Summary
O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.
Abstract
O embrião de peixe-zebra agora é comumente usado para a pesquisa básica e biomédica para investigar o controle genético dos processos de desenvolvimento e modelar anomalias congênitas. Durante o primeiro dia de vida, o embrião do peixe-zebra progride através de vários estágios de desenvolvimento, incluindo a fertilização, clivagem, a gastrulação, segmentação, e a organogénese de estruturas, tais como o rim, coração e sistema nervoso central. A anatomia de um jovem embrião de peixe-zebra apresenta vários desafios para a visualização e análise dos tecidos envolvidos em muitos desses eventos porque o embrião se desenvolve em associação com uma massa de gema rodada. Assim, para uma análise precisa e imagem de fenótipos experimentais em amostras embrionárias fixadas entre o tailbud e 20 somite fase (10 e 19 horas após a fertilização (hpf), respectivamente), como as coradas utilizando toda montagem de hibridização in situ (desejo), ele é muitas vezes desejável remover o embrião da gema btodos e para posicioná-la plana sobre uma lâmina de vidro. No entanto, a realização de um procedimento de montagem plana pode ser tedioso. Portanto, bem-sucedido e eficiente plano de montagem de preparação é muito facilitada através da demonstração visual da técnica de dissecação, e também ajudou usando reagentes que auxiliam no tratamento de tecido ideal. Aqui, nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO para a detecção de uma ou duas cores da expressão do gene no embrião de peixe-zebra, e demonstrar como o processo de montagem plana pode ser realizada neste exemplo de um espécime fixos manchadas. Este protocolo de montagem plana é amplamente aplicável ao estudo de muitas estruturas embrionárias que surgem durante o desenvolvimento precoce de peixe-zebra, e pode ser implementada em conjunto com outros métodos de coloração realizados em amostras de embrião fixos.
Introduction
O peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se um organismo largamente utilizado no estudo da biologia do desenvolvimento. Zebrafish estão tropicais, espécies de vertebrados de água doce pertencente à família Cyprinidae. Zebrafish foram originalmente usado para a pesquisa ambiental para obter informações sobre os riscos potenciais de poluentes da água, como eram facilmente obtidos, barato e fácil de manter um. Ao longo dos últimos trinta anos, o peixe-zebra tornou-se reconhecido como um sistema modelo de vertebrados geneticamente tratável por uma série de razões. Zebrafish mostram um alto grau de conservação anatômica e fisiológica com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 2,3. Anotação recente sequência do genoma revelou que aproximadamente 70% dos genes humanos têm, pelo menos, um peixe-zebra contraparte 4. Por exemplo, muitos genes ortólogos que desempenham um papel importante durante o desenvolvimento do rim foram identificados entre estas espécies 5-7. Este dramatic grau de conservação no que diz respeito à biologia celular e molecular tem possibilitado aos pesquisadores para criar modelos para uma ampla gama de doenças humanas no peixe-zebra 8 e zebrafish tornaram-se uma ferramenta valiosa para identificar potenciais terapias medicamentosas usando telas genéticos químicas 9.
Além disso, o modelo de zebrafish não só é capaz de recapitular uma variedade de processos de desenvolvimento complexos e estados de doença que são vistos em humanos, mas vários atributos adicionais também aumentam o seu apelo como um organismo modelo para estudos de embriologia. Zebrafish são ovíparos e se reproduzir através de desova de transmissão, o que fornece aos pesquisadores, com fácil acesso aos embriões desde o início da fertilização 10. Outras vantagens incluem o tamanho do embrião, transparência e desenvolvimento rápido, externo 10. Além disso, o peixe-zebra adultos possuem alta fecundidade e normalmente produzem relativamente grandes tamanhos de embreagem que pode variar entre 200-500por semana, em última análise, permitindo aos pesquisadores a realização de experimentos de alto rendimento, como telas químicas fenótipo base, com facilidade 9.
Mesmo assim, apesar da infinidade de vantagens que são exibidos pelo modelo peixe-zebra, há desafios que dizem respeito à análise e comunicação dos resultados experimentais obtidos a partir de estágios iniciais de desenvolvimento. Em alguns casos, a anatomia inerente do embrião do peixe-zebra pode obscurecer a visualização de um dos dados. Após a fecundação, a célula inicial passa por vários eventos de clivagem como o desenvolvimento progride 11. Seguindo a gastrulação, o eixo embrionário surge na fase tailbud (10 CGA) tal que ele é enrolado à volta da gema 11. Como desenvolvimento posterior avança ao longo do período de segmentação, o tronco vai crescer em massa e também prolongar por alongamento axial de tal modo que uma cauda, juntamente com uma porção do saco vitelino em si estendem para fora a partir do centro de massa de gema11. Entre o tailbud e 20 fase somito (hpf 19), as tentativas para observar características específicas do desenvolvimento, após a utilização de vários protocolos de coloração, como desejar, pode ser um desafio, tanto para visualizar e fotografia, devido à geometria do embrião e opacidade o saco vitelino. Uma maneira de eliminar esses desafios é retirar a gema e depois achatar o embrião para uma amostra de duas dimensões que pode ser analisada de uma forma mais simples.
Os seguintes recursos de protocolo e de vídeo fornecem um guia para saber como deyolk sucesso e plana montar um embrião após fixação e coloração, usando o exemplo de uma ou duas cores DESEJO coloração. Desejo é uma técnica amplamente utilizada que permite a detecção de ácidos nucleicos específicos em amostras conservadas e, portanto, permite que o sítio (s) de expressão do gene a ser detectado nos tecidos. DESEJO técnicas têm sido extensivamente descritas, e pode ser realizada com vários substratos de cores, bem como a gripeOs sistemas de detecção orescent 12-20. Aqui nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO modificado usado para embriões de peixe-zebra entre os tailbud e segmentação estágios de desenvolvimento. Protocolos alternativos DESEJO, no entanto, são compatíveis com o processo de montagem descrito aqui plana, como se referiu no início do protocolo abaixo. Além disso, a montagem plana pode ser utilizado em conjunção com qualquer número de técnicas de visualização existentes, como por exemplo imuno-histoquímica conjunto de montagem, ou etiquetas de rastreamento de linhagem celular, que não são descritos neste protocolo. No geral, a técnica de montagem plana pode permitir uma melhor análise superior e apresentação dos dados obtidos a partir de experimentos com os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário no peixe-zebra.
