50 מיליליטר אלiquots של כל לשטוף את הפתרון, משום שהעודף יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר ולאחר מכן מחומם לשימוש עתידי.
  15. הסר את riboprobe / היב + באמצעות פיפטה ומחסום טיפים ולאחסן ב -20 ° C. הערה: בדרך כלל כל riboprobe / היב + תערובת יכול לשמש מספר פעמים (לדוגמא, 3 או יותר) וללא קיזוז אות. אמנם שימוש חוזר riboprobe / היב + מזוהה עם רקע נמוך יותר, עם זאת, יש לזכור כי בשימוש חוזר תערובות riboprobe יכולות להיות כפופות לשפלה.
  16. לשטוף את העוברים פעמיים עם SSCT formamide/2x 50% למשך 30 דקות ב70 ° C.
  17. לשטוף את העוברים פעם אחת עם 2x SSCT ל15 דקות ב 70 ° C.
  18. לשטוף את העוברים פעמיים עם SSCT 0.2X ל30 דקות ב70 ° C.
  19. הסר את SSCT 0.2X ולשטוף את העוברים פעמיים עם MABT בטמפרטורת חדר.

4. Anti-digoxygenin נוגדן דגירה וזיהוי

  1. הכן את הפתרון לחסום טרי.
  2. הסר את MABT ולהחליף עם solu הבלוקtion.
  3. דגירה את העוברים בפתרון לחסום ל2-4 שעות בטמפרטורת חדר. הערה: incubations בלוק ארוך יותר לספק תוצאות אופטימליות עם שלבים צעירים דג הזברה עוברים (<15 somites). כדי לעשות את הליך הבלוק הארוך, לבצע את הדגירה הבלוק ל8-12 שעות בטמפרטורת חדר או בשילוב של טמפרטורת חדר בתוספת (עד ~ שעה 8) דגירה 4 ° C לאחר הלילה.
  4. הכן את פתרון הנוגדן אנטי digoxygenin על ידי ביצוע דילול של פי 5,000 בפתרון טרי בלוק (למשל, μl 1 לכל 5 מיליליטר של בלוק).
  5. להסיר את החסימה ולהוסיף את פתרון נוגדן / לחסום.
  6. כסה את המדגם בנייר כסף ודגירת הלילה בשעה 4 ° C או ל4 שעות בטמפרטורת חדר.
  7. הסר את anti-digoxygenin/block ולשטוף את העוברים לפחות 10 פעמים עם MABT. הערה: העבר את העוברים למאכלי 12 גם לשוטף MABT. זה מגדיל את המהירות שבה ניתן לכבס את העוברים, וזה שימושי בעת עיבוד כמויות מדגם גדולות,nd עושה את זה קל לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה מכתים (שלב 4.11) תחת סטראו. הערה: בשלב זה עובר יכול להיות "שטף סופר 'על ידי דוגרים אותם בן לילה בMABT על 4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לשלב 4.8, שהוא טיפול יעיל לבדיקות שנוטות לתת רקע גבוה או כתמים הדורשים ניטור ממושך במהלך עבודה ביום.
  8. הכן את החיץ מראש מכתים ופתרון הרצוי מכתים (מצע סגול או אדום).
  9. הסר את MABT ולשטוף את העוברים במאגר טרום מכתים במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  10. הסר את כל המאגר של טרום-מכתים ולהוסיף את הפתרון מכתים.
  11. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה מכתים טמפרטורת חדר בכל דקות 15-30 על ידי בדיקה את המראה של העוברים תחת סטראו. הערה: שיעור התגובה מכתים יכול להיות האטה על ידי העברת הדגימות ל4 מעלות צלזיוס, אם יש צורך לתת יותר זמן להשלמה של הכתם. ברגע מקורר עד 4מעלות צלזיוס, לעומת זאת, התגובה לא יכולה להיות מואצת על ידי החימום לטמפרטורת חדר.
  12. כאשר התגובה מכתים תושלם, להסיר את הפתרון מכתים ולהחליף עם 1x PBST.
  13. שטוף פעמיים עם 1x PBST למשך 5 דקות. הערה: אם אינו מזהה גנים אחרים עם מצע אחר, ולאחר מכן לתקן את הדגימות ב4% הקרח קר PBS PFA/1x לפחות 20 דקות, והמשך לשלב 6.1. אחרת תמשיך לשלב 5.1.

