Summary
Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.
Abstract
Zebra balığı embriyosu şimdi yaygın gelişimsel süreçlerinin genetik kontrolünü araştırmak ve konjenital anomaliler modellemek için temel ve biyomedikal araştırmalar için kullanılır. Yaşamın ilk gününde, Zebra balığı embriyo döllenme, bölünme, gastrulasyon, segmentasyon, ve bu tür böbrek, kalp ve merkezi sinir sistemi gibi yapıların anjiogenezis gibi pek çok gelişimsel aşamaları ilerledikçe. Embriyo yuvarlak sarısı kütle ile birlikte gelişir, çünkü küçük, zebra balığı embriyonun anatomisi bu olayların çoğu dahil dokuların görüntülenmesi ve analiz için çeşitli sorunlar ortaya koymaktadır. Böylece, doğru analiz ve tailbud ve 20 somite aşamada böyle kullanılarak boyandı gibi (sırasıyla 10 ve 19 saat sonra döllenme (hpf)) arasındaki sabit embriyonik örneklerde deneysel fenotipleri görüntüleme için bütün o, in situ hibridizasyon (DİLERİZ) monte sarısı b embriyo çıkarmak genellikle arzu edilirbütün ve bir cam slayt üzerine düz konumlandırmak için. Ancak, düz bir montaj prosedürü yerine sıkıcı olabilir. Bu nedenle, düz başarılı ve etkili bir şekilde hazırlanması çok diseksiyon tekniğin görsel gösterimi ile sağlanır almaktadır, ve aynı zamanda en uygun doku işleme yardımcı reaktifler kullanılarak yardımcı oldu. Burada, biz zebrafish embriyo gen ifadesinin bir ya da iki renk algılama için bizim DİLERİZ protokol sağlamak ve düz montaj prosedürü lekeli sabit numunenin bu örnekte yapılabilir nasıl göstermektedir. Bu, düz bir montaj protokol, zebra balığı erken gelişimi sırasında ortaya çıkan çok embriyonik yapıların çalışma geniş çapta uygulanabilir, ve sabit embriyo numuneler üzerinde yapılan diğer boyama yöntemleri ile bağlantılı olarak uygulanabilir.
Introduction
Zebra balığı, Br.rerio, gelişimsel biyoloji çalışmada yaygın olarak kullanılan bir organizma haline gelmiştir. Zebra balığı ailesine Cyprinidae ait bir tropikal tatlı su omurgalı türler vardır. Kolayca elde edilebilen ucuz ve 1 bakımı kolay olduğu gibi Zebra başlangıçta, potansiyel su kirleticilerin tehlikeleri hakkında bilgi elde etmek için çevresel araştırma için kullanıldı. Son otuz yılda, Zebra balığı nedenlerle bir dizi için bir genetik uysal omurgalı model sistem olarak kabul haline gelmiştir. Zebra balığı memeliler 2,3 gibi yüksek omurgalılar ile anatomik ve fizyolojik koruma yüksek düzeyde göstermektedir. Yeni genom dizisi açıklama insan genlerinin yaklaşık% 70'inin en az bir Zebrafish muadili 4 sahip olduğunu ortaya koymuştur. Örneğin, böbrek gelişimi esnasında önemli bir rol oynayan birçok ortolog genler bu türlerin 5-7 arasında tespit edilmiştir. Bu drahücresel ve moleküler biyoloji açısından koruma matik derecesi zebrabalıkları 8 insan hastalıkları geniş bir yelpazede için modeller oluşturmak için araştırmacılar sağladı ve Zebrafish kimyasal genetik ekranlarını 9 kullanarak potansiyel ilaç tedavileri tanımlamak için değerli bir araç haline gelmiştir.
Ayrıca, Zebra balığı bir model değil, sadece karmaşık bir gelişimsel süreç ve insanlarda görülen hastalık durumlarında çeşitli özetlemek, ama birkaç ek özellikler de embriyolojik çalışmalar için bir model organizma olarak itiraz yükseltmek mümkün. Zebra balığı yumurtlayarak çoğalan ve gübreleme 10 başlangıcından embriyoların kolay erişim sağlayan araştırmacılar yayın yumurtlaması ile ürerler. Diğer avantajlar embriyo boyutu, şeffaflık ve hızlı, dış gelişme 10 içerir. Ayrıca, Zebra balığı yetişkin yüksek doğurganlığını sahip ve tipik 200-500 arasında değişir nispeten büyük debriyaj boyutlarda üretimhaftada, sonuçta kolaylıkla 9 ile böyle bir fenotip bazlı kimyasal ekranlar gibi yüksek verim deneyleri, gerçekleştirmek sağlayan araştırmacıların.
Hatta bu yüzden, Zebra balığı modeli tarafından sergilenmektedir avantajları bolluk rağmen, analiz ve erken gelişim evrelerinde elde edilen deneysel sonuçların iletişim ilgilendirmeyen zorluklar vardır. Bazı durumlarda, Zebra balığı embriyo doğasında anatomisi kişinin verilerinin görselleştirme belirsiz olabilir. Geliştirme 11 ilerledikçe Döllenme sonrasında ilk hücre bölünmesi olayları çok maruz kalır. Gastrulasyon sonra, embriyonik aks bu sarısı 11 etrafında sarılır ve bu şekilde, tailbud aşama (10 HPF) ortaya çıkmaktadır. Daha sonraki gelişme bölütleme dönem boyunca ilerledikçe, gövde kütle yetişen ve aynı zamanda eksenel uzama ile uzatacaktır sarısı bir kısmı ile birlikte bir kuyruk kendi merkezi sarısı kese kütlesinden dışarı uzanan şekilde11.. Tailbud ve 20 somite aşamasında (19 hpf) arasında, örneğin VVISH gibi çeşitli boyama protokollerinin kullanımı sonra belirli gelişim özelliklerini gözlemlemek çalışır, hem de borçların embriyo ve donukluk geometri görselleştirmek ve fotoğraf için zor olabilir yolk kesesi. Bu sorunları ortadan kaldırmak için bir yol sarısı kaldırmak ve daha sonra, daha basit bir şekilde analiz edilebilir iki boyutlu bir numune içine embriyo düzleştirmek etmektir.
Aşağıdaki protokol ve video kaynakları başarıyla deyolk ve düz bir veya iki-renkli DİLERİZ boyanma örneği kullanılarak, tespit ve boyama aşağıdaki bir embriyo monte etmek nasıl bir kılavuz sağlar. , WISH korunmuş örneklerinde spesifik nükleik asitlerin saptanmasını mümkün kılan ve böylece dokularda tespit edilecek gen ekspresyonunun yer (ler) için izin veren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. , WISH teknikler yaygın olarak tarif edilmiştir ve çeşitli renk alt-tabakalar aynı zamanda ile yapılabilir griporescent algılama sistemleri 12-20. Burada gelişme tailbud ve segmentasyon aşamaları arasında Zebra balığı embriyolarının için kullanılan bizim modifiye DİLERİZ protokol sağlar. Aşağıdaki protokol Başlangıçta belirtildiği gibi alternatif DİLERİZ protokolleri, ancak, burada anlatılan düz montaj prosedürü ile uyumludur. Buna ek olarak, düz bir montaj bu protokol açıklanmayan bütün montaj immünohistokimya veya hücre soyu izleme etiket gibi mevcut görselleştirme teknikleri, herhangi bir sayı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Genel olarak, düz montaj tekniği iyi zebrabalıkları embriyonik gelişimin erken safhalarında ile deneylerden elde edilen verilerin üstün analiz ve sunum etkinleştirebilirsiniz.