Protocol
Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use na Universidade de Notre Dame. Nota: Os procedimentos descritos nas Partes 1-5 foram usados para gerar as imagens dos embriões fornecidas aqui nos resultados representativos. Os procedimentos descritos nas Partes 1-5 pode ser substituído como desejado, com procedimentos alternativos DESEJO 12-16 ou outras técnicas de visualização tais como a imunohistoquímica para as proteínas específicas, utilizando anticorpos específicos. Ao realizar montagens planas em embriões de peixe-zebra desejar com o protocolo descrito nas partes 1-5, a fixação do embrião inicial e os passos finais de fixação de coloração são os principais manipulações que afectam a capacidade de remover grânulos de vitelo a partir da amostra para montagem plana. Os melhores resultados de montagem plana são obtidos quando a fixação inicial é realizada com gelo recém-descongeladas frio 4% de paraformaldeído (PFA) / PBS 1X e a fixação dea reação de coloração último desejo com o frio do gelo 4% PFA/1x PBS (que não precisa ser recém-descongelado), e é aconselhável que os leitores a considerar este quando em substituição a métodos de coloração alternativas, em combinação com as partes 6-8.
Coleção 1. Embryo, fixação e armazenamento
- Prepare gaiolas de acasalamento, colocando peixe-zebra macho adulto (s) e fêmea (s) nas câmaras de água do sistema, de modo que eles estão separados por uma divisória durante a noite.
- Retire os divisores entre adultos e recolher os ovos fertilizados utilizando uma malha fina de chá coador de arame dentro de ~ 15-30 min de acasalamento para reunir garras que têm estágios embrionários equivalentes.
- Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar a superfície com um bom fluxo de E3 dispensada de uma garrafa de esguicho para transferir os embriões em placas de incubação contendo cerca de 25 ml de solução de E3.
- Após a coleta das garras, dividi-los em vários pratos de tal forma que cerca de 50-60 embriões são incubadosEm cada placa de 25 ml de solução de E3. Nota: A superlotação de embriões pode levar a assincronia de desenvolvimento dramático dentro deve ser levado a embreagem e os cuidados para evitar isso para permitir recolha atempada do estágio desejado (s).
- Incubar os embriões a 28,5 ° C para permitir a avaliação do desenvolvimento de acordo com a série de teste padrão de 11 peixes-zebra.
- Usar uma pipeta de transferência de plástico para colocar suavemente o número desejado de embriões no ponto de tempo seleccionado, até à fase de 20 somito (hpf 19), para um tubo de microcentrífuga de fundo plano. Nota: Tome cuidado na manipulação de embriões jovens, pois eles são frágeis e podem ser facilmente danificados por esmagamento ou manuseio agressivo com pipetas de transferência. Alternativamente, os frascos de vidro pode ser utilizado para a fixação e processamento de embriões. Para todas as lavagens de protocolo subsequentes pipetas de transferência de plástico pode ser utilizado, com a excepção da adição e remoção ribossonda (Passos 3.11, 3.14).
- Substitua a E3 com o frio do gelo 4% PFA/1x PBS, efixar os embriões nos seus córions em 4% PFA/1x PBS durante 4 h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. Nota de advertência: PFA é tóxico e soluções PFA deve ser tratado em um capuz químico enquanto usava equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas e um casaco de laboratório. Além disso, a PFA em pó devem ser manuseados com cuidado excepcional ao fazer a solução estoque, como até mesmo a PFA granulado pode tendem a se dispersar através de carga estática. Tipicamente PFA é preparado por aquecimento do 1x PBS a ferver para dissolver o pó PFA, e em seguida, a solução é armazenada em alíquotas a -20 ° C. Se os sedimentos finos estão presentes na 4% PFA/1x PBS uma vez que a solução é arrefecida, filtro esterilizar a solução foi arrefecida antes de congelar para armazenamento de alíquotas por passagem através de um sistema de filtro de 0,45 um. Só recentemente preparada de fresco ou descongelado PFA é utilizado para este (ou seja primário) fixação inicial do embrião.
- Remova a correção e lavar os embriões duas vezes com PBST 1x, em seguida, transferir paraum prato de incubação.
- Ver os embriões sob microscópio estereoscópico e usar dois pares de uma pinça fina para remover as córions cercam os embriões, de tal forma que um par é usado para alavancar delicadamente o embrião, enquanto o segundo par é usado para rasgar o córion.
2. Permeablization Embryo
- Transferir os embriões dechorionated volta para o tubo de microcentrífuga de vidro ou frasco, em seguida, lavar duas vezes com PBST 1x para remover qualquer sujeira restante córion.
- Remover o 1x PBST e lavar os embriões, duas vezes com 100% de metanol (MeOH).
- Colocar os embriões a -20 ° C durante pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem ser armazenadas a -20 ° C em MeOH durante um ano ou mais. O metanol faz com que os córions pegajoso, por conseguinte, não continuar para esta etapa, a menos que os córions ter sido removido.
- Re-hidratar os embriões, removendo o MeOH 100% e lavá-las à temperatura ambiente durante 5 min cada em 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST e duas vezes com 1x de PBST. </ Li>
- Preparar uma solução de trabalho de proteinase K fresca (5 ug / ml) por adição de 25 ul de estoque de proteinase K recentemente descongelado (10 mg / ml) a 50 ml de 1x PBST.
- Retire a 1x PBST dos embriões, em seguida, substitua com a proteinase K solução de trabalho e incubar com base no estágio embrionário: <= 5 somites por 1 min; 10-12 somitos para 1,5 min; 15 sómitos durante 2 min, e 20 durante 3 min somitos.
- Remover a solução de trabalho de proteinase K e lavar os embriões, duas vezes com 1x de PBST.
- Remover o 1x PBST e substituir com gelo frio 4% PFA/1x PBS durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente.