5. נוגדן דגירה וזיהוי אנטי והעמסת

  1. הסר את PBST 1x ולשטוף את העוברים פעמיים עם 0.1 M גליצין, pH 2.2 15 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר. שים לב: הזמן לשטיפת גליצין הוא חיוני כדי לבטל את התגובה מכתים הראשונה לחלוטין.
  2. הסר את גליצין 0.1 M ולשטוף את העוברים פעמיים עם MABT במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. הכן את פתרון הנוגדן אנטי והעמסת על ידי ביצוע דילול של פי 5,000 בפתרון טרי בלוק (למשל, μl 1 לכל 5 מיליליטר של בלוק).
  4. הסר את MABT ולהוסיף את פתרון נוגדן / לחסום. בצע את השלבים 4.6-4.13 לבצע זיהוי של ribroprobe שכותרתו והעמסת. הערה: כאשר התגובה מכתים הסופית תושלם, זה חיוני כי הקיבעון האחרון של המדגם נעשה ב4% הקרח קר PBS PFA/1X. קיבוע עם פתרונות PFA חמים יותר נוטה להיות מזוהה עם חלמון דביק שקשה להסיר מן העובר במהלך הנתיחה וdeyolking להליך ההר השטוח.

6. Dissection העובר וDeyolking הראשוני של העובר

  1. בחר עובר קבוע, מוכתם להרכבה שטוחה.
  2. השתמש פיפטה העברה למקום מדגם העובר נבחר לתוך צלחת פלסטיק או זכוכית פטרי המכילה 1x PBST.
  3. מניחים את הצלחת תחת סטראו, ומגלגל את העובר באמצעות זוג מלקחיים בסדר או כלי לאש, כך שתצוגה לרוחב מתקבלת וקצות הראש והזנב הם דמיינו.
  4. השתמש בזוג אחד של מלקחיים בסדר לעשות חתך בהחלמון דואר במיקום במיקום מרכזי בין הראש והזנב של העובר, ובינתיים להשתמש בזוג שני של מלקחיים בסדר להחזיק את העובר כדי לספק מנוף לחתך החלמון. הערה: לחלופין, לעשות שני חתכים גדולים בחלמון, קרוב אחד לראש והשני קרוב לזנב של העובר.
  5. שימוש במלקחי קנס ו / או כלי לאש כדי לגרוף את החלמון מחלל תא חלמון.
  6. יש לשטוף את העובר בעדינות עם 1x PBST להסיר חלמון תועה.

7. פיין Deyolking של העובר

  1. להעביר את העובר לשקופית זכוכית שטוחה עם 1-2 טיפות של 1x PBST.
  2. השתמש בכלי להצליף ומלקחיים בסדר למקם בעדינות את העובר עם צד הגחון (חלמון) פונה כלפי מעלה בשקופית הזכוכית.
  3. גרור את העובר עד לקצה של פתרון 1x PBST שימוש באפשרות הריסים כך שהעובר נשאר במצב שטוח על שקופיות הזכוכית.
  4. לגרד את פני השטח הגחון של העובר בעדינות בעזרת הריסים כדיol כדי להסיר את גרגרי החלמון בלי לקרוע את העובר. בו זמנית להשתמש זוג מלקחיים בסדר לעגן את העובר בזמן גירוד עם הכלי להצליף. הערה: הסרת גרגרי החלמון יכולה לדרוש גירוד חוזר ונשנה ל5-10 דק '.
  5. אם פתרון PBST הופך גדוש חלמון עודף או מתחיל להתאדות, להוסיף 1-2 טיפות טריות של 1x PBST לשקופית באמצעות פלסטיק או פיפטה העברת זכוכית, ולאחר מכן לגרור את העובר לאזור עם הפתרון הנקי לגרגיר חלמון נוסף ההסרה.
  6. כאשר החלמון הוסר באופן משביע רצון, להשתמש פיפטה העברה כדי להעביר את העובר בעדינות בחזרה לתוך צלחת פלסטיק או זכוכית פטרי המכילה 1x PBST לשטיפה סופית על מנת להסיר גרגרי חלמון תועים.
  7. העבר את עובר deyolked באמצעות פיפטה העברה פלסטיק או זכוכית לתוך צלחת פלסטיק או זכוכית פטרי המכילה גליצרול 100%.
  8. דגירה העובר בגליצרול 100% ל~ 5 דקות כדי להסתגל העובר.