Protocol
Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Not: Bölüm 1-5 de tarif edilen prosedürler için temsili sonuçlarda burada sağlanan embriyo görüntüleri oluşturmak için kullanıldı. Alternatif, WISH prosedürler 12-16 ya da bu tür özel antikorlar kullanılarak belirli proteinler için immünohistokimyasal etiketleme gibi diğer görüntüleme teknikleri ile arzu edildiği gibi parçalar 1-5 'de tanımlanan prosedürler ikame edilebilir. Parçaları 1-5 açıklanan protokol, ilk embriyo tespit ve nihai boyanma tespit adımlarla DİLERİZ Zebra balığı embriyolarının düz çıkıntıları performans düz montajı için örnek sarısı granülleri kaldırmak için yeteneğini etkileyebilir büyük manipülasyonlar vardır. İlk sabitleme taze çözülmüş, buz soğukluğundaki% 4 paraformaldehit (PFA) / 1x PBS ve sabitleme ile yapıldığında en iyi düz bir montaj sonuçlar elde edilmektedirbuz gibi soğuk% 4 PFA/1x PBS (taze çözülmüş olması gerekmez ki), ve Parçaları 6-8 ile birlikte alternatif boyama yöntemleri yerine okuyucuların, bu dikkate tavsiye edilir ile son DİLERİZ boyama reaksiyon.
1.. Embriyo Koleksiyonu, Fiksasyon ve Depolama
- Bir gecede bölücü ayrılmış, böylece sistem su odalarına yetişkin zebrabalıkları erkek (ler) ve kadın (lar) koyarak çiftleşme kafesleri hazırlayın.
- Yetişkinler arasındaki bölücüler çıkarın ve eşdeğer embriyonik aşamalarında olması kavramaları toplamak için çiftleşme 15-30 dakika ~ içinde ince bir tel örgü çay süzgeci kullanarak döllenmiş yumurta toplamak.
- Baş aşağı çevirin ve süzgeç E3 çözeltisi yaklaşık 25 ml ihtiva eden inkübasyon kapları içine embriyo transfer etmek püskürtmeli bir şişe tevzi E3 ince bir akımı ile yüzeyin durulanması.
- Clutches topladıktan sonra, yaklaşık 50-60 embriyolar kuluçkaya öyle ki çeşitli yemekler bölünE3 çözeltisi 25 ml her bir çanak içinde. Not: embriyoların Kalabalıklaşma debriyaj ve bakımı istenen aşamada (ler) zamanında toplanmasını sağlamak için, bu önlemek için alınması gereken içindeki dramatik gelişim asenkronisi yol açabilir.
- Zebra balığı, standart hazırlama serisi 11 göre gelişimsel değerlendirilmesini sağlamak için 28.5 ° C'de embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.
- Hafifçe düz bir taban mikrosantrifüj tüpe, 20 somite aşamasında (19 hpf) kadar, seçilen timepoint embriyo istenilen sayıda yerleştirmek için plastik bir transfer pipet kullanın. Not: kırılgan ve kolayca transferi pipet ile ezme veya agresif taşıma hasar olabilir gibi, genç embriyoların alınmasında özen gösterin. Seçenek olarak ise, cam şişeler embriyo tespit ve işlenmesi için de kullanılabilir. Tüm takip eden protokol yıkama için plastik transferi pipetler (3.11, 3.14 aşama) riboprob ekleme ve kaldırma hariç olmak üzere, kullanılabilir.
- Buz gibi soğuk% 4 PFA/1x PBS ile E3 değiştirin veOda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de 4 saat boyunca 4% PFA/1x PBS içinde kendi chorions embriyolar düzeltin. Dikkatli Not: PFA toksik ve eldiven ve bir laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek PFA çözümler kimyasal bir kaput ele alınmalıdır. Stok solüsyonu yaparken bile granüllü PFA statik yük aracılığıyla dağıtmak eğilimi olabilir ek olarak, PFA tozu, olağanüstü dikkatle ele alınmalıdır. Tipik olarak PFA PFA tozu çözmek üzere bir kaynaması için 1x PBS ısıtılması ile hazırlanır, sonra çözelti -20 ° C 'de parçalar halinde saklanır Çözelti soğutulur, sonra ince çökeltiler% 4 PFA/1x PBS içinde mevcut olması durumunda, filtre ise 0.45 um'lik bir filtre sistemi üzerinden geçirilerek, dondurarak saklama aliquoting önce soğutulmuş çözelti sterilize edin. Sadece taze hazırlanmış ya da taze çözülmüş PFA embriyonun bu ilk (yani birincil) tespit için kullanılır.
- Kaldır düzeltmek ve aktarmak sonra, 1x PBST ile iki kez yıkayın embriyolarbir kuluçka çanak.
- Bir stereo mikroskop altında embriyoların görüntülemek ve ikinci çift açık koryon gözyaşı kullanılır ise, bir çift kaldıraç yavaşça embriyo için kullanılan şekilde embriyolar çevreleyen chorions kaldırmak için ince forseps iki çift kullanın.
2.. Embriyo Permeablization
- Geri mikrosantrifüj tüp veya cam şişenin içine dechorionated embriyolar transfer, sonra kalan koryon enkaz kaldırmak için 1x PBST ile iki kez yıkayın.
- 1x PBST çıkarın ve% 100 metanol (MeOH) ile iki kez embriyolar yıkayın.
- En az 20 dakika boyunca -20 ° C'de embriyolar yerleştirin. Not: Embriyolar bir yıl veya daha fazla, MeOH içerisinde -20 ° C'de saklanabilir. Metanol chorions kaldırıldı sürece bu nedenle bu adıma devam etmeyin, chorions yapışkan yapar.
- % 100 MeOH kaldırarak embriyolar rehidrate ve 1 x PBST ile iki kez, daha sonra% 50 MeOH/1x PBST,% 30 MeOH/1x PBST içinde her biri 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkayın. '/ Li>
- PBST 1x 50 ml taze çözülmüş proteinaz K stok (10 mg / ml) 25 ul ekleyerek yeni bir proteinaz K çalışma çözeltisi (5 mg / ml) hazırlayın.
- Embriyolardan 1x PBST çıkarın, daha sonra embriyonik aşamasına göre proteinaz K ile çalışan çözüm yerine ve kuluçkaya: <= 1 dakika boyunca 5 Somitlerin; 10-12 dakika boyunca 1.5 Somitlerin; 2 dakika ve 3 dakika boyunca 20 Somitlerin 15 Somitlerin.