3. Riboprobe síntese, pré-hibridização, hibridização e Remoção Probe
- Montar o ribossonda in vitro da reacção de transcrição anti-sentido, à temperatura ambiente num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, ao mesmo tempo mantendo as enzimas em gelo, por combinação de um molde de ADN contendo a sequência correspondente ao gene de interesse (ou 100-200 ng de PCRproduto ou 1,5 ug de DNA do plasmídeo linearizado, preparado como descrito 12,13), 2 ul de digoxigenina ou fluoresceína ribonucleótidos marcados, 2 ul de RNA-polimerase apropriada (SP6, T3, T7, dependendo de qual é incorporado na sequência do produto de PCR ou presente no plasmídeo de DNA), 2 ul de tampão de transcrição 10x, 0,5 ul de inibidor de RNase, e levar a um volume total de 20 ul com água destilada de grau molecular (DNase, RNase livre). Nota: O tampão de transcrição 10x deve ser pré-aquecido, colocando o tubo em banho-maria a 37 ° C durante 10-20 min, e depois agitadas para assegurar que todos os componentes estejam em solução. Se flocos brancos estão presentes, incubar o tubo para outro 5-10 min e vórtice novamente. Reações de transcrição pode falhar ou ter rendimentos pobres, se o tampão de transcrição não é totalmente dissolvida e bem misturados.
- Misturar os componentes e incubar cada reacção a 37 ° C durante 2 horas em banho-maria.
- Retirar da reacção tuter (s) a partir do banho de água, e destruir a matriz de ADN em cada amostra por adição de 5 ul de tampão 10x ADNase I, 2 ul da enzima DNase I, e 23 ul de água destilada, de grau molecular para levar o volume total de 50 ul, e, em seguida, cada tubo de incubação a 37 ° C durante 20 minutos num banho-maria.
- Realizar uma precipitação com etanol em cada tubo de microcentrífuga, adicionando 5 mL de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 110 ul de etanol arrefecido em gelo a 100%, seguido de 1 ml de estoque de glicogénio para facilitar a visualização sedimento de ARN em passos subsequentes, e depois incubar a tubo à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 1 hora ou durante a noite.
- Centrifugar cada tubo de microcentrifugação à velocidade máxima de 4 ° C durante 20 min, em seguida, remover o sobrenadante de etanol a 100% e substituir com 100 ul de 70% de gelo de etanol frio.
- Centrifugar cada tubo de microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min, em seguida, remover o sobrenadante de etanol a 70% e ar seco o sedimento durante 5 minutos e, em seguida, finalmente, adicionar 100 mL de mograu lecular água destilada para ressuspender o sedimento e quantificar a concentração estoque riboprobe usando um espectrofotômetro NanoDrop. Observação: Uma vez que o sedimento passou para a solução, o estoque ribossonda devem ser mantidos em gelo e armazenada a -20 ° C.
- Para preparar os embriões fixados para o processo de pré-hibridação, remover a 4% PFA/1x PBS a partir de cada amostra e lavar os embriões, duas vezes com 1x de PBST.
- Transferência entre 25-40 embriões em 1x PBST em cada tubo de microcentrífuga de fundo plano único. Nota: A superlotação dos embriões vai levar a coloração desigual mais tarde, e deve ser tomado cuidado para limitar o tamanho da amostra em cada tubo de cerca de 40 embriões.
- Substitua o 1x PBST em cada tubo com 500-1.000 mL de HYB +.
- Colocar o tubo (s) de embriões em uma estufa a 70 ° C, e incubar a esta temperatura durante 4 horas para se realizar a pré-hibridação.
- Prepare a ribossonda / HIB + solução pela adição de 100-500 ng de ribossonda (digoxigenina e / ou fluoresein-marcados) para 500 mL de fresco HIB + e depois incubar a solução a 70 ° C durante pelo menos 20 min antes do Passo 3,11 para pré-aquecimento que. Nota: Para detectar vários transcritos do gene, utilizando rotulagem colorimétrico simples e / ou dupla, cada um dos ribosondas correspondentes a estes genes precisam ser combinados em um riboprobe / HIB + cocktail.
- Retire o HYB préhibridação + de cada tubo de embriões e substituir com suficiente riboprobe / HIB + para cobrir os embriões. Nota: Normalmente, é necessário para cobrir os embriões em um tubo de microcentrífuga de fundo plano 200-250 mL de riboprobe / HIB +. Riboprobe / HIB + adição e remoção é normalmente realizada com uma pipeta e de barreira dicas para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.
- Incubar os embriões a 70 ° C durante a noite com ribroprobe / HIB +.
- Prepare o seguinte conjunto de soluções de lavagem e pré-aquecê-los durante a noite a 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT e 0.2x SSCT. Nota: É conveniente para preparar 50 ml aiiquots de lavar cada solução, porque o excesso pode ser armazenado à temperatura ambiente e, subsequentemente, reaquecido para uso futuro.
- Retire o riboprobe / HIB + utilizando uma pipeta e de barreira dicas e armazenar a -20 ° C. Nota: Tipicamente cada ribossonda / HIB + mistura pode ser usada várias vezes (por exemplo, 3 ou mais), sem diminuição de sinal. Enquanto reutilizado riboprobe / HIB + está associada com menor fundo, no entanto, ter em mente que reutilizado misturas riboprobe pode estar sujeito a degradação.
- Lavar os embriões por duas vezes com 50% SSCT formamide/2x durante 30 min a 70 ° C.
- Lavar uma vez com os embriões SSCT 2x durante 15 min a 70 ° C.
- Lavar os embriões duas vezes com 0,2 x SSCT durante 30 min a 70 ° C.
- Remover o SSCT 0.2x e lavar os embriões, duas vezes com MABT à temperatura ambiente.
4. Anti-digoxigenina Incubação de anticorpos e Detecção
- Preparar a solução de bloco fresco.
- Retire o MABT e substituir com bloco soluçãoção.
- Incubar os embriões em solução de bloqueio durante 2-4 horas à temperatura ambiente. Nota: incubações bloco maior proporcionar os melhores resultados com os jovens embriões estágios peixe-zebra (<15 somitos). Para fazer o procedimento de bloqueio de longa, executar o bloco de incubação de 8-12 horas à temperatura ambiente ou a uma combinação de temperatura ambiente de mais (até ~ 8 horas) de uma posterior 4 ° C de incubação durante a noite.