8. הרכבה בשקופית זכוכית

  1. העבר את עובר deyolked לשקופית זכוכית נקייה ב1-2 טיפות של גליצרול 100%.
  2. מקם את העובר עם צד הגחון (חלמון) מול שקופיות הזכוכית.
  3. שימוש בכלי לאש, גרור את העובר עד לקצה ירידת גליצרול כך שהעובר נשאר במצב שטוח על שקופיות הזכוכית. אם הציר העוברי הוא מעוגל, השתמש במלקחיים בסדר לעשות בעדינות חתכים קטנים מאוד בקרום תא החלמון שנותר כדי להקל על מתח, כך שהעובר יכול להיות ממוקמים שטוח בשקופית עם ציר ישר.
  4. הנח divots הקטן של פלסטלינה בארבע הפינות של coverslip זכוכית מ"מ 18 x 18. הערה: כחלופה, טיפות קטנות של שומן ואקום 15 ניתן להחליף לדוגמנות חימר.
  5. מקום coverslip הזכוכית באיטיות על העובר, לדוג coverslip על מנת למזער את הדור של בועות אוויר בגליצרול סביב המדגם.
  6. להוסיף טיפה נוספת של גליצרול 100%לצד השני של coverslip הזכוכית כדי למלא את החלל שבין coverslip ושקופיות הזכוכית.
  7. לחץ כלפי מטה לאט ובזהירות על ארבע הפינות של coverslip למצב בתקיפות את העובר בין הזכוכית ולמנוע היסחפות. הערה: היזהר שלא למחוץ את העובר.
  8. אם העובר אינו ממוקם לפי הצורך, להשתמש במלקחיים בסדר להסיר את coverslip. השתמש בכלי לאש כדי למקם את העובר ו / או מלקחיים בסדר לעשות חתכים נוספים כך שניתן למקמו מחדש את העובר. חזור על שלבים 8.4-8.7.
  9. שים לב ו / או תמונת הדגימה או באמצעות מיקרוסקופ סטריאו או תרכובת.
  10. אחסן את שטוח הר הכנה שטוחה עם בעל קרטון שקופיות בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות או באופן זמני בטמפרטורת חדר. הערה: הכתם המאחל תימוג בהדרגה לאורך זמן, תגובות מצע במיוחד אדומות, ולא ניתן לשמר בגליצרול ללא הגבלת זמן. כתמים סגולים גם לדעוך בקלות רבה יותר אם כל הזמן בגליצרול בהשוואה לPFA (ראה שלב 8.11). מעניין, זה כבר פורסם שעובר הרכבה בPermount במקום גליצרול יכול לאפשר אחסון בלתי מוגבל בטמפרטורת חדר 15.
  11. עבור אחסון לטווח הארוך של דוגמאות מוכתמות מצע סגול, הסר את coverslip הזכוכית ולשטוף את העובר שטף פעמיים ב1x PBST, ולאחר מכן להעביר לצינור microcentrifuge עם 4% PBS PFA/1x עבור אחסון לטווח ארוך. הערה: לחלופין, עובר ב1x PBST יכול להיות מעובד לניתוחים נוספים, כגון בידוד DNA לגנוטיפ.

Representative Results

הליך פרוטוקול הרכבה שטוחה כרוך הפיכתו של עובר דג הזברה מהאנטומיה שלה נורמלית, שבה ציר הגוף עטוף סביב חלמון כדור במיקום מרכזי, ל( איור 1 א) הכנה דו ממדים. הדמיה הר שלמה של עובר דג הזברה הצעיר מוגבלת על ידי הטבע של איך הציר העוברי כרוך סביב החלמון. כתוצאה מכך, צפיות לרוחב או גב של הר שלם דגימות עובר מוכתמות יכולות רק לתפוס נתח של הציר או רקמות מסוימות מעורפלות (איור 1). לשם השוואה, deyolking והשטחה של העובר מאפשרים הציר העוברי כולו להיות דמיינו בזמן זה (איור 1). מגבלות אלה הפגינו על ידי בחינת עובר מאחל מוכתם שכותרתו עם riboprobes antisense לזהות irx3b (סגול), אשר מסמן קבוצת משנה של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 7 עד 13, וmyod1 (אדום) אשר תוויותsomites (איור 1). השדה של אבות irx3b + כליות מוסתר בהר השלם תצוגה לרוחב, כי תמלילי irx3b נמצאים בשפע במערכת העצבים המרכזית, מה שהופך את שדה הכליות כמעט בלתי אפשרי לדמיין את זווית מצלמה לרוחב; נוסף, בתחום irx3b + אבות כליות גלוי רק בחלקו, כאשר העובר הוא הסתובב לתצוגת מצלמה הגבי כי השדה כרוך סביב החלמון (איור 1). עם זאת, נוף גב של אותו העובר הבא הרכבה שטוחה מאפשר את כל השדה של irx3b + אבות כליות להיות מנותח באופן ישיר ביחס לsomites לאורך תא המטען ומבנים אחרים עובריים (איור 1). כך, תחומים מרחבית משוכללים יכולים להיות מתועדים באופן אידיאלי בשיטה זו.