- Proteinaz K çalışma çözeltisi çıkarın ve 1 x PBST ile iki kez embriyolar yıkayın.
- 1x PBST çıkarın ve oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca buz gibi soğuk% 4 PFA/1x PBS ile değiştirin.
3.. Riboprobe Sentezi, melezleme, Hibritleşme ve Probe Kaldırma
- Buz üzerinde enzim tutarken PCR 100-200 ng ya da (ilgilenilen gene tekabül eden diziyi ihtiva eden bir DNA şablonu birleştirerek, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, oda sıcaklığında antisens riboprob in vitro transkripsiyon reaksiyonu bir araya getirindioksijenin işaretli ya da flöresin ribonükleotidler, uygun bir RNA polimeraz olduğu sekansına bağlı olarak (SP6, T3, T7 2 ul ürünü veya doğrusallaştırılmış DNA plazmid 1.5 ug, 12,13 tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), 2 ul PCR ürün ya da içine dahil edilmiştir ) DNA plazmid üzerinde mevcut olan, 10x transkripsiyon tamponu 2 ul RNaz inhibitör 0.5 ul ve moleküler sınıf damıtılmış su ile 20 ul bir toplam hacme getirmek (DNase, serbest RNase). Not: 10x transkripsiyon tamponu, 10-20 dakika süre ile, 37 ° C su banyosu içinde önceden ısıtılmış tüp yerleştirerek ve tüm bileşenlerin çözelti içinde olmasını sağlamak için daha sonra vortekslenir olmalıdır. Beyaz pul varsa, tekrar başka bir 5-10 dakika ve vorteks için tüp inkübe. Transkripsiyon tampon tamamen çözülmüş ve iyice karıştırılır değilse transkripsiyon reaksiyonları zayıf verim başarısız ya da olabilir.
- Karışım bileşenleri ve bir su banyosu içinde 2 saat boyunca 37 ° C 'de, her reaksiyon inkübe edin.
- Reaksiyonu tu kaldırmasu banyosu (ler), ve 50 ul toplam hacmi getirmek için bir tampon 10x DNase, I enzim DNase 2 ul 5 ul ve moleküler sınıf damıtılmış su içinde 23 ul ekleyerek her numunedeki DNA şablonu yok, ve daha sonra, bir su banyosu içinde 20 dakika boyunca 37 ° C 'de, her tüp inkübe edin.
- Sonraki adımda RNA pelet vizüalizasyon glikojen stokunun 1 ul, ardından 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve buz soğukluğunda% 100 etanol içinde 110 ul 5 ul ilave edilmesiyle ve daha sonra inkübe her bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir etanol çökeltme gerçekleştirme en az 1 saat veya gece boyunca -20 ° C'de tüp.
- Santrifüj maksimum hız 20 dakika boyunca 4 ° C 'de her bir mikrosantrifüj tüpü, daha sonra% 100 etanol süpernatant kaldırmak ve% 70 buz soğukluğundaki etanol 100 ul ile değiştirin.
- Santrifüj 5 dakika boyunca 4 ° C 'de her bir mikrosantrifüj tüpü, daha sonra 5 dakika boyunca kuru pelet% 70 etanol süpernatan ve havayı çıkarmak ve ardından son olarak mo 100 ul ekleMolecular dereceli pelet tekrar süspansiyon ve NanoDrop spektrofotometre kullanılarak riboprob stok konsantrasyonu ölçmek için distile su. Not: pelet çözelti içine geçtikten sonra, riboprob hazır buz üzerinde tutuldu ve -20 ° C'de saklanmalıdır.
- Melezleştirme işlemi için sabit embriyolar hazırlanması için, her bir numuneden% 4 PFA/1x PBS kaldırmak ve 1 x PBST ile iki kez embriyolar yıkayın.
- Tek tek her düz taban mikrosantrifüj tüpe 1x PBST'de 25-40 embriyolar arasında aktarın. Not: embriyoların Kalabalıklaşma sonra düzensiz boyama yol açacaktır ve bakım yaklaşık 40 embriyoların her tüp içinde örnek boyutunu sınırlamak için önlemler alınmalıdır.
- HYB üzeri 500-1.000 ul, her bir tüp içinde 1x PBST değiştirin.
- 70 ° C'de ayarlanmış bir fırına embriyolar tüp (ler) koyun ve ön hibridizasyon gerçekleştirmek için, 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe.
- Riboprob (dioksijenin ve / veya fluoresc 100-500 ng ekleyerek riboprob / HYB + çözüm hazırlayınTaze HYB + 500 ul) ein-etiketlenir ve daha sonra bunu prewarm için 3,11 Adım önce en az 20 dakika boyunca 70 ° C 'de bu çözüm inkübe edin. Not: Tek ve / veya çift kolorimetrik etiketleme, bu genlere karşılık gelen riboprobes her biri riboprob / HYB + kokteyl birleştirilebilir gereken kullanılarak çoklu gen transkript tespit etmek.
- Her embriyo tüpten + melezleştirme HYB çıkarın ve yeterli riboprob / HYB ile değiştirin + embriyolar kapsayacak. Not: Genellikle, riboprob / HYB + 200-250 ul bir düz taban mikrosantrifüj tüpü içinde embriyo karşılamak için gereklidir. Riboprobe / HYB + ekleme ve çıkarma tipik örnekleri arasında çapraz bulaşmayı önlemek için pipet ve bariyer ipuçlarını kullanarak gerçekleştirilir.
- Gece boyunca ribroprobe / HYB + ile 70 ° C de inkübe embriyolar.
- 70 ° C'de gece boyunca yıkama çözeltileri ve önceden sıcak bunların aşağıdaki grubu hazırlayın: 50 SSCT, 2x SSCT formamide/2x ve% 0,2 X SSCT. Not: Bu, 50 ml al hazırlamak için uygundurfazla oda sıcaklığında depolanır ve daha sonra ileride kullanılmak üzere ısıtılmış edilebilir, çünkü her iquots, yıkama çözeltisi.
- -20 ° C'de riboprob / HYB + bir pipet ve bariyer ipuçları ve mağaza kullanarak çıkarın Not: Genellikle her riboprob / HYB + karışımı, sinyalin bir azalma olmaksızın birkaç kez (örneğin, 3 veya daha fazla) da kullanılabilir. Yeniden riboprob / HYB + alt arka plan ile ilişkili ise, ancak, riboprob karışımları bozulması söz konusu olabilir yeniden unutmayın.
- , 70 ° C'de 30 dakika boyunca% 50 formamide/2x SSCT ile iki kere yıkayın embriyolar
- , 70 ° C'de 15 dakika boyunca 2 x SSCT ile bir kez yıkayın embriyolar
- , 70 ° C'de 30 dakika boyunca iki kez 0.2x SSCT embriyolar yıkayın
- 0.2x SSCT çıkarın ve oda sıcaklığında MABT ile iki kez embriyolar yıkayın.
4. Anti-dioksijenin Antikor Kuluçka ve Algılama
- Taze blok çözüm hazırlayın.