- Preparar a solução de anticorpo anti-digoxigenina, fazendo uma diluição de 5000 vezes em solução fresca de bloco (por exemplo, 1 ml por cada 5 ml de bloco).
- Retire o bloco e adicionar a solução de anticorpo / bloco.
- Cobrir a amostra em folha e incubar durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente.
- Remover o anti-digoxygenin/block e lavar os embriões, pelo menos, 10 vezes com MABT. Nota: Transferir os embriões para pratos de 12 poços para as lavagens MABT. Isto aumenta a velocidade a que os embriões podem ser lavadas, o que é útil quando se processam grandes quantidades de amostra, umaª facilita para monitorar o progresso da reação de coloração (Step 4.11) sob um microscópio estereoscópico. Nota: Neste passo embriões podem ser "super-lavado ', incubando-as durante a noite em MABT a 4 ° C, antes de prosseguir para a etapa 4.8, que é um tratamento útil para sondas, que tendem a dar alta fundo ou manchas que requerem longos monitorização durante o trabalhar dia.
- Prepare o buffer de pré-coloração e a solução de coloração desejada (substrato roxo ou vermelho).
- Remover o MABT e lavar os embriões em tampão de pré-coloração durante 5 min à temperatura ambiente.
- Retire o buffer de pré-coloração e adicionar a solução de coloração.
- Monitorizar o progresso da reacção de coloração temperatura ambiente a cada 15-30 minutos, verificando o aparecimento dos embriões sob um microscópio estereoscópico. Nota: A taxa da reacção de coloração pode ser retardado através da transferência das amostras a 4 ° C, se for necessário para dar mais tempo para a realização da mancha. Uma vez arrefecida a 4° C, no entanto, a reacção não pode ser acelerada por aquecimento até à temperatura ambiente.
- Quando a reação de coloração estiver concluída, remova a solução de coloração e substituir por 1x PBST.
- Lavar duas vezes com 1x de PBST, durante 5 min. Nota: Se não detectar outros genes com outro substrato, em seguida, corrigir as amostras em gelo frio de 4% PFA/1x PBS por pelo menos 20 min, e vá para o passo 6.1. Caso contrário, vá para o passo 5.1.
5. Anti-fluoresceína Incubação de anticorpos e Detecção
- Remover o 1x PBST e lavar os embriões, duas vezes com 0,1 M de glicina, pH 2,2, durante 15 minutos cada, à temperatura ambiente. Nota: O tempo para as lavagens de glicina é essencial para desactivar completamente a primeira reacção de coloração.
- Retirar a 0,1 M de glicina e lavar os embriões, duas vezes com MABT durante 5 min à temperatura ambiente.
- Preparar a solução de anticorpo anti-fluoresceína fazendo uma diluição de 5000 vezes em solução fresca de bloco (por exemplo, 1 ml por cada 5 ml de bloco).
- Retire o MABT e adicionar a solução de anticorpos / bloco. Seguir os passos 4,6-4,13 para realizar a detecção do ribroprobe marcado com fluoresceína. Nota: Quando o final da reacção de coloração é completada, é essencial que a última fixação da amostra, é feito em gelo frio 4% PFA/1X PBS. A fixação com soluções quentes PFA tende a ser associada com gema pegajoso que é difícil de remover do embrião durante a dissecção e deyolking para o procedimento de montagem plana.
6. Dissection Embryo e Deyolking inicial do embrião
- Selecione, um embrião manchado fixo para montagem plana.
- Use uma pipeta de transferência para colocar a amostra embrião selecionado em um plástico ou de vidro placa de Petri contendo 1x PBST.
- Coloque o prato sob um microscópio estereoscópico, e role o embrião usando um par de pinças finas ou ferramenta chicote para que a vista lateral é obtida e a cabeça ea cauda extremidades são visualizados.
- Use um par de fórceps finos para fazer uma incisão em poe de gema numa posição localizada centralmente entre a cabeça e a cauda do embrião, e, entretanto, utilizar um segundo par de uma pinça fina para segurar o embrião de forma a proporcionar força de alavanca para a incisão da gema. Nota: Como alternativa, fazer duas grandes incisões na gema, um perto da cabeça eo outro perto da cauda do embrião.
- Use uma pinça fina e / ou uma ferramenta de chicote para colher a gema da cavidade celular gema.
- Lave suavemente com o embrião 1x PBST para remover gema perdida.
7. Belas Deyolking do Embrião
- Transferência do embrião para uma lâmina de vidro plano com 1-2 gotas de 1x PBST.
- Use uma ferramenta de chicote e uma pinça fina para posicionar suavemente o embrião com o (gema) lado ventral para cima sobre a lâmina de vidro.
- Arrastar o embrião para a borda da solução 1x PBST usando a ferramenta de chicote, de modo que o embrião permanece em posição plana contra a lâmina de vidro.
- Raspe a superfície ventral do embrião suavemente usando o chicote paraol, a fim de remover os grânulos de vitelo sem rasgar o embrião. Simultaneamente utilizar uma pinça fina para ancorar o embrião enquanto raspagem com a ferramenta de chicote. Nota: A remoção dos grânulos de vitelo pode exigir raspagem repetitivo para 5-10 min.
- Se a solução PBST torna-se confuso com o excesso de gema ou começa a evaporar, adicione 1-2 gotas frescas de 1x PBST para o slide usando um plástico ou vidro transferência pipeta, e, em seguida, arraste o embrião para a área com a solução limpa para mais de grânulos da gema remoção.
- Quando a gema foi satisfatoriamente removido, utilizar uma pipeta de transferência para mover suavemente o embrião de volta para um plástico ou de vidro de Petri contendo 1x PBST para uma lavagem final, a fim de remover grânulos de vitelo vadios.
- Transferir o embrião deyolked usando uma pipeta de transferência de plástico ou de vidro em um plástico ou de vidro de Petri contendo 100% de glicerol.
- Incubar o embrião em 100% de glicerol durante ~ 5 minutos para se aclimatarem ao embrião.