כמה שלבים עיקריים מעורבים בביצוע המוצלח של הליך ההר השטוח. כדי לבצע techniqu זהדואר, חלמון הכדור חייב להיות מנותק ראשון מהעובר התקין (איור 2 א), שניתן לעשות עם מכשירים עדינים כגון זוג מלקחיים בסדר בזמן שהעובר הוא דמיינו באמצעות סטראו. לאחר ההסרה הגסה של חלמון הכדור, כלי ריסים עדין מנוצל לגרד ממנו גרגרי חלמון שנותרו מחובר לעובר (איור 2). הסרת גרגרי חלמון שנותרו עוזרת להקל להדמיה של הרקמות העובריים. לבסוף, את עובר deyolked הוא מניפולציה כדי למקם אותו ביציבות בשקופית זכוכית (איור 2 ג), המאפשרת תיעוד תצפית ועזרים של המדגם באמצעות תוכנת הדמיה ומצלמה מחוברת למיקרוסקופ. הכלים הריסים הם מכשירים מתוצרת בית שניתן לבנות על ידי הדבקת ריסים מתאימים לקצה פיפטה באמצעות דבק מגע, שיכול להיות מותקן על גבי ידית אם תרצה בכך (איור 3 א, שולחן חומרים). יכולות להיות רכש דגימות ריסים שונים כדי לייצרלהשתלח כלים בעלי מאפיינים שונים במקצת במונחים של אורך ולהתחדד (איור 3 ב), כל משתמש יכול להיות שנטיות שונות לרגע שהם מתחילים להתנסות בהליך ההר השטוח. דוגמאות של דגימות ריסים כוללות באופן טבעי לשפוך ריסים אנושיים, לשפוך שיער מקורזל בעלי חיים או שפם באופן טבעי, ולבסוף זנים סינטטיים של ריסים זמינים מסחרי שנמצאו במחלקות קוסמטיקה הקמעונאי.

התקשורת המקומית שמסביב ומכילה את הדוגמא (ו) ממוקמת על (איור 4 א) שקופיות זכוכית ניתן הדמיה לניתוח ברזולוציה גבוהה. שילוב של בדיקות שימשו לתווית אבות הכליות מתפתחים כי להצמיח הכליות בעובר הסוג בר בשלבי התפתחות מוקדמים עם רצון בשני צבעים, ולאחר מכן שטוח הר הכנות בוצעו כדי להציג את הדגימות (איור 4B, 4C ). בשלבים המוקדמים somite, אבות כליות מסומנים בדפוס בצורת U על ידי הביטוי EIR של תמלילי pax2a (סגולים) המקיפים את המזודרם הפרקסיאלית כי במקביל מבטא C דלתא (DLC) (אדום) (בעמודה שמאלית, איור 4) 6,7. לשם השוואה, כאשר תמלילי dlc התגלו עם מצע סגול, ותויגו בשילוב עם krox20 המוח האחורי הסמן (אדום), משנה מקורי של אבות הכליות היה דמיינו שמבטא dlc (עמודה ימנית, איור 4), כפי שצוין בעבר 6,7. ניתן להשתמש בם הכנות הר שטוחים דומה ללמוד שלבי somitogenesis מאוחר יותר. בשלב somite 14, נתחנו את הביטוי של סמני pax2a כליות, slc4a4, וslc12a3 (סגול) יחד עם smyhc1 (אדום), אשר מסמן את somites (איור 4C). שילובים אלה מאפשרים המיפוי של תחום אב כליות השלם עם pax2a, בעוד שחשף כי תת קבוצה של תאים בexpr משנה מקוריessed slc4a4a והצטיינו בתחום משנה הזנב שאינו חופף של אבות כליות שהביעו slc12a3.

מאחלי שני צבעים והכנת הר השטוח הם גם בעלי ערך ללימוד של תחומים סלולריים במהלך organogenesis בדג זברה עם מוטציות גנטיות או הפרעות אחרות מהחשיפה הסביבתית למולקולות קטנות 6,7 (איור 5). NLS דג הזברה ומוטציות lib נמל מוטציות בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (aldh1a2, המוכר בשם raldh2), אשר מקודד אנזים דרוש לביוסינתזה של חומצה רטינואית (RA). דלקת מפרקים שגרונית הוא חיונית להתפתחות התקינה של סוגים רבים של תאי כליה כוללים היווצרות של תאי podocyte שתורמים להפוך את מסנן הדם של הכליה העוברית, המכונה glomerulus 6,7. מאחלים בוצעו לתייג את אבות podocyte עם wt1a זמנית עם תיחום של tהוא מתפתח somites עם smyhc1 ומוח אחורי עם krox20 בעוברי wildtype, NLS עוברי מוטציה, עוברים מוטציה lib, ועוברים שטופלו במעכב אנזים aldh כימי, DEAB (איור 5). עוברים עם ביטוי aldh1a2 לקוי הראה ביטוי wt1a מופחת בהשוואה לעוברי סוג בר, ואילו עוברים שטופלו DEAB הראו ביטול של תמלילי wt1a (איור 5, עמודה ימנית). יחדיו, תוצאות נציג אלה מדגימים כיצד טכניקת ההר השטוח ניתן להשתמש בם כדי לנתח ולתעד את הבדלים אנטומיים בדייקנות בעובר המוקדם, ובכך ייושם למחקרים התפתחותיים רבי ערך.