- MABT çıkarın ve blok Solu ile değiştirintion.
- Oda sıcaklığında 2-4 saat boyunca blok çözeltisi içinde embriyolar inkübe edin. Not: Daha uzun blok kuluçkalamalar genç Zebra balığı Embriyolar aşamalarında (<15 Somitlerin) ile optimum sonuçlar sağlar. Gece boyunca (~ 8 saat kadar) daha sonra 4 ° C inkübasyon, uzun blok işlem yapmak, oda sıcaklığında ya da oda sıcaklığında bir arada 8-12 saat boyunca blok inkübasyon gerçekleştirmek için artı.
- Taze blok çözeltisi (örneğin, blok, 5 ml başına 1 ul) ve 5000 kat seyreltme yaparak anti-dioksijenin antikor çözeltisi hazırlayın.
- Bloğunu ve antikor / blok çözeltisi ekleyin.
- Folyo örnek kapağı ve 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat süreyle gece boyunca inkübe edilir.
- Anti-digoxygenin/block çıkarın ve MABT ile embriyoların en az 10 kez yıkayın. Not: MABT yıkama için 12-iyi yemekler embriyolar transfer. Bu büyük numune miktarları işlerken yararlıdır embriyoların yıkanabilir hızını, artırırnd kolay bir stereo mikroskop altında boyanma reaksiyonu (4,11 Adım) ilerlemeyi izlemek için yapar. Not: Bu adım embriyoların anda sırasında uzun izlenmesini gerektiren yüksek bir arka plan veya lekeleri vermek eğilimindedir prob için yararlı bir tedavi olduğu, 4.8 Adım geçmeden önce 4 ° C'de MABT gece boyunca onları kuluçka 'süper-yıkanmış' olabilir gün çalışıyoruz.
- Ön boyama tamponu ve istenen boyama çözeltisi (mor veya kırmızı alt-tabaka) hazırlayın.
- MABT çıkarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için ön-lekeleme tampon maddesi içinde embriyolar yıkayın.
- Ön boyama tamponunu çıkarın ve boyama çözeltisi ilave edilir.
- Bir stereo mikroskop altında embriyoların görünümünü kontrol ederek, her 15-30 dakika oda sıcaklığında boyama, reaksiyonun ilerleyişini izlemek. Not: boyama reaksiyon oranı leke tamamlanması için daha fazla zaman vermek gerekirse, 4 ° C örnekleri aktararak yavaşlamış olabilir. Bir kere 4 soğutulmuş° C, bununla birlikte, reaksiyon, oda sıcaklığına kadar ısıtıldıktan hızlandırılabilir edilemez.
- Lekeleme Reaksiyon tamamlandığında, boyama çözeltisi çıkarın ve 1 x PBST ile değiştirin.
- 5 dakika boyunca 1 x PBST ile iki kere yıkayın. Not: bir alt-tabaka ile, diğer genleri tespit Eğer değilse, o zaman en az 20 dakika boyunca buz gibi soğuk% 4 PFA/1x PBS içinde örnekleri saptamak ve 6.1 adıma geçin. Aksi 5.1 adıma geçin.
5. Anti-florosin Antikor Enkübasyon ve Saptama
- 1x PBST çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika her biri için 0.1 M glisin, pH 2.2 ile iki kez embriyolar yıkayın. Not: glisin yıkama için zaman tamamen ilk boyama reaksiyonu devre dışı bırakmak için gereklidir.
- 0.1 M glisin çıkarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca MABT ile iki kez embriyolar yıkayın.
- Taze blok çözeltisi (örneğin, blok, 5 ml başına 1 ul) ve 5000 kat seyreltme yaparak anti-floresan antikor çözeltisi hazırlayın.
- MABT çıkarın ve antikor / blok çözeltisi ekleyin. Takip fluoresein etiketli ribroprobe tespitini gerçekleştirmek için 4,6-4,13 adımları tekrarlayın. Not: Nihai boyama Reaksiyon tamamlandığında, bu numunenin son sabitleme buz gibi soğuk% 4 PFA/1X PBS içinde yapılır esastır. Sıcak PFA çözümleri ile Fixation düz montaj işlemi için diseksiyon ve deyolking sırasında embriyo kaldırmak zordur yapışkan yumurta sarısı ile ilişkili olma eğilimindedir.
6.. Embriyo Diseksiyon ve Embriyo Başlangıç Deyolking
- Düz montaj için sabit, lekeli embriyoyu seçmek.
- 1x PBST ihtiva eden bir plastik ya da cam Petri kabı içine seçilen embriyo numuneyi bir transfer pipet kullanın.
- Stereomicroscope altında tabak yerleştirin, ve bir yan görünüm elde edilir ve baş ve kuyruk uçları görüntülenmiştir böylece ince forseps ya da kirpik aracı bir çift kullanarak embriyo rulo.
- Th bir kesi yapmak için ince forseps bir çift kullanınyumurta sarısı kesi için kaldıraç sağlayacak şekilde bu arada e baş ve embriyonun kuyruk arasında merkezi bir konumda bulunan bir pozisyonda sarısı ve embriyo tutmak için ince forseps bir ikinci çift kullanın. Not: Alternatif olarak, sarısında iki büyük kesiler, biri kafasına yakın ve embriyo kuyruk diğer yakın olun.
- Sarısı hücre boşluğundan sarısı oymak için ince forseps ve / veya kirpik aracını kullanın.
- Başıboş yumurta sarısı kaldırmak için 1x PBST'yle hafifçe embriyo durulayın.
Embriyo 7. Güzel Deyolking
- 1x PBST'de 1-2 damla bir düz cam slayt embriyo transferi.
- Yavaşça ventral (sarısı) yan cam slayt üzerinde yukarı bakacak embriyo konumlandırmak için bir kirpik aracı ve ince forseps kullanın.
- Embriyo cam slayt karşı düz bir konumda kalır, böylece kirpik aleti ile 1x PBST solüsyonu kenarına embriyo Drag.
- Hafifçe kirpik kullanarak embriyonun ventral yüzeyini kazıyarakembriyo yırtılmadan sarısı granüller çıkarmak için ol. Aynı anda kirpik aracı ile kazıma sırasında embriyo tutturmak için ince forseps bir çift kullanın. Not: yumurta sarısı granül çıkarılması 5-10 dakika boyunca tekrarlayan kazıma gerektirebilir.
- PBST çözüm aşırı yumurta sarısı ile darmadağın olur ya da buharlaşmaya başladığı, bir plastik veya cam transfer pipet kullanarak slayt 1x PBST'de 1-2 taze damla ekleyin ve daha sonra sarısı granül için temiz çözüm ile alana embriyo sürükleyin kaldırma.
- Yumurta sarısı biçimde kaldırıldı zaman, hafifçe başıboş sarısı granüller çıkarmak amacıyla bir son durulama için 1 x PBST ihtiva eden bir plastik ya da cam Petri kabı içine geri embriyo hareket ettirmek için bir transfer pipet kullanın.
- % 100 gliserol ihtiva eden bir plastik ya da cam Petri kabı içine, bir plastik ya da cam transfer pipeti kullanarak deyolked embriyo transfer edin.
- Embriyo gelmesini ~ 5 dakika boyunca% 100 gliserol içinde embriyo inkübe edin.
8. Bir cam slayt üzerine montaj
- % 100 gliserol 1-2 damla temiz bir cam slayt deyolked embriyo transferi.
- Ventral (sarısı) yan cam slayt bakacak embriyo yerleştirin.
- Embriyo cam slayt karşı düz bir pozisyonda kalması için bir kirpik aracı kullanarak, gliserol damla kenarına embriyo sürüklemek. Embriyonik eksenli kavisli olursa, embriyo ekseni ile düz bir slayt üzerinde düz olarak yerleştirilmiş olabilir, böylece ince forseps yavaşça gerilimini azaltmak için, geri kalan yumurta sarısı hücre zarında çok küçük kesikler yapmak için kullanılır.
- 18 x 18 mm cam lamel dört köşelerinde modelleme kil küçük divots yerleştirin. Not: Alternatif olarak, vakum yağ 15 arasında küçük bir damla kil modellemek için ikame edilebilir.
- Numune etrafında gliserol içinde hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirmek için lamel olta, embriyo üzerinde yavaş yavaş cam lamel yerleştirin.
- % 100 gliserol ilave bir damla eklemecam lamel tarafına lamel ve cam slayt arasındaki boşluğu doldurmak için.
- Sıkıca cam arasındaki embriyo konumlandırmak ve sürüklenen ortadan kaldırmak için lamel dört köşelerinde yavaş yavaş ve dikkatlice bastırın. Not: embriyo ezmek için değil dikkatli olun.
- Istediğiniz gibi embriyo konumlandırılmış değilse, lamel kaldırmak için ince forseps kullanabilir. Embriyo konumlandırılmış böylece ek kesiler yapmak için embriyo ve / veya ince forseps yeniden konumlandırmak için kirpik aracını kullanın. Tekrarlayın 8,4-8,7 adımları.
- Bir stereo veya bileşik mikroskop kullanarak örneği gözlemlemek ve / veya görüntü.
- Mağaza düz hazırlanmasını birkaç hafta veya geçici olarak, oda sıcaklığında, 4 ° C de karanlıkta bir karton slayt tutucu düz monte edin. Not: DİLERİZ leke, zaman içinde giderek özellikle kırmızı yüzey reaksiyonları solacak ve süresiz gliserol muhafaza edilemez. Gliserol tutulması durumunda mor lekeler de kıyasla daha kolay solmayaPFA (8,11 Adım bakınız). İlginçtir, oldukça gliserol daha permount montaj embriyolar oda sıcaklığında 15 de belirsiz depolama etkinleştirebilirsiniz yayımlanmıştır.
- Mor tabaka lekeli örneklerin uzun süreli depolama için, cam lamel kaldırmak ve 1x PBST'de kez durulanır embriyo durulayın, daha sonra uzun süreli depolama için% 4 PFA/1x PBS ile bir santrifüj tüpüne aktarın. Not: Alternatif olarak, 1 x PBST içinde embriyolar, bu tür genotipleme için DNA izolasyonu gibi ek analizler için işlenebilir.
Representative Results
Düz bir montaj protokol prosedür vücut ekseni iki boyutlu bir preparat (Şekil 1A) içine, merkezi bir yumurta sarısı oyunu sarılı olduğu normal anatomik gelen Zebrafish embriyonun dönüşümü içerir. Genç Zebrafish embriyo Tüm montaj görüntüleme embriyonik ekseni sarısı sarılı olduğu kadar doğası ile sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, tam bir lateral ya da dorsal incelemeler lekeli embriyo numuneler yalnızca eksen veya belirsiz belirli dokular (Şekil 1 B) bir kısmını yakalayabilir monte edin. Buna karşılık, embriyo deyolking ve düzleşme bir kez (Şekil 1 B) görünür hale için tüm embriyonik eksen sağlar. Bu sınırlamalar bir etiket, WISH lekeli ile 13 arasındaki Somitlerin 7 bitişiğinde bulunan renal soylarının bir alt işaretleri (Mor) irx3b tespit etmek için antisens riboprobları ile etiketlenmiştir embriyo, ve myod1 (kırmızı) incelenerek gösterilmektedirSomitlerin (Şekil 1 B). Irx3b + renal progenitörlerinin alan irx3b transkriptleri yan açı ile kamera görselleştirmek için renal alan bir pratik olarak imkansız hale, merkezi sinir sistemi içinde bol olduğu için yan görünümü monte bütün olarak engellenmektedir; alan sarısı (Şekil 1 B) sarılı olduğu için embriyo bir dorsal kamera görüntüsü döndürüldüğü zaman, ayrıca irx3b + renal progenitörlerin alan sadece kısmen görülebilir. Bununla birlikte, düz bir montaj sonra aynı embriyo bir dorsal görünüşüdür irx3b + gövde ve diğer embriyonik yapılar (Şekil 1 B) boyunca Somitlerin bağlı olarak basit bir şekilde analiz edilmesi için renal progenitörlerin tüm alan sağlar. Böylece, ayrıntılı mekansal etki ideal bu yöntem ile belgelenmiş olabilir.
Birkaç büyük adımlar düz montaj işleminin başarılı bir şekilde yürütülmesi olarak katılıyor. Bu techniqu gerçekleştirmek içine, sarısı topu ilk embriyo stereomikroskopta görüntülenmiştir ise böyle ince forseps bir çift ince aletler ile yapılabilir uygun embriyo (Şekil 2A), çıkartılması gerekmektedir. Sarısı topun ham ayrılmasından sonra, ince bir kirpik araç embriyo (Şekil 2B) bağlı kalmıştır sarısı granüller kazınması için kullanılmaktadır. Kalan yumurta sarısı granüllerin çıkarılması embriyonik dokuların görüntülenmesine kolaylaştırmak için yardımcı olur. Son olarak, deyolked embriyo gözlem ve yardımcıları görüntüleme yazılımı kullanılarak örnek belgeleri ve mikroskoba bağlı bir kamera sağlayan bir cam slayt (Şekil 2C), üzerinde stabil konumlandırmak için manipüle edilir. Kirpik araçları bir kolu istenirse (Şekil 3A, Malzeme masa) üzerine monte edilebilir superglue kullanarak bir pipet uygun bir kirpik birleştirilmek suretiyle inşa edilebilir ev yapımı cihazlar vardır. Farklı kirpik örnekleri üretmek için temin edilebiliruzunluğunda ve her kullanıcı düz montaj prosedürü ile deneme başlar kez farklı tercihlerini olabilir konik (Şekil 3B), açısından biraz farklı özelliklere sahip araçlar saldırmak. Kirpik numunelerinin örnekleri doğal olarak, insan kirpik döken doğal hayvan sırım gibi saç veya bıyık döken, ve nihayet piyasada mevcut kirpikler sentetik çeşitleri perakende kozmetik bölümlerinde bulunan içerir.
Çevre ve bir cam slayt (Şekil 4A) üzerine yerleştirilmiş olan örnek (ler) ihtiva eden bir yerel yüksek çözünürlüklü analizi için görüntülenebilir. Prob bir arada iki renkli arzu ile erken gelişim aşamalarında yabani tip embriyo böbrek doğuran gelişmekte olan renal progenitörlerin etiket ve daha sonra düz preparasyonlar örnekleri (Şekil 4B, 4C görüntülemek üzere yapılmıştır monte etmek için kullanıldı .) Erken hücre gruplarının aşamalarında, renal progenitorlar th ile U-şeklindeki model içinde birbirinden ayrılıreşzamanlı delta C (dlc) (kırmızı) (sol sütun, Şekil 4B) 6,7 ifade paraksiyel mezoderm çevreleyen (mor) pax2a transkript eir ifadesi. DLC transkript mor bir alt-tabaka ile tespit edildi, ve arka beyin işaretleyici krox20 (kırmızı) ile bir arada etiketli zaman, daha önce de belirtildiği gibi karşılaştırıldığında, renal progenitörlerin bir rostral alt etki alanı, DLC (sağ sütun, Şekil 4B) ifade eden görselleştirilmiştir 6,7. Düz monte preparasyonlar daha sonra somitogenesis aşamaları incelemek için benzer şekilde kullanılabilir. 14 hücre gruplarının aşamada, renal belirteçler pax2a, slc4a4 ve Somitlerin (Şekil 4C) işaretleri smyhc1 (kırmızı) ile birlikte, (Mor) SLC12A3 ekspresyonunu analiz ettik. Açığa çıkarırken, bu kombinasyonlar, pax2a ile tüm renal progenitör etki eşleme sağlayacak bir alt etki alanı rostral İfade içindeki hücrelerinin bir altslc4a4a Essed ve SLC12A3 ifade böbrek atalarıdır örtüşmeyen kaudal subdomain tarafından ayırt edildi.
Iki renkli DİLERİZ ve düz monte hazırlık da küçük moleküllerin 6,7 için çevresel maruziyet (Şekil 5), genetik mutasyonlar veya diğer tedirginlikler ile zebrabalıkları organogenezis sırasında hücresel etki çalışma için değerlidir. Zebra balığı NLS ve lib mutantlar aldehit dehidrojenaz 1a2 retinoik asit (RA) biyosentezi için gerekli olan bir enzimi kodlayan (eski raldh2 olarak da bilinir aldh1a2), mutasyonlar liman. RA glomerulus 6,7 olarak bilinen embriyonik böbrek kan filtre yapmak için katkı podosit hücrelerinin oluşumu da dahil olmak üzere pek çok renal hücre türlerine uygun gelişimi için gereklidir. DİLERİZ eşzamanlı t çizilmesi ile wt1a ile Podosit atalarıdır etiket yapıldıO vahşi tip embriyolarda krox20 ile smyhc1 ve arka beyin ile somitler geliştirme, mutant embriyolar, lib mutant embriyolar, ve ALDH enzim kimyasal inhibitörü, DEAB (Şekil 5) ile muamele embriyolar NLS. DEAB ile tedavi edilen embriyolar wt1a transkriptlerin bir ortadan kaldırma (Şekil 5, sağ kolon) gösterdi eksikliği aldh1a2 ifade ile Embriyolar, vahşi tip embriyolara kıyasla azaltılmış wt1a ekspresyonu gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu temsili sonuçlar düz montaj tekniği analiz ve belge erken embriyo hassas anatomik farklılıklar, ve böylece değerli gelişim çalışmaları için uygulanacak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Düz monte Prepa Şekil 1.. BakışZebra balığı embriyolarının için rasyon. Merkezi sarısı kütle düz bir yüzey üzerinde uzaklaştırıldı ve embriyo stabil bir şekilde yerleştirilmiş olduğu için A) düz bir montaj prosedür embriyonik ekseni boyunca dokuların eşzamanlı görünüm sağlar. Bir bütün montaj B) Görüntüler, lateral ve dorsal görünümlerinde lekeli embriyo WISH ve daha sonra düz bir montaj hazırlık yapıldı sonra. Embriyo irx3b (mor) ve myod1 (kırmızı) kodlayan gen transkript tespit etmek için antisens prob ile boyandı.
Şekil 2.. Zebra balığı embriyolarının için düz montaj prosedürünün şematik. A) ilk olarak embriyo makroskopik olarak yumurta sarısı kütlesinin bir kısmı bertaraf deyolked, daha sonra (B) ventral yüzeyi ince kalan yumurta sarısı granüller kaldırmak deyolked, veembriyo yıkadıktan sonra (C) görsel analizi ve / veya fotoğraf görüntüleme için bir cam slayt dorsal yüzü yukarı monte edilir.
Şekil 3. Örnek kirpik araçları fotoğrafları ince forseps göre. A) Ev yapımı kirpik araçları görünümünün üstündeki sağlanan milimetre referans ile, bir referans. B) ince forseps yanında kirpik araçları Büyütülmüş görünüm sağlamak için bir metrik cetvel bitişik yerleştirilmiş, ince forseps bir standart çift birlikte görüntülendi . İki farklı kirpik araçları elde kirpiklerinizin işaretlemek için kullanılan yıldız (*) ile gösterilir doğal insan kirpik döken, ve çift yıldız (**) doğal döken kedi bıyık elde edilen ve kesilmiş bir kirpiği işaretlemek için kullanılan biraz kör uç olun. Her case, kirpik pipet ucu ile dişli ve kademeli bir işleme cihazına bağlı pipet için kirpik çapa / stabilize etmek için güçlü bir mühür oluşturmak için superglue birkaç kat ile tutturulmuştur.
Yabani tip zebrafish embriyo böbrek progenitör alanında gelişimsel değişiklikleri Şekil 4.. Karakterizasyonu. A) (B, C). B) Vahşi tip 1 embriyo, 3, 5 ve hücre gruplarının aşama verir renal progenitör alanının bileşiminin değerlendirmek için iki renkli WISH boyanarak analiz için görüntülenmiş bölgeyi gösteren şematik Slide embriyonik böbrek veya pronephros yükselir. (Mor boyanmış) transkripsiyon faktörü kodlayan pax2a (Sol sütun) Tutanaklar renal p dahil embriyo birkaç nüfusları, işaretlemekara mezodermden ortaya rogenitor alan. Çentik ligand DLC kodlayan transkript (kırmızı lekeli) paraksiyel mezodermden formu somitler işaretleyin. (Mor lekeli) dlc transkript ifadesi ve Beyin rhombomere işaretleyici krox20 (kırmızı lekeli) aynı embriyo incelendiğinde (Sağ sütun), dlc ifade Somitlerin bitişiğinde bulunan böbrek atalarıdır bir rostral alt etki görülebilir 14 hücre gruplarının aşamasında pax2a. C) Yabani tip embriyolar ile DLC birlikte boyanması sırasında obscured 1-5) ya da çift (mor bir renal işaretleyici bir kombinasyonu ile üçlü-lekeli, hücre gruplarının işaretleyici smyhc1 (kırmızı) ve Beyin rhombomere işaretleyici krox20 (ayrıca kırmızı). Bu aşamada (Üst panel), pax2a transkript böbrek atalarıdır ayırmak devam ediyor. (Orta, Alt paneller) böbrek progenitör topraklar içinde, bir rostral subdomain işaretlenmişslc4a4 ve SLC12A3 kodlayan transkript tarafından bir kuyruk alt etki alanı işaretleyin.
(Mor) wt1a ait 15 somite aşamada Şekil 5.. Genetik mutasyonlar veya retinoik asit sentezini modüle kimyasal genetik tedirginlikler nedeniyle fenotipleri karakterize düz monte preparatların kullanımı. DİLERİZ ifade desen ve smyhc1/krox20 (kırmızı) karşılaştırıldı retinoik asit (RA) üretim eksiklikleri ile yabani türleri ve embriyo arasındaki nedeniyle aldehit dehidrogenaz 1a2 (NLS ve lib mutasyonlar) veya dietilaminobenzaldehit (DEAB) ile retinaldehidin dehidrogenaz aktivitesinin kimyasal inhibe kusurlarından. Lib RA üretiminin azalması gibi, NLS biraz daha şiddetlidirlib embriyolar yabani türleri DEAB tedavi wt1a ifade komple kaldırılması ile ilişkili iken benzer şekilde, NLS mutant embriyolar sahnelenen daha wt1a transkript biraz azaltılmış boyanmasını ifade söyledi.
Discussion
Zebra balığı son yıllarda araştırma toplum genelinde son derece değerli bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığı yüksek omurgalıların bu genetik koruma önemli bir derecesi sergileyen ve onların anatomi, üreme ve yaşam döngüsü ile ilgili avantajları deneysel analizler, bu türün çok müsait olun. Ayrıca, Zebra balığı için geçerli moleküler tekniklerin ilerlemesi daha fazla bilimsel araştırma, bu model organizmaların kullanımını teşvik etmiştir. Örneğin, transgenik zebrafish hatları büyük bir çeşitlilik hastalığın ilerlemesini incelemek ve organogenezis dahil gelişim kilit mekanizmaları altında yatan birçok temel soruları cevaplamak için oluşturulan edilmiştir.
Buna göre, hastalık ve gelişim araştırma hem de zebrafish dinamik kullanımına dayalı, hücre etiketleme yöntemleri ve sinyal ölçümü veri analizleri önemli bir yönü vardır. Da floresan kullanılması yöntemleriantikorlarının verilmesinin transgenik Zebrafish protein ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilir, araştırmacılar, tipik olarak bir sabit, transgenik olmayan zebra balığı örnekteki gen transkriptlerinin uzaysal lokalizasyonu incelemek isteyen 12-16 gibi standart prosedürlere dayanır. Aslında, dilek biyoloji 16 en yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri olan ve genetik mutasyonların, kimyasal ve genetik pertürbasyonların fenotipinin karakterize etmek için kullanılan önemli bir araçtır. Bununla birlikte, DİLERİZ potansiyel tuzaklar ve zorluklar bir dizi ile ilişkilidir. Antisens ribroprobe özgüllüğünü teyit etmek için, sens riboprobları antisens riboprob boyanma özgünlüğünü değerlendirmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. 4 ve 5 bölümleri Etiketleme ve fluoresan etiketli prob, ardından bir dioksijenin-etiketli prob tespiti amacıyla sunulmuştur, ancak bu düzen tersine çevrilebilir. Tipik haliyle, daha zayıf sinyaller (daha düşük sentezleme seviyelerine sahip genler) en dioksijenin-etiketli problar ve bu leke ile tespit ediliralgılama ve kırmızı alt-tabaka kullanılarak güçlü bir sinyal (daha bol eksprese edilmiş gen) lekelenmesi ardından mor bir alt-tabaka, ilk geliştirdi. Iki renkli reaksiyonlar gerçekleştirilir olacak Ancak, bu etiket ve yüzeylerde çeşitli kombinasyonları veri toplama ve analiz için en uygun olan prosedürü bulmak için test edilmesi tavsiye edilir. Buna ek olarak, zaman, 4-5 24 saat sonra döllenme daha erken embriyolar için tasarlandı bölümlerde verilmektedir antikor inkübasyon ve yıkama bloke edilmesi için Resim; büyük embriyolar ile bu aynı adımların uzun aralıklarla numune üzerinde tuz birikimine yol açabilir. Standart Zebra balığı embriyo DİLERİZ sorun giderme için kapsamlı ipuçları zaten literatürde 12-16 belgelenmiştir. Muhtemelen en sık ikilem yüksek arka plan. Biz gerekirse gecede MABT 'süper-yıkama' eklenmesi, bizim deneyim olsa da, Adım 4.7 15-20 yıkar MABT yıkar sayısının artırılması tavsiye4.8 Adım devam etmeden önce, 10 ya da daha fazla kısa MABT yıkama ile bağlantılı olarak kullanıldığında çok iyi sonuçlar verir. Başka bir örnek ikilem uzun riboprobes ile oluşabilir kötü prob infiltrasyon vardır. Alkali hidroliz yoluyla aşama 3.6 aşağıdaki Riboprobe Kırkım bu karşı olabilir. Genç örnekleri ile bizim deneyim, sonda kesme genellikle gerekli değildir. Ancak, bir bu bir DİLERİZ deney sonucuna ilişkin faktörler olabilir gibi parametreleri göz önünde tutmalı ve biz gerektiği gibi kendi içinde VVISH için deneysel parametreleri geliştirmek için toplumda zaten kamuya açık bu yararlı sorun giderme talimatları incelenmesini öneririz araştırma 12.
Geleneksel DİLERİZ teknikleri 12-16 ek olarak, DİLERİZ metodolojileri ve formüle edilmiş alternatif protokoller gelişmeler sürekli bir çıkışı olmuştur. Bunlar örneğin, floresan kullanımıyla olarak sinyal tespiti için yeni yollar arasında,Cence 17-19 microRNA 20 lokalizasyonunu sağlayacak yöntemler ile ilgilidir. Leke (ler) kolayca istenen bir zaman noktasında ilgi örnek içinde görüntülendi olamaz eğer öyle olsa bile, geçerli hücre etiketleme yöntemleri yapılmış birçok gelişmelere rağmen, bu prosedürlerin etkinliği etkisiz. Bu sınırlama, potansiyel olarak bu zamanlarda ortaya çıkan çeşitli gelişimsel süreçlerin anlayışımıza boşluklar yol açabilecek, bu zebrabalıkları ontogenezimizin erken embriyonik aşamalarında ilgilidir, özellikle araştırmacılar için sorunludur. Normal Zebra balığı gelişimi sırasında, yumurta sarısı kesesi giderek embriyo yaş 11 olarak boyutu azalacak. Embriyo onun bitişiğindeki sarısı kesesinde kıyasla daha büyük olduğu için, bu nedenle, bu sonraki gelişim evreleri (> 24 saat sonra döllenme) de, DİLERİZ boyama analiz etmek oldukça basittir. Bununla birlikte, bu (erken somitogenesis için kuyruk tomurcuk aşamasından durum olmadığında embriyonikopak sarısı kese bazen lekenin görselleştirme karanlık bir yere kütlesi) sarısı etrafında konumlandırılmıştır. Sonuç olarak, düz bir montaj metodu (Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmektedir), erken embriyo zebra balığı numunelerin karakterizasyonu ile ilgili görüntü ve veri analizi sorunları hafifletmeye yardımcı olmak için geliştirilmiştir ve genel olarak izole edilmiş genetik mutasyon sistematik fenotipleme beri kullanılmaktadır Büyük ölçekli ilk genetik ekranlarında 21.
Düz montaj tekniğinin gelişiyle bu yana, erken gelişim evrelerinin analizi önemli ölçüde geliştirilmiştir. Sarısı embriyo kaldırılır sonra, görüntüleme için istenen yönde bir cam slayt embriyo düz koymak mümkündür. Bu iki boyutlu pozisyon örnek döndürmek için olan ihtiyacı ortadan kaldırır, aynı anda tüm embriyo görüş sağlar. Çok sayıda doku gibi embriyo geniş etki alanları bulunurkan ve böbrek oluşturan ön-maddeleri. Ayrıca, tek tek seferde birkaç farklı gelişen dokuları karşılaştırmak gerekebilir. Düz montaj aynı anda böyle hücre gruplarının tüm etki alanı görüntülemek için, ve böylece büyük ölçüde böyle bir doku veya hücre sayımları için bir alan ölçümü olarak quantifications yardımcı olabilir araştırmacı sağlar. Bu teknik sonuçta Hematopöz, nöron ve organogenezi altında yatan önemli gelişim çeşitli mekanizmalar ile ilgili birçok keşifler için kurşun yardımcı olmuştur. Böylece, bir zamanlar hakim, araştırmacılar için bu basit tekniği için uygulamalar çok önemli.
Örneğin, hematopoez sırasında soy seçim inceleyen bir çalışmada, yassı hücre gruplarının 14 ve 18 aşamaları (ss) at zebra balığı embriyoların preparatlar monte arasındaki pu.1 çinko parmak transkripsiyon faktörünün ifadesi desen meydana gelen değişiklikleri göstermek için kullanılmıştır vahşi tip ve GATA1 morfolino embriyolar 22 enjekte edilir.Bu yöntem, GATA1 büyük olasılıkla bu zaman noktasında yaklaşık ara hücre kütlesinin (ICM) içinde pu.1 ekspresyonunu düzenleyen olduğunu gösteren, 18 ss bir genişletilmiş pu.1 etki saptanmasını sağlamıştır. - / - Gtpbp1 ve epsin dahil olmak üzere farklı genlerin eritroid için boyandı ilave sabit monte edilmiş embriyolar GATA1 edildi vlt mutantlar bu genlerin ekspresyonunda bir kayıp gösterdi. Ileri analizler biklf ve gata faaliyet bağımsız olduğu bilinen testhymin gibi erythoid genlerin ifadesinde hiçbir değişiklik gösterdi. Bu nedenle, bunların diğer deney sonuçları ile birlikte, bu GATA1 miyelo-eritroid soyu içinde hücrelerinin farklılaşmasının düzenlenmesinde gerekli olduğu ortaya çıkmıştır. Nöral krest gelişim çalışmada, düz bağlar bir çalışmada (mob m610) mutantlar mont blanc Crestin ifadesini incelemek için kullanılmıştırMont Blanc ve tfap2a gen fonksiyonu 23 rollerini inceleyerek. 10 ve 20 ss de, Crestin ifadesi tamamen kafasına iptal edildi ve sonuçta Mont Blanc önemi ve tfap2a düzenleme üzerinde sonuçlandırmak için bu grubu yardım, normal yabani tip ifadesine göre çete m610 mutantların gövde bölgesinde azaldı sinir ucu oluşumu esnasında. Buna ek olarak, organogenez bakımından, düz bağlar pronephros olarak bilinen Zebrafish embriyonik böbrek gelişimi esnasında erken projenitör renal alanında belirgin etki varlığı keşif, sağlamıştır. Zebra balığı embriyosu böbrek atalarıdır pronephros oluşturan nefron işlevsel birimler yol vermek nasıl çalışma korunmuş ve henüz anatomik basit sistemi, nefrogenezisi 6,7 olarak bilinen bir işlem (Şekil 4) sağlar. Düz montaj analizi yeniden belge alanları için yararlı olmuşturnal atalarıdır ve daha önce bilinmeyen idi (Şekil 5), 6,7 desenlendirme pronephros sırasında RA sinyal değişikliklerin sonuçlarını incelemek. Birlikte ele alındığında, bu örnekler bu düz normal gelişimi ve hastalıklı halleri sırasında meydana gelen çeşitli süreçlerin çalışmaya bağlama protokolünü için çok geniş bir uygulama gerçekten var olduğunu göstermektedir.
Kavramsal olarak, bu düz montaj prosedürü genel olarak oldukça basittir. Ancak, bu yöntemi ana için gerekli incelik manipülasyonlar ve derecesi görsel gösteri yokluğunda efendisine oldukça zor olabilir. Dolayısıyla, bu protokol araştırmacılar, daha iyi bu tekniği gerçekleştirmek ve doku kullanımı optimize edebilirsiniz reaktifler bizim tavsiye paylaşmak için nasıl anlamak için fırsat Zebrafish modeline yeni özellikle, etkinleştirmek için derlendi. Biz bu protokol sonuçta toplumda diğerleri u olmak için en ideal örnek koşulları rafine izin umuyoruzsed prim görüntüleme, veri analizi ve yayınlarda sonuçlarının iletişim için. Sonuçta, bu deney sonuçlarının sunumu belirsiz, hangi erken embriyonik dönemde zebrafish anatomik engelleri aşmak için araştırmacılar etkinleştirmek ve bu basit ama önemli teknik kullanımı ile bu çözmelidir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen aşağıdaki her birinden RAW için fon tarafından desteklenmiştir: NIH hibe K01 DK083512, DP2'deki OD008470 ve R01 DK100237; 5-FY12-75 Dimes Basil O'Connor Başlatan Akademik hibe # Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame College Üniversitesi'nden fonları başlar. Biz özellikle kök hücre araştırmaları teşvik etmek Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kazandırdığı tüm Gallagher Ailesi ile birlikte, Elizabeth ve Michael Gallagher teşekkür etmek istiyorum. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim Zebra balığı koloni bakımı ve refahı onların üstün özveri için Notre Dame Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, biz, onların yorumları, tartışmaları ve bu iş hakkında anlayışlar bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkürde doğal olarak araştırma için en mükemmel kirpik araçlar yapmak için kedi bıyık döken sağlamak için Marigold (Maripooka) ve Zinnia Wingert gibi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
- Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
- Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
- Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
- Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
- Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
- Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).