8. Montagem sobre uma lâmina de vidro
- Transferir o embrião deyolked a uma lâmina de vidro limpa em 1-2 gotas de 100% de glicerol.
- Posicione o embrião com o (gema) lado ventral de frente para a lâmina de vidro.
- Utilizando uma ferramenta de chicote, arraste o embrião para a borda da gota de glicerol a fim de que o embrião permanece em posição plana contra a lâmina de vidro. Se o eixo embrionário é curvo, utilizar a pinça fina para fazer suavemente muito pequenas incisões na membrana celular gema restante para aliviar a tensão para que o embrião pode ser posicionada plana sobre a lâmina com um eixo recto.
- Coloque pequenos torrões de massa de modelar sobre os quatro cantos de um 18 x 18 mm lamela de vidro. Observação: Como alternativa, as pequenas gotas de gordura de vácuo 15 pode ser substituído por massa de modelar.
- Coloque a lamela de vidro lentamente no embrião, dobrar a lamela de modo a minimizar a geração de bolhas de ar no glicerol em torno da amostra.
- Adicionar uma queda adicional de 100% de glicerolpara o lado da lamela de vidro para preencher o espaço entre as lamelas e a lâmina de vidro.
- Pressionar para baixo, lentamente e com cuidado sobre os quatro cantos da lamela para posicionar firmemente o embrião entre o vidro e eliminar deriva. Nota: Tenha cuidado para não esmagar o embrião.
- Se o embrião não está posicionado como se desejar, utilizar uma pinça fina para remover a lamela. Utilizar a ferramenta lash para reposicionar o embrião e / ou uma pinça fina para fazer incisões adicionais para que o embrião pode ser reposicionada. Repita os passos de 8,4-8,7.
- Observe e / ou imagem a amostra usando ou um microscópio estéreo ou composto.
- Guarde o plano de preparação plano com um suporte de slides papelão no escuro a 4 ° C durante várias semanas ou temporariamente à temperatura ambiente de montagem. Nota: A mancha vai desaparecer progressivamente DESEJO ao longo do tempo, as reações do substrato especialmente vermelhas, e não pode ser preservada em glicerol indefinidamente. Manchas roxas também desaparecer mais rapidamente se mantido em glicerol em comparação comPFA (veja o passo 8.11). Curiosamente, tem sido publicado que os embriões de montagem em Permount em vez de glicerol pode permitir o armazenamento indefinido à temperatura ambiente 15.
- Para armazenamento a longo prazo de substrato roxo amostras coradas, remover a lamela de vidro e lavar o embrião lavadas duas vezes em 1x PBST, em seguida, transferir para um tubo de microcentrífuga com 4% PFA/1x PBS durante o armazenamento a longo prazo. Nota: Alternativamente, os embriões em 1x PBST pode ser processada para análises adicionais, tais como isolamento de DNA para genotipagem.
Representative Results
O procedimento de montagem plana protocolo envolve a transformação do embrião do peixe-zebra a partir de sua anatomia normal, em que o eixo do corpo é enrolado em torno de uma esfera de gema localizado centralmente, numa bidimensional preparação (Figura 1A). Toda a montagem de imagem do jovem embrião do peixe-zebra é limitada pela natureza da forma como o eixo embrionário é enrolado à volta da gema. Como resultado, vistas laterais ou dorsais de montar todo espécimes embriões corados apenas podem captar uma porção do eixo ou tecidos particulares obscuros (Figura 1B). Por comparação, deyolking e achatamento do embrião permite que todo o eixo embrionário deve ser visualizados de uma só vez (Figura 1B). Estas limitações são demonstradas por análise de um embrião DESEJOS corado que foi marcado com ribossondas anti-sentido para detectar irx3b (roxo), o que constitui um subconjunto das células progenitoras renais localizados adjacentes aos somitos 7 a 13, e myod1 (vermelho) que rotula osomitos (Figura 1B). O campo de irx3b + renais progenitores é obscurecida no conjunto de montagem lateral, vista por transcritos irx3b são abundantes no sistema nervoso central, fazendo com que o campo renal praticamente impossível visualizar com o ângulo da câmara lateral; além disso, o campo de irx3b + progenitoras renais é apenas parcialmente visível, quando o embrião está rodado para uma câmara de vista dorsal porque o campo é enrolado à volta da gema (Figura 1B). No entanto, uma vista dorsal do mesmo embrião seguinte montagem plana permite que a totalidade do campo de irx3b + progenitoras renais ser analisadas de uma forma simples, em relação aos somitos ao longo do tronco e outras estruturas embrionárias (Figura 1B). Assim, os domínios espaciais elaboradas podem ser idealmente documentado com este método.
Vários grandes passos estão envolvidos na execução bem-sucedida do processo de montagem plana. Para executar esta technique, a gema de bola deve ser destacada do primeiro embrião propriamente dito (figura 2A), o que pode ser feito com instrumentos finos, tais como um par de fórceps finos enquanto o embrião é visualizada usando um estereomicroscópio. Após a remoção do produto em bruto da bola gema, uma ferramenta de chicote fino é utilizado para raspar grânulos de vitelo que permaneceram ligados ao embrião (figura 2B). A remoção dos grânulos de vitelo restantes ajuda a facilitar a visualização dos tecidos embrionários. Finalmente, o embrião deyolked é manipulada para posicionar de forma estável sobre uma lâmina de vidro (Figura 2C), que permite a observação e auxiliares de documentação da amostra, utilizando o software de imagem e uma câmara ligada a um microscópio. As ferramentas do chicote são dispositivos caseiros que podem ser construídos através da aposição de um chicote adequado para uma ponteira usando supercola, que podem ser montados em uma alça, se desejar (Figura 3A, mesa Materiais). Amostras chicote diferentes podem ser adquiridos para produzirchicotear ferramentas com características ligeiramente diferentes em termos de comprimento e conicidade (Figura 3B), o que cada usuário pode ter diferentes predileções para uma vez que eles começam a experimentar com o processo de montagem plana. Exemplos de amostras chicote incluem naturalmente derramou cílios humanos, naturalmente, galpão cabelo duro animal ou bigodes, e, finalmente, de variedades sintéticas de cílios disponíveis comercialmente encontrado em departamentos de cosméticos de varejo.
A área local circundante e que contém a amostra (s) posicionada sobre uma lâmina de vidro (Figura 4A) pode ser convertido em imagem para análise de alta resolução. Uma combinação de sondas foram usadas para rotular os progenitores renal em desenvolvimento que dão origem ao rim no embrião do tipo selvagem em estágios precoces de desenvolvimento com duas cores desejadas e, em seguida, fixa montagem preparações foram realizadas para ver as amostras (Figura 4B, 4C ). Durante os estágios iniciais somito, progenitores renais são demarcados em um padrão em forma de U por diaeir expressão de transcritos (roxos) pax2a cercam a mesoderme paraxial que expressa concomitantemente delta C (dlc) (vermelho) (coluna da esquerda, a Figura 4B) 6,7. Em comparação, quando foram detectados transcritos de DLC com um substrato de púrpura, e foram marcadas em combinação com o marcador krox20 rombencéfalo (vermelha), um subdomínio rostral dos progenitores renais foi visualizado que expressa dlc (coluna da direita, a Figura 4B), como observado anteriormente 6,7. Montagem preparações planas pode ser utilizado de forma semelhante para estudar as fases somitogenesis posteriores. Na fase de somito 14, foi analisada a expressão de marcadores renais pax2a, slc4a4, e slc12a3 (roxo), juntamente com smyhc1 (vermelho), que marca as somitos (Figura 4C). Estas combinações de permitir o mapeamento do domínio inteiro progenitoras renais com pax2a, enquanto revelando que um subconjunto de células numa expr subdomínio rostralEssed slc4a4a e foram distinguidos por um subdomínio caudal não sobreposição de progenitores renais que expressavam slc12a3.
DESEJOS duas cores e a preparação de montagem plana também são valiosas para o estudo de domínios celulares durante a organogénese em peixes-zebra com mutações genéticas ou de outras perturbações da exposição ambiental a pequenas moléculas de 6,7 (Figura 5). Os NLS e mutantes de peixe-zebra lib abrigar mutações em aldeído desidrogenase 1a2 (ALDH1A2, anteriormente conhecido como RALDH2), que codifica uma enzima necessária para a biossíntese do ácido retinóico (RA). RA é essencial para o desenvolvimento correcto de muitos tipos de células renais, incluindo a formação de células podocyte que contribuem para tornar o filtro de sangue do rim embrionário, conhecido como o glomérulo 6,7. DESEJO foi realizada para identificar os progenitores podocyte com wt1a concomitantemente com demarcação de tele desenvolvimento somitos com smyhc1 e rombencéfalo com krox20 em embriões de tipo selvagem, mutantes nls embriões, os embriões mutantes lib e os embriões tratados com um inibidor químico de enzima ALDH, DEAB (Figura 5). Os embriões com expressão deficiente ALDH1A2 mostrou reduzida expressão wt1a comparado com embriões de tipo selvagem, enquanto que os embriões tratados com DEAB mostrou uma revogação dos transcritos wt1a (Figura 5, coluna da direita). Tomados em conjunto, estes resultados representativos demonstrar como a técnica de montagem plana pode ser usada para analisar e documentar as diferenças anatômicas com precisão no embrião precoce, e, assim, ser implementadas para estudos de desenvolvimento valiosos.
Figura 1. Visão geral da montagem preparação planaração para os embriões de peixe-zebra. A) O procedimento de montagem plana permite a visualização simultânea de tecidos ao longo do eixo embrionário, pois a massa de gema central é removido eo embrião estavelmente posicionado sobre uma superfície plana. B) As imagens de toda uma montagem DESEJA embrião manchado em vista lateral e dorsal, e depois de uma preparação plana montagem foi realizada. O embrião foi corado com sondas antisense para detectar transcritos do gene que codifica irx3b (roxo) e myod1 (vermelho).
Figura 2. Esquemática do procedimento plana de montagem para embriões de peixe-zebra. A) O embrião é primeiro grosseiramente deyolked para remover a maior parte da massa de gema, em seguida, (B), a superfície ventral é finamente deyolked para remover restantes grânulos de vitelo, edepois de lavar o embrião é (C) montados lado dorsal em uma lâmina de vidro para análise visual e / ou imagem fotográfica.
Figura 3. Fotografias de exemplo, ferramentas de chicote em comparação com uma pinça fina. A) ferramentas chicote caseiros foram fotografadas ao lado de um par normal de uma pinça fina, posicionado ao lado de uma régua métrica para fornecer uma referência. B) vista ampliada de ferramentas chicote ao lado dos pinça fina, com a referência milímetro fornecido ao longo da parte superior da visualização . Duas ferramentas chicote diferentes são mostrados, com o asterisco (*) usado para marcar o chicote obtido a partir de um galpão de cílios naturalmente humana, e dois asteriscos (**) usado para marcar um chicote que foi obtido a partir de um bigode naturalmente derramou felina e aparado para fazer um final um tanto brusco. Em cada casi só, o chicote foi enfiada através da ponta da pipeta e afixada com várias camadas de supercola para criar progressivamente um forte selo para estabilizar / ancorar o chicote para a pipeta ligado a um dispositivo de manipulação.
Figura 4. Caracterização das mudanças de desenvolvimento no campo progenitora renal no embrião do peixe-zebra de tipo selvagem. A) Deslize esquemático indicando a zona trabalhada para análise em (B, C). B) embriões de tipo selvagem nas posições 1, 3, 5 e fase somito foram coradas com duas cores por pretendam avaliar a composição do campo progenitora renal que dá subir para o rim embrionário, ou pronefros. (Coluna da esquerda) Transcrições que codificam o fator de transcrição pax2a (coradas em roxo) marcam várias populações no embrião, incluindo o p renalcampo rogenitor que emerge a partir da mesoderme intermediária. Transcrições que codificam o ligante dlc Notch marcar somitos que se formam a partir da mesoderme paraxial (coradas em vermelho). (Coluna da direita) Quando a expressão de transcritos de DLC (coradas de púrpura) e a parte posterior do cérebro rhombomere marcador krox20 (manchado de vermelho) são examinados nos mesmos embriões, dlc expressão pode ser observada em um subdomínio rostral dos progenitores renais localizados adjacentes aos somitos 1-5, que foi obscurecido durante a co-coloração de DLC com pax2a. C) de embriões de tipo selvagem, na fase 14 somito foram duplo ou triplo-corados com uma combinação de um marcador renal (roxo), o marcador smyhc1 somito (vermelho) , e a parte posterior do cérebro rhombomere marcador krox20 (também vermelho). (Painel superior) Nesta fase, as transcrições pax2a continuar a demarcar os progenitores renais. (Média, painéis inferiores) No território progenitor renal, um subdomínio rostral é marcadopor slc4a4 e transcritos que codificam slc12a3 marcar um subdomínio caudal.
Figura 5. A utilização de preparações montadas planas para caracterizar os fenótipos causadas por mutações genéticas ou perturbações genéticas químicos que modulam a biossíntese do ácido retinóico. DESEJOS O padrão de expressão, na fase de 15 somito wt1a (roxo) e smyhc1/krox20 (vermelho) foi comparada entre os tipos selvagens e embriões com deficiências na produção de ácido retinóico (AR) devido a defeitos de aldeído desidrogenase 1a2 (NLS e mutações lib) ou inibição química da retinaldehyde atividade desidrogenase com dietilaminobenzaldeído (DEAB). A redução da produção de AR em lib é ligeiramente mais intensa do que o NLS, taisque os embriões lib expressar coloração ligeiramente reduzida de transcrições wt1a que semelhante encenado nls embriões mutantes, enquanto o tratamento DEAB de tipos selvagens está associada a revogação completa da expressão wt1a.
Discussion
Zebrafish têm provado ser um organismo modelo extremamente valioso em toda a comunidade de pesquisa nos últimos anos. Zebrafish apresentam um elevado grau de conservação genética com a dos vertebrados superiores e vantagens pertinentes à sua anatomia, reprodução e ciclo de vida desta espécie fazem muito passíveis de análises experimentais. Além disso, o avanço das técnicas moleculares aplicáveis para o peixe-zebra promoveu ainda a utilização deste organismo modelo na pesquisa científica. Por exemplo, uma grande variedade de linhas de zebrafish transgênicos foram gerados para estudar a progressão da doença e para responder a muitas questões fundamentais que estão por trás dos mecanismos-chave do desenvolvimento, incluindo a organogênese.
Por conseguinte, com base na utilização dinâmica de peixe-zebra em ambas as doenças e de desenvolvimento da pesquisa, as metodologias de marcação de células e quantificação do sinal é um aspecto importante da análise dos dados. Enquanto os métodos que empregam uma fluorescentetibodies pode ser usado para detectar a expressão da proteína em peixes-zebra transgénicos, os investigadores geralmente dependem de procedimentos padrão como DESEJOS 12-16 para examinar a localização espaço-temporal dos transcritos do gene em uma amostra de peixe-zebra não transgénico fixo. Na verdade, o desejo é uma das técnicas mais utilizadas em biologia 16, e é uma ferramenta vital para caracterizar o fenótipo de mutações genéticas e perturbações genéticas químicos. No entanto, o desejo é associado com um número de potenciais armadilhas e desafios. Para confirmar a especificidade do anti-sentido ribroprobe, ribossondas de sentido pode ser utilizado como um controlo para avaliar a especificidade dos padrões de coloração ribossonda anti-sentido. Enquanto secções 4 e 5 são apresentados na ordem de rotulagem e a detecção de uma sonda marcada com digoxigenina seguido de sonda marcada com f luoresceina, esta ordem pode ser invertida. Tipicamente, os sinais mais fracos (genes com níveis de expressão inferiores) são melhor detectadas com sondas marcadas com digoxigenina e esta manchadesenvolvido pela primeira vez com um substrato roxo, seguido de detecção e coloração do sinal mais forte (mais gene abundantemente expresso), utilizando o substrato vermelho. No entanto, no caso de reacções de duas cores vai ser realizada, recomenda-se que várias combinações de rótulos e substratos são testados para encontrar o procedimento que é mais adequado para a recolha de dados e análise. Além disso, os tempos previstos de bloqueio, incubação do anticorpo e lavagem fornecidas nas seções 4-5 são adaptados para os embriões com menos de 24 horas após a fertilização; longos intervalos de estes mesmos passos com embriões mais velhos pode levar ao acúmulo de sal na amostra. Extensas dicas para solução de problemas DESEJO embrião de peixe-zebra padrão já foram documentados na literatura 12-16. Provavelmente o dilema mais comum é a alta fundo. Recomendamos o aumento do número de lavagens MABT no passo 4,7 para 15-20 lavagens, se necessário, no entanto, em nossa experiência, a adição do MABT overnight 'super-lavagem'dá excelentes resultados quando utilizado em conjunto com 10 ou mais lavagens MABT curtos, antes de prosseguir para a etapa 4.8. Outro exemplo dilema é pobre infiltração da sonda, que pode ocorrer com longas ribosondas. Shearing o riboprobe seguinte Passo 3.6 através da hidrólise alcalina pode contrariar esta situação. Em nossa experiência com amostras pequenas, corte sonda não é normalmente necessária. No entanto, deve-se ter em mente que os parâmetros como isso pode ser factores que contribuem para o resultado de um experimento de desejo, e sugerimos exame destas instruções de solução de problemas úteis já disponíveis ao público na Comunidade, conforme necessário para refinar os parâmetros experimentais para DESEJO em seu próprio pesquisa 12.
Em adição às técnicas tradicionais DESEJO 12-16, tem havido um surgimento contínuo de avanços nas metodologias de desejo e protocolos alternativos que têm sido formuladas. Estes incluem novos modos de detecção de sinal, tais como através da utilização de fluorescênciacência 17-19, de métodos que permitem a localização de microRNAs 20. Mesmo assim, apesar das muitas melhorias que foram feitas aos métodos de rotulagem celular atuais, a eficácia desses procedimentos são negados se a mancha (s) não pode ser facilmente visualizado dentro da amostra de interesse em um ponto de tempo desejado. Essa limitação é problemático para os investigadores, especialmente quando se refere aos estágios embrionários iniciais da ontogenia peixe-zebra, o que poderia levar a lacunas em nossa compreensão de vários processos de desenvolvimento que surgem nestes momentos. Durante o desenvolvimento normal de peixe-zebra, o saco vitelino diminui progressivamente em tamanho com a idade do embrião 11. Portanto, nestas fases posteriores de desenvolvimento (> 24 horas após a fertilização), coloração desejo é bastante simples de analisar, porque o embrião é maior em comparação com o seu vizinho saco vitelino. No entanto, este não é o caso de a fase de botão de cauda somitogénese precoce (quando o embriãomassa está posicionada à volta da gema), onde o saco vitelino opaco pode, por vezes, obscurecer a visualização da mancha. Por conseguinte, o método de montagem plana foi concebido para ajudar a aliviar os problemas de imagem e análise de dados associados com a caracterização de amostras de embriões de peixes-zebra precoces (esquematizados na Figura 1 e Figura 2), e tem sido amplamente utilizada desde a fenotipagem sistemática de mutações genéticas isoladas a partir das primeiras telas genéticos grande escala 21.
Desde o advento das técnicas de montagem plana, a análise das fases iniciais de desenvolvimento foi significativamente melhorada. Uma vez que a gema é removido do embrião, é possível estabelecer o plano de embriões em uma lâmina de vidro com a orientação desejada para a imagiologia. Esta posição bidimensional permite a visualização de todo o embrião de uma só vez, o que elimina a necessidade de rodar a amostra. Vários tecidos estão localizados em amplos domínios de embrião, tais como oos precursores que formam o sangue e rim. Além disso, pode-se precisar de comparar vários tecidos em desenvolvimento diferentes ao mesmo tempo. Montagem plana permite ao pesquisador visualizar simultaneamente todo o domínio de tais grupos de células, e, portanto, pode ajudar muito quantificações como uma medição da área de um tecido ou de células conta. Esta técnica tem, em última análise ajudou a levar a muitas descobertas a respeito de uma variedade de mecanismos de desenvolvimento importantes subjacentes hematopoiese, neurogênese e organogénese. Assim, uma vez dominado, as aplicações para esta técnica simples para os pesquisadores são bastante consideráveis.
Por exemplo, em um estudo sobre a escolha linhagem durante hematopoiese, montagem plana preparações de embriões de peixes-zebra nas fases somito (SS) 14 e 18 foram utilizados para ilustrar as mudanças que ocorreram no padrão do fator de transcrição dedo PU.1 zinco entre a expressão de tipo selvagem e GATA1 morfolino embriões injectados 22.Este método permitiu a detecção de um domínio PU.1 expandida em 18 ss, indicando que GATA1 é mais provável que regula a expressão de PU.1 na massa celular intermediária (ICM) em torno deste ponto de tempo. Embriões plana adicionais montados coradas para diferentes genes eritróides incluindo gtpbp1 e epsin demonstraram uma perda na expressão destes genes mutantes que eram vlt GATA1 - / -. Outras análises mostraram qualquer alteração na expressão de genes, como erythoid biklf e testhymin que eram conhecidos como sendo independente da actividade gata. Portanto, em conjunto com os seus outros resultados experimentais, foi revelado que GATA1 é essencial na regulação da diferenciação de células dentro da linhagem mielo-eritróides. Em um estudo do desenvolvimento da crista neural, montagens planas foram usados para examinar a expressão Crestin em mont blanc (mob M610) mutantes em um estudoexaminar os papéis de mont blanc e função do gene tfap2a 23. Aos 10 e 20 ss, expressão Crestin foi totalmente revogada na cabeça e diminuiu na região do tronco de mutantes M610 mob em comparação com a expressão normal, do tipo selvagem, em última análise, ajudar este grupo a concluir sobre a importância da mont blanc e tfap2a regulação durante a formação da crista neural. Além disso, em termos de organogénese, montagens planas permitiram a descoberta da presença de domínios distintos no campo progenitora renal precoce durante o desenvolvimento do rim embrionário do peixe-zebra, conhecidos como os pronefros. O embrião do peixe-zebra fornece um sistema conservado e ainda anatomicamente simples para estudar como progenitoras renais dar origem a unidades de nefrónios funcionais que compreendem os pronefros, um processo conhecido como nefrogênese 6,7 (Figura 4). Análise de montagem plana tem sido útil para os domínios de documentos de reprogenitores nal e para dissecar o resultado de mudanças na sinalização RA durante pronefros padronização 6,7 (Figura 5), o que era até então desconhecida. Tomados em conjunto, estes exemplos sugerem que há de fato muitas amplas aplicações para esta montagem plana protocolo do estudo de diversos processos que ocorrem durante o desenvolvimento normal e estados doentes.
Conceitualmente, este procedimento plana de montagem é bastante simples em geral. No entanto, as manipulações e grau de finesse necessários para dominar este método pode ser bastante difícil de dominar, na ausência de demonstração visual. Portanto, este protocolo foi elaborado para permitir aos investigadores, especialmente aqueles que são novos para o modelo de peixe-zebra, com a oportunidade de entender melhor como executar esta técnica e partilhar o nosso aconselhamento sobre os reagentes que podem otimizar a manipulação de tecidos. Esperamos que este protocolo acabará por permitir que outros na comunidade para refinar as condições da amostra mais ideal para ser used para geração de imagens premium, análise de dados e comunicação dos seus resultados em publicações. Em última análise, isso deve permitir aos investigadores para superar os obstáculos anatômicos do peixe-zebra durante a embriogênese precoce, o que pode obscurecer a apresentação de resultados experimentais, e resolver estes através do uso desta técnica simples, mas significativo.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado através do financiamento para a RAW a partir de cada um dos seguintes: NIH concede K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Iniciado Scholar concessão de uma subvenção n º 5-FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame Faculdade de Ciências e Departamento de Ciências Biológicas. Gostaríamos especialmente de agradecer Elizabeth e Michael Gallagher, junto com toda a família Gallagher, que concedeu uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame para promover investigação em células estaminais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa em Zebrafish Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros de nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho, comobem como Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert para fornecer naturalmente derramou bigodes felinos para fazer ferramentas chicote mais excelentes para a nossa pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
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