איור 1
איור 1. סקירה של תכשירי הר שטוחיםמזון לעוברי דג הזברה. א) ההליך של הרכבה שטוחה מאפשר התצוגה בו זמנית של רקמות לאורך הציר העוברי בגלל מסת החלמון המרכזית מוסרת והעובר ממוקם ביציבות על משטח שטוח. תמונות ב) להר שלם מאחלים עובר מוכתם בתצוגות לרוחב ועל גב, ואז אחרי הכנת הר שטוחה נערכה. העובר היה מוכתם עם בדיקות antisense לזהות תעתיקי גני קידוד irx3b (סגול) וmyod1 (אדום).

איור 2
איור 2. סכמטי של הליך ההר השטוח לעוברי דג הזברה. א) העובר deyolked הראשון גס כדי להסיר את רוב מסת החלמון, ולאחר מכן (ב ') את פני השטח הגחון הוא deyolked דק כדי להסיר גרגרי חלמון שנותרו, ולאחר שטיפת העובר (C) רכוב צד גב בשקופית זכוכית לניתוח חזותי ו / או הדמיה צילום.

איור 3
איור 3. תצלומים של כלים ריסים דוגמא בהשוואה למלקחיים בסדר. א) כלים לאש תוצרת בית היו הדמיה לצד זוג סטנדרטי של מלקחיים בסדר, ממוקמים בסמוך לשליט מטרי לספק התייחסות. תצוגה מוגדלת של כלים ריסים לצד המלקחיים בסדר ב '), עם התייחסות המילימטר סיפקה לאורך החלק העליון של התצוגה . שני כלים ריסים שונים מוצגים, עם הכוכבית (*) משמשת כדי לסמן את הריסים מתקבלים באופן טבעי לשפוך עפעף אנושי, וכוכבית כפולה (**) משמשת לסימון ריסים שהושגו משפם של חתולים באופן טבעי לשפוך וגזוז ל להפוך את קצה קהה במקצת. בכל אחד case, הריסים היה מושחל דרך קצה פיפטה ומודבק עם כמה שכבות של דבק מגע ליצור חותם חזק כדי לייצב / לעגן את הריסים לפיפטה המצורפות למכשיר טיפול בהדרגה.

איור 4
איור 4. אפיון של השינויים התפתחותיים בתחום אב הכליות בעובר דג הזברה הסוג בר. א) החלק סכמטי המציין את האזור צילם לניתוח בעוברים (B, C). B) סוג פראי ב1, 3, ו -5 שלב somite הוכתמו על ידי מאחלי שני צבעים על מנת להעריך את הקומפוזיציה של שדה אב הכליות שנותן לעלות לכליות העוברית, או כליה ראשית. תמלילים (בעמודה שמאלית) קידוד pax2a שעתוק הגורם (מוכתם בסגול) לסמן מספר אוכלוסיות בעובר, כוללים p הכליותשדה rogenitor שעולה מן המזודרם ביניים. תמלילי קידוד dlc יגנד Notch לסמן somites היוצרים מהמזודרם הפרקסיאלית (המוכתם באדום). (עמודה ימנית) כאשר הביטוי של תעתיקי dlc (המוכתמים בסגול) והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (מוכתם באדום) נבחנים באותו עוברים, ביטוי dlc יכול להיות שנצפה בתחום משנה מקורי של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 1-5, שהיה מוסתר בשיתוף ההכתמה של dlc עם עוברי סוג בר pax2a. C) בשלב 14 somite היו כפול או משולש מוכתמים עם שילוב של סמן כליות (סגול), smyhc1 הסמן somite (אדום) , והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (גם אדום). (פנל העליון) בשלב זה, תעתיקי pax2a ימשיכו לסמן את אבות הכליות. (התיכון, פנלים תחתון) בתוך שטח מוליד הכליות, משנה מקורי מסומןעל ידי slc4a4 ותמלילים המקודדים slc12a3 לסמן משנה הזנב.

איור 5
איור 5. השימוש בהכנות רכובים שטוחות לאפיין פנוטיפים נגרמים על ידי מוטציות גנטיות או הפרעות גנטיות כימיות לווסת יוסינתזה חומצה הרטינואית. הדפוס המאחל הביטוי בשלב 15 somite של wt1a (הסגול) וsmyhc1/krox20 (אדום) הושוו בין סוגי הבר ועוברים עם ליקויים בייצור חומצה רטינואית (RA) בשל פגמים בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (NLS ומוטציות lib) או עיכוב כימי של פעילות dehydrogenase retinaldehyde עם diethylaminobenzaldehyde (DEAB). ההפחתה של ייצור RA בlib היא מעט יותר חמורה מאשר NLS, כגוןשעוברי lib להביע מכתים מעט מופחת של תמלילי wt1a מאשר מבוים באופן דומה NLS עוברי מוטציה, ואילו טיפול DEAB של סוגים פרא קשור לביטול של ביטוי wt1a מלא.

Discussion

דג הזברה הוכיחו להיות אורגניזם מודל יקר מאוד בכל רחבי קהילת המחקר בשנים האחרונות. דג הזברה להפגין מידה ניכרת של שימור גנטי עם זה של בעלי חוליות גבוהות יותר, ויתרונות הנוגעים לאנטומיה, הרבייה, ומחזור החיים שלהם להפוך את המין הזה מאוד נוח לניתוח ניסיוני. יתר על כן, הקידום של טכניקות מולקולריות החלים על דג הזברה קידם עוד יותר את השימוש באורגניזם מודל זה במחקר מדעי. לדוגמא, מגוון רחב של קווי דג הזברה מהונדסים כבר נוצר כדי ללמוד את התקדמות מחלה וכדי לענות על שאלות מהותיות רבות העומדות בבסיס המנגנונים המרכזיים של פיתוח כולל organogenesis.

בהתאם לכך, המבוסס על השימוש הדינמי של דג הזברה בשתי מחלות ומחקר התפתחותי, מתודולוגיות תיוג תא וכימות אות הם היבט חיוני של נתונים ניתוח. בעוד שיטות שמעסיקות ניאוןtibodies יכול לשמש כדי לזהות ביטוי חלבון בדג זברה מהונדס, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על נהלים סטנדרטיים כמו מאחל 12-16 לבחון את לוקליזציה spatiotemporal של תעתיקי גנים במדגם דג הזברה, שאינו מהונדס קבוע. למעשה, רצון הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר בביולוגיה 16, והוא כלי חיוני המשמש כדי לאפיין את הפנוטיפ של מוטציות גנטיות והפרעות גנטיות כימיות. יחד עם זאת, משאלה קשורה במספר מלכודות ואתגרים פוטנציאליים. כדי לאשר את הספציפיות של ribroprobe antisense, יכולה לשמש riboprobes התחושה כביקורת על מנת להעריך את הספציפיות של דפוסי מכתים riboprobe antisense. בעוד סעיפי 4 ו 5 מוצגים לפי הסדר של תיוג וזיהוי של חללית שכותרת digoxygenin ואחרי בדיקה שכותרתו והעמסת, יכול להיות הפוך צו זה. בדרך כלל, אותות חלשים (גנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר) מזוהים ביותר עם בדיקות שכותרת digoxygenin והכתם הזהפותח לראשונה עם מצע סגול, ואחרי זיהוי וצביעת האות החזק (גן הביע יותר בשפע) באמצעות המצע האדום. עם זאת, אם תגובות בשני צבעים הולכים להתבצע, מומלץ ששילובים שונים של תוויות ומצעים נבדקים כדי למצוא את ההליך כי הוא מתאים ביותר לאיסוף נתונים ולניתוח. בנוסף, הפעמים הניתנות לחסימה, דגירה נוגדן ושטיפה אמורה בסעיפים 4-5 מותאמים לעוברים צעירים מ24 שעות שלאחר הפריה; מרווחים ארוכים של אותם שלבים עם עוברים מבוגרים יכולים לגרום להצטברות מלח על המדגם. טיפים נרחבים לפתרון בעיות מאחלות עובר דג הזברה סטנדרטית כבר תועדו בספרות 12-16. ניתן לטעון את הדילמה הנפוצה ביותר היא רקע גבוה. אנו ממליצים להגדיל את מספר שטיפות MABT ב4.7 ל15-20 שוטף שלב במידת צורך, אם כי, בניסיון שלנו התוספת של 'סופר השטיפה' MABT הלילהנותן תוצאות יוצאות דופן הפועלת בשיתוף עם 10 או יותר שטיפות MABT קצרות לפני שתמשיך לשלב 4.8. דילמת דוגמא נוספת היא חדירת בדיקה עניות, אשר יכול להתרחש עם riboprobes הארוכה. גז riboprobe הבא שלב 3.6 באמצעות הידרוליזה בסיסית יכול לנטרל את זה. מניסיוננו עם דגימות צעירות, לא נדרש גז בדיקה בדרך כלל. עם זאת, יש לזכור כי פרמטרים כמו זה יכול להיות גורמים תורמים בתוצאה של ניסוי משאלה, ואנו מציעים בחינה של ההוראות לפתרון בעיות שימושיות הללו כבר זמינים לציבור בקהילה לפי צורך כדי לשפר את הפרמטרים הניסיוניים למאחלים בעצמך מחקר 12.

בנוסף לטכניקות מאחלים מסורתיות 12-16, חלה צמיחה מתמדת של התקדמות במתודולוגיות רוצים ופרוטוקולים חלופיים שגובשו. אלה כוללים דרכים חדשות לזיהוי אות, כגון באמצעות השימוש בנורותcence 17-19, לשיטות המאפשרות הלוקליזציה של מיקרו RNA 20. אף על פי כן, למרות שיפורים הרבים שנעשו לשיטות תיוג התא הנוכחיות, את האפקטיביות של נהלים אלה שללו אם הכתם (ים) לא ניתן דמיינו בקלות בתוך המדגם של עניין בנקודת זמן רצוי. מגבלה זו היא בעייתית עבור חוקרים במיוחד כאשר הוא נוגע לשלבים העובריים המוקדמים של ontogeny דג הזברה, אשר עלול להוביל לפערים בהבנה של תהליכים התפתחותיים שונים המתעוררים בזמנים אלה שלנו. במהלך פיתוח דג הזברה רגיל, שק החלמון יהיה בהדרגה הירידה בגודל כמו גילאי עובר 11. לכן, בשלבי התפתחותיים המאוחרים יותר אלה (> 24 שעות שלאחר הפריה), מכתים מאחל הוא פשוט למדי כדי לנתח כי העובר הוא גדול יותר בהשוואה לצק החלמון הצמוד שלה. עם זאת, זה לא המקרה מהשלב ניצן הזנב לsomitogenesis מוקדם (כאשר העוברימסה ממוקמת סביב החלמון) שבו שק החלמון האטום לפעמים יכול לטשטש את ההדמיה של הכתם. כתוצאה מכך, השיטה של הרכבה שטוחה תוכננה כדי לעזור להקל על בעיות ההדמיה וניתוח נתונים הקשורים לאפיון של דגימות מוקדם דג הזברה עובר (schematized באיור 1 ואיור 2), וכבר בשימוש רחב מאז phenotyping השיטתי של מוטציות גנטיות מבודדות מהמסכים בקנה מידה הגדולה הראשונים הגנטיים 21.

מאז כניסתו של טכניקת ההרכבה שטוחה, הניתוח של שלבי התפתחות מוקדמים שופר באופן משמעותי. ברגע שהחלמון הוא להסיר את העובר, ניתן להניח שטוח העובר בשקופית זכוכית בכיוון הרצוי להדמיה. עמדה דו ממדים זה מאפשרת צפייה של כל העובר בבת אחת, מה שמבטל את הצורך לסובב את המדגם. רקמות רבות נמצאות בתחומים רחבים של העובר, כגוןסימנים מקדימים היוצרים את הדם והכליות. יתר על כן, אפשר צריך להשוות את מספר רקמות מתפתחות שונות בכל פעם. הרכבה שטוחה מאפשרת לחוקר בו זמנית כדי להציג את התחום כולו של קבוצות תאים כאלה, ולכן יכול מאוד לסייע quantifications כגון מדידת שטח לרקמות או ספירת תאים. טכניקה זו סופו של דבר סייעה להוביל לתגליות רבות הנוגעות למגוון רחב של מנגנוני התפתחות חשובים שבבסיס hematopoiesis, נוירוגנזה, וorganogenesis. לפיכך, שולטים פעם, הבקשות לטכניקה פשוטה זו עבור חוקרים הן משמעותיות למדי.

לדוגמא, במחקר שבחן בחירת שושלת במהלך hematopoiesis, שטוח הר הכנות של עוברי דג הזברה בשלבי 14 ו18 somite (SS) שימש כדי להמחיש את השינויים שחלו בדפוס הביטוי של גורם שעתוק אצבע אבץ pu.1 בין morpholino wild-type ו gata1 הזריק עוברים 22.שיטה זו אפשרה את זיהוי של תחום pu.1 התרחב ב18 ss, המציין כי gata1 סביר להניח שמסדיר את הביטוי של pu.1 במסת תאי ביניים (ICM) סביב נקודה זו בזמן. עוברי דירה נוסף רכובים מוכתמים עבור גנים erythroid שונים כולל gtpbp1 וepsin הוכיחו הפסד בביטוי של גנים אלה במוטנטים VLT שהיו gata1 - / -. ניתוחים נוספים הראו שום שינוי בביטוי של גנים erythoid כמו biklf וtesthymin שהיו ידועים להיות עצמאי של פעילות gata. לכן, בשיתוף עם תוצאות הניסוי האחרות שלהם, נחשף כי gata1 חיוני בויסות ההתמיינות של תאים בתוך שושלת myelo-erythroid. במחקר של פיתוח רכס עצבי, תושבות שטוחות שימשו כדי לבחון ביטוי crestin במון בלאן מוטציות (M610 אספסוף) במחקרבוחן את התפקידים של מון בלאן ותפקוד גן tfap2a 23. ב10 ו20 ss, ביטוי crestin היה מבוטל לחלוטין בראשו וירד באזור תא המטען של מוטציות M610 אספסוף בהשוואה לביטוי הנורמלי wild-type, סופו של דבר מסייע לקבוצה זו להגיע למסקנה על החשיבות של מון בלאן וtfap2a רגולציה במהלך היווצרות רכס עצבית. בנוסף, במונחים של organogenesis, תושבות שטוחות אפשרו גילוי נוכחותם של תחומים שונים בתחום אב הכליות מוקדם במהלך ההתפתחות של הכליה העוברית דג הזברה, המכונה הכליה ראשית. עובר דג הזברה מספק מערכת שימור ובכל זאת מבחינה אנטומית פשוטה ללמוד כיצד אבות כליות להצמיח יחידות תפקודיות נפרון המרכיבות את הכליה ראשית, תהליך המכונה nephrogenesis 6,7 (איור 4). ניתוח הר שטוח כבר שימושי לתחומים מסמך מחדשאבות nal ולנתח את התוצאה של שינויים באיתות RA במהלך הכליה ראשית דפוסי 6,7 (איור 5), שהיה ידוע קודם לכן. יחדיו, דוגמאות אלו מצביעות על כך שיש אכן הרבה יישומים רחבים לכך שטוח הר פרוטוקול במחקר של תהליכים מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות נורמלית ומדינות חולות.

מבחינה מושגית, הליך ההר השטוח הזה הוא פשוט למדי כולל. עם זאת, המניפולציות ומידת העידון הנדרשת כדי לשלוט בשיטה זו יכולות להיות מאתגרות למדי לאדון בהעדר ההפגנה חזותית. לכן, פרוטוקול זה נערך כדי לאפשר לחוקרים, במיוחד אלה חדשים מודל דג הזברה, עם ההזדמנות להבין טוב יותר כיצד לבצע את הטכניקה הזו ולשתף את העצה שלנו על חומרים כימיים שיכול לייעל את הטיפול ברקמות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יהיה סופו של דבר לאפשר לאחרים בקהילה כדי לחדד את תנאי מדגם האידיאלי ביותר להיות uSED הדמיה פרמיה, ניתוח נתונים, ותקשורת של התוצאות שלהם בפרסומים. סופו של דבר, זה אמור לאפשר לחוקרים להתגבר על המכשולים האנטומי של דג הזברה בעובר מוקדם, אשר יכול לטשטש את המצגת של תוצאות ניסוי, ולפתור אותן באמצעות השימוש בטכניקה פשוטה אך משמעותית זו.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון לRAW מכל אחד מאלה: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; במרץ של הפרס להעניק # הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה. היינו במיוחד רוצים להודות לאליזבת ומייקל גלאגר, יחד עם כל משפחת גלאגר, שהנחילה מתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים ותובנות על עבודה זו שלהם, כמוגם ציפורן חתול (Maripooka) וZinnia Wingert למתן באופן טבעי לשפוך שפם של חתולים כדי להפוך את כלי ריסים מעולים ביותר למחקר שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  4. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  5. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  6. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  9. Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
  10. Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  11. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
  13. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
  14. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
  15. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
  16. Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
  17. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
  18. Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
  19. Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
  20. Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
  21. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  22. Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
  23. Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 89 בעלי חיים בעלי חוליות דגים דג הזברה צמיחה והתפתחות המורפוגנזה עוברי והתפתחות העובר organogenesis דיסציפלינות של מדעי טבע עובר הר שלם הר שטוח deyolking הדמיה
הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N.,… More

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter