Summary
Control del motor y el rendimiento balanza se conocen a deteriorarse con la edad. Este artículo presenta una serie de pruebas de comportamiento no invasivas estándar con la adición de un estímulo rotatorio sencillo para desafiar al sistema y mostrar los cambios en el rendimiento vestibulares equilibrio en un modelo murino de envejecimiento.
Abstract
Declive relacionado con la edad en el rendimiento balanza se asocia con el deterioro de la fuerza muscular, la coordinación motora y la función vestibular. Mientras que un número de estudios muestran cambios en el fenotipo equilibrio con la edad en los roedores, muy pocos aislar la contribución vestibular para equilibrar tanto en condiciones normales o durante la senescencia. Utilizamos dos pruebas de comportamiento estándar para caracterizar el desempeño equilibrio de los ratones en los puntos de edad definidos durante la vida útil: la prueba rotarod y la prueba de barra de equilibrio inclinado. Es importante destacar, sin embargo, un rotador hecha a la medida también se usa para estimular el sistema vestibular de los ratones (sin inducir signos manifiestos de la enfermedad de movimiento). Estas dos pruebas se han usado para mostrar que los cambios en el rendimiento vestibular-equilibrio mediada están presentes durante la vida útil murino. Los resultados preliminares muestran que tanto la prueba de rotarod y la prueba de barra de equilibrio modificada se pueden usar para identificar cambios en el rendimiento de equilibrio durante el envejecimiento como alternativa a la más diffictécnicas ult e invasivos tales como (VOR) mediciones vestíbulo-ocular.
Introduction
Nuestro sentido del equilibrio es tal vez uno de los componentes vitales aún más olvidadas de incluso las actividades motoras más básicos como el senderismo y el torneado. Balanza está influenciada por numerosos factores, incluyendo la fuerza muscular, coordinación motora y la función vestibular, y es sólo en la presencia de neuropatías vestibulares o durante el envejecimiento normal que se aprecia la importancia de un sistema de equilibrio pleno funcionamiento. Alteraciones en el sistema vestibular son frecuentemente asociados con experiencias de vértigo o mareo y el desequilibrio que resulta en un mayor riesgo de caídas y lesiones posteriores 1. Esto es particularmente crítico en las poblaciones de más edad, donde las caídas son una de las principales causas de lesiones 2.
Pruebas de la función vestibular se basan comúnmente en los reflejos vestibulares, en particular, el vestíbulo-ocular (VOR) o el reflejo vestíbulo-Collic (VCR). El VOR y VCR son esenciales para la estabilización de imágenes enla posición de la retina y la cabeza durante los movimientos de la cabeza y el cuerpo, respectivamente. Comúnmente, las mediciones VOR requieren la implantación invasivo de bobinas de búsqueda para medir los movimientos oculares o de seguimiento de vídeo de movimiento de los ojos 3. Este es un reto en ratones debido a la pequeña naturaleza del ojo del ratón y la dificultad en la detección de la pupila para el análisis de vídeo 3. Como una alternativa, el VCR ha sido utilizado para medir la estabilización de la cabeza en respuesta a los movimientos del cuerpo en ratones sin la necesidad de cirugía invasiva 4. A pesar de esto, pocos estudios se centran específicamente en cómo el sistema vestibular funciona como un todo y lo más importante cómo cambia durante el envejecimiento.
Para evaluar el desempeño global de la balanza de manera sencilla y no invasiva modificamos dos pruebas de comportamiento de uso común. Las pruebas de barra de equilibrio y rotarod inclinadas evaluar diferentes aspectos del rendimiento del motor en los roedores y en los estudios anteriores se han utilizado en una batería de pruebas para adquirir una completael perfil de la capacidad del motor. Esta capacidad puede ser afectado por la enfermedad o la modificación genética, y también es sensible a los procesos asociados con el desarrollo normal y el envejecimiento 5-7. A principios de trabajo utilizando el rotarod ha demostrado que la coordinación motora en ratones disminuye después de 3 meses de edad 8. Además, las ratas muestran déficits de la balanza notable con la edad en la prueba de barra de equilibrio 9.
En este trabajo se describe el uso de las pruebas rotarod y barra de equilibrio, en relación con un estímulo vestibular con el fin de desafiar el sistema vestibular y caracterizar el consiguiente impacto sobre el equilibrio en ratones jóvenes y mayores. Mientras que los métodos simples y no invasivos descritos no están diseñados como medidas independientes de la función vestibular periférica, que proporcionan una medida del comportamiento útil y simple para comparar los cambios celulares y subcelulares en múltiples etapas de procesamiento vestibular durante el envejecimiento normal en ratones.
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Protocol
1. Animales
- Los ratones (C57/BL6) de edades 1, 9, y 13 meses de edad se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Perth, Australia). Estos ratones fueron alojados en jaulas estándar de ratón en el Fondo para el Bosch de roedores en la Universidad de Sydney en un 12/12 horas de luz / oscuridad ciclo con acceso a alimentos y agua ad libitum. Los procedimientos que se describen a continuación fueron aprobados por la Universidad de Comité de Ética Animal Sydney.
- Traiga jaulas de ratón en la sala de pruebas antes de cada prueba durante 10 minutos para permitir ratones para aclimatarse al entorno de pruebas.
2. De Rotarod
- La instalación del equipo rotarod (Figura 1):
- Instale las espigas en cada carril del rodillo giratorio.
Nota: En este ejemplo, la rata tacos (70 mm de diámetro) se utilizan en lugar de las clavijas de ratón (32 mm de diámetro) para desalentar a los ratones de aferrarse a la espiga y la realización de "rotaciones pasivos" 10. - Postularion las plataformas de aterrizaje magnéticos en el cable situado en la parte inferior de cada carril de la rotarod asegurarse de que no están inclinando a tocar el suelo del rodillo giratorio y se colocan lo más cerca posible a la pared de la derecha magnética de cada carril sin tocarse.
Nota: Durante los ratones de prueba se requieren rotarod a caminar en una dirección hacia adelante para permanecer en los pasadores de rotación y aceleración. Cuando un ratón ya no es capaz de permanecer en la clavija, caen y se desplazan a la plataforma de aterrizaje que posteriormente se activa un sensor magnético. El tiempo necesario para caer de la espiga giratoria, las rpm del pasador en el momento de la caída y la distancia recorrida se calcula automáticamente para cada ratón y grabada en la pantalla de visualización en la parte delantera de la varilla rotatoria. - Deslice 2 paneles de plástico transparente en la parte frontal de cada carril rotarod con los paneles más cortos en la parte inferior y los paneles más largos por encima.
- Introduzca los parámetros de la prueba utilizando el teclado situado en la parte delantera del cilindro giratorio. Siga ªeps 2.1.4.1 a 2.1.4.6 para los parámetros de la prueba rotarod aceleración y pasos 2.1.4.7 a 2.1.4.12 para los parámetros de la prueba de velocidad fija rotarod.
- Establezca la duración máxima de la prueba a 60 segundos.
- Establecer el número de carriles que se utilizará (o el número de ratones que ser probado).
- Ajuste la velocidad de inicio de la prueba a 5 rpm.
- Ajuste la velocidad máxima de la prueba a 44 rpm.
- Ajuste la velocidad de rampa de la prueba a 60 segundos.
- Ajuste el tamaño de las clavijas elegidos y el sentido de giro a clavijas de rata que giran en una dirección hacia adelante.
- Establezca la duración máxima de la prueba a 240 seg.
- Establecer el número de carriles que se utilizarán en 1 como los ratones se prueban individualmente.
- Ajuste la velocidad de inicio de la prueba a 15 rpm.
- Ajuste la velocidad máxima de la prueba a 15 rpm.
- Ajuste la velocidad de rampa de la prueba a 0 seg.
- Ajuste el tamaño de la espiga elegido y la dirección de rotación a una espiga de rata gire en un forwadirección rd.
Nota: Los ajustes anteriores pueden ser modificados para adaptarse a las necesidades de los diferentes experimentos.
- Coloque una cámara en frente del rodillo giratorio para la prueba de rotarod de velocidad fija, de modo que el comportamiento del ratón durante los ensayos puede ser grabado y los videos utilizados para el análisis posterior para determinar la duración de tiempo que los ratones eran capaces de permanecer en el rotarod.
- Instale las espigas en cada carril del rodillo giratorio.
- Siga los pasos 2.2.1 al 2.2.4 para el test rotarod aceleración:
- Coloque un ratón en cada espiga estacionaria durante 5 min para permitir que los ratones se aclimaten a la rotarod.
- Empujar suavemente los ratones para hacer frente a la parte posterior del cilindro giratorio y empezar la prueba de rotarod cuando todos los sujetos se enfrentan en esta dirección (véase la Figura 1B).
- Volver a todos los ratones a sus jaulas cuando han caído de los pasadores de rotación y dejarlos en reposo durante 10 minutos con el acceso a alimentos y agua.
- Repita los pasos 2.2.1 al 2.2.3 para completar un total de 8 pruebas, asegurándose de limpiarlas clavijas, carriles, y las plataformas de aterrizaje de la rotarod para la orina y las heces, y mover las plataformas de aterrizaje de vuelta a su posición inicial Transcurrirá cada ensayo.
Nota: Los primeros 3-5 ensayos se utilizan como pruebas de entrenamiento para permitir que los ratones se familiaricen con la tarea. La hora a la baja, la distancia recorrida y las rpm del extremo de la espiga en el momento de la caída de cada ensayo posterior se registra para su posterior análisis (Figura 2).
- Siga los pasos 2.3.1 al 2.3.8 para el test rotarod velocidad fija:
- Coloque un ratón en una espiga durante 5 minutos para permitir que se aclimate a la rotarod. Devuelva el ratón de nuevo a su jaula.
- Inicie la grabación de vídeo en la cámara y pulse Inicio en el cilindro giratorio. A continuación, coloque el ratón en la espiga giratoria asegurar que se enfrenta a la parte posterior del cilindro giratorio.
- Detenga la grabación de vídeo de la cámara cuando el ratón se cae de las espigas giratorias, y devolver el ratón para sus jaulas durante 10 minutos con el acceso a alimentos y agua.
- Repita los pasos 2.3.2 y 2.3.3 hasta que se adquirió un total de 8 pruebas, asegurándose de limpiar las clavijas, carriles, y las plataformas de aterrizaje de la rotarod de las heces y la orina, y mover las plataformas de aterrizaje de vuelta a su posición de partida entre cada ensayo .
- Encienda el rotador costumbre construido a 3 Hz durante 20 segundos para permitir que los ratones se familiaricen con el sonido. Detenga el rotador tras 20 seg apagando el taladro y coloque una mano a cada lado de la rueda para correr a evitar que continúe a girar más allá del 20 seg inicial.
Nota: El rotador en sí consta de una rueda de roedor funcionamiento asegurado a un taladro (Figura 3A). En el centro de la rueda de funcionamiento es una pequeña cámara con una tapa de malla en el que el ratón se coloca (Figura 3B). El rotador gira en sentido contrario a las agujas del reloj alrededor del eje vertical. La magnitud del estímulo está en línea con los estudios anteriores que muestran estimulaciones giratorios que van de 0,2 a 3 Hz son suficientes para generarcomió respuestas VOR y VCR 4,11,12. - Coloque el ratón dentro de la cámara en el centro del rotor y reemplazar la tapa.
- Encienda el rotador en la posición mínima de 3 Hz durante 20 s. Inicie el rotarod y empezar a grabar vídeo en la cámara durante este tiempo en la preparación para el próximo juicio. Desconecte el taladro al final de los 20 segundos y coloque una mano a cada lado de la rueda de correr para que deje de girar. Vuelva a probar el ratón sobre el rodillo giratorio inmediatamente después transfiriéndola lo más rápido posible a la clavija giratoria.
- Detenga la grabación de vídeo de la cámara cuando el ratón se cae de la espiga y devolver el ratón a su jaula.
- Limpiar los paneles de plástico transparente con una mezcla de detergente suave / agua y las espigas cilíndricas, carriles y plataformas de aterrizaje de metal de la varilla rotatoria con etanol al 70% cuando todos los ratones han sido probados.
3. Barra de equilibrio con vestibular Desafío
- Configurar el baaparato de haz de la lanza como se ve en la Figura 4A.
Nota: El aparato de barra de equilibrio fue adaptado de un aparato descrito en Carter et al (2001) 13.. Para esta prueba, los ratones a pie desde el extremo inferior de la viga, que es 52,5 cm por encima del suelo, a una caja oscurecida objetivo (13 x 22 cm, con una puerta 5 cm x 6) situada 60 cm por encima del suelo (Figura 4A ). Los ratones naturalmente buscan la oscuridad y la protección de la caja de meta a favor de la viga expuesta y se anima más que atravesar el haz por la ligera inclinación que explota su mecanismo de escape natural para correr en una dirección hacia arriba 14. La viga en sí es 1 m de longitud y tiene una sección transversal circular con un diámetro de 14 mm. Una gama adaptada de diámetros de haz se puede utilizar que permite que el experimentador para ajustar la sensibilidad de la prueba o acomodar los sujetos más grandes. En el extremo inferior de la barra de equilibrio de una línea blanca indica la línea de salida. Otra línea ha sidodibujado 60 cm de la línea de salida en el extremo superior de la viga para indicar la línea de meta (Figura 4).- Posición 2 cámaras, una a cada lado de la barra de equilibrio, en el extremo inferior de la barra de equilibrio (Figura 4B).
Nota: Estas cámaras deben estar en ángulo para capturar toda la longitud de la barra de equilibrio y asegurar que las líneas de salida y llegada marcadas en la barra de equilibrio son claramente visibles. Estas cámaras se utilizan para grabar vídeo el comportamiento de los ratones a medida que atraviesan la barra de equilibrio, con los vídeos resultantes se utilizan para el análisis posterior. - Cubra el piso de la caja de la meta con una toalla de papel, para permitir una fácil limpieza de la orina y las heces después de probar cada ratón, y colocar el domo de la carcasa de la caja temas casa dentro del área chica.
- Coloque espuma adecuada u otro material de relleno debajo de la viga elevada a proteger a los sujetos que caen desde el aparato. Los ratones que caen serán recogidos inmediatamente por el experimentoer y colocado dentro del área chica para descansar.
- Posición 2 cámaras, una a cada lado de la barra de equilibrio, en el extremo inferior de la barra de equilibrio (Figura 4B).
- Coloque un ratón en el área chica durante 2 minutos para que se familiarice con este entorno. Cubra la apertura al área chica con una mano enguantada durante 5 segundos si el ratón trata de caminar sobre la viga durante este tiempo para desalentar este comportamiento.
- Capacitar al ratón, colocándolo en la viga a las afueras de la abertura de la caja de la meta y lo que le permite caminar en el área chica. Continuar entrenando el ratón, colocándolo en la viga progresivamente más lejos de la caja de la meta hasta que el ratón es capaz de caminar desde la línea de salida de la caja de la meta sin ayuda y la vacilación mínima. Deja el ratón para descansar en el área chica durante 1 minuto después de cada carrera.
- Comience evaluando el ratón cuando la formación se ha completado.
- Inicie la grabación de vídeo en cámaras.
- Coloque el ratón en la línea de salida de la viga y espere mientras se atraviesa el haz en la dirección del área chica.
- Detenga la grabación de vídeo en cameras cuando el ratón llega a la caja.
- Deja el ratón para descansar en el área chica durante 1 min. Retire cualquier resto de orina o de las heces que pueden haber sido depositados durante el juicio a la espera.
- Repita los pasos 3.4.1 a 3.4.4 hasta que se han completado un total de 5 ensayos.
- Encienda el rotador costumbre construido a 3 Hz durante 20 segundos (como en la prueba rotarod velocidad fija) para permitir que los ratones se familiaricen con el sonido. Detenga el rotador tras 20 seg apagando el taladro y coloque una mano a cada lado de la rueda de correr para que deje de girar.
- Coloque el ratón dentro de la cámara en el centro del rotor y reemplazar la tapa.
- Encienda el rotador en la posición mínima de 3 Hz durante 20 s. Inicie la grabación de vídeo de las cámaras durante este tiempo, en preparación para el próximo juicio. Desconecte el taladro al final de los 20 segundos y coloque una mano a cada lado de la rueda para correr para evitar que continúe a girar más allá del 20 seg inicial. Transfer el ratón para el inicio de la barra de equilibrio lo más rápido posible y espere mientras el ratón atraviesa el haz hacia la caja de la meta.
- Detenga la grabación de vídeo en cámaras cuando el ratón llega al área chica y devolver el ratón a su jaula.
- Limpie el aparato de barra de equilibrio con 70% de etanol y cambiar la toalla de papel en el área chica después de cada ratón se ha probado.
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Representative Results
Rotarod
El rendimiento del motor de los ratones fue descrito como el tiempo para quedarse (TTF) registrados para cada ratón sobre 8 ensayos. Usando estas mediciones de RSA, curvas de formación para cada ratón se pueden trazar. Figura 2 muestra ejemplos de la actuación del motor de un ratón 1 mes de edad, y uno 9 meses de edad, puntero del ratón sobre el curso de 8 ensayos. Estas curvas de formación muestran un aumento en TTF durante los primeros 3-5 ensayos seguido de una meseta posterior. Las mediciones de TTF registrados antes de la meseta se consideraron de formación (Figura 2), mientras que se registraron y se usaron para el análisis de datos (Figura 5) mediciones de TTF que forman la meseta.
La Figura 5 muestra que el rendimiento del motor en el cilindro giratorio se deteriora con la edad. En comparación con sus homólogos del mes de edad 9 (n = 8), ratones 1 mes de edad (n = 6) eran capaces de permanecer en el rotarod significativamente mayor (18,38 ± 4,66 Barra de equilibrio La figura 6 muestra los tiempos de atravesar (TTT) la barra de equilibrio y cruzar la línea de meta antes y después del estímulo vestibular durante 1 mes de edad, los ratones 9 meses de edad y 13 meses de edad. En meses de edad los ratones 1 (n = 9), el estímulo vestibular tenía un efecto mínimo en el tiempo necesario para que atraviesan el equilibrio con TTT similar antes (3,49 ± 0,62 seg) y después (3,81 ± 0,66 seg) el estímulo. En contraste, los ratones 9 meses de edad (n = 6) requiere más tiempo para recorrer la barra de equilibrio después del estímulo vestibular (4,85 ± 1,67 vs 8,45 ± 2,59 s; p <0,05, prueba t de Student). En meses de edad los ratones 13 (n = 5) TTT aumentó tras el estímulo vestibular (6,48 ± 2,19 vs 9,24 ± 4,11 sCE), pero esto no fue estadísticamente significativa. Para examinar más a fondo la interacción entre la edad y los cambios relacionados con estímulo-vestibulares en TTT utilizamos ANOVA de medidas repetidas con una prueba de Tukey post hoc. Figura 6 muestra que el impacto de la estimulación vestibular en el rendimiento de barra de equilibrio es significativamente mayor en los 9 meses de edad ( p <0,01) y 13 meses de edad (p <0,001) ratones en comparación con ratones de 1 mes de edad. En conjunto, estos resultados indican que el aparato de barra de equilibrio simple puede ser usado en conjunción con el rotador hecha a la medida para medir los cambios relacionados con vestibulares-en el rendimiento de equilibrio a lo largo de la vida útil murino. 05/51605fig3highres.jpg "/> 
Figura 1. El aparato de varilla rotatoria. (A) El aparato de varilla rotatoria tiene 5 carriles y es capaz de probar un máximo de 5 roedores en cualquier momento. El cylindrica l tacos (punta de flecha) sobre la que se colocan los ratones se sitúan por encima de las plataformas de aterrizaje de metal (*) que los sensores de presión de disparo para la adquisición de datos. (B) Una foto de un 1 mes de edad, ratón y un ratón de 9 meses que se sienta en las clavijas frente a la parte posterior de la varilla rotatoria en la preparación de una prueba. 
Figura 2. Curvas de formación rotarod. Un ejemplo de un ratón 1 mes de edad, y uno de 9 meses de edad, y sus medidas de tiempo para caer en el cilindro giratorio. Las mediciones de tiempo para caer en ambos ratones aumentaron constantemente durante los ensayos 1 a 5 y por lo tanto, se consideraron como ensayos de entrenamiento. Una vez estabilizados los ensayos (aumenta el rendimiento plateaued; línea discontinua) las mediciones de tiempo de caer se registraron para el análisis de datos.
Figura 3. El rotador hecha a la medida. (A) El rotador hecha a la medida se utiliza para estimular el sistema vestibular de los ratones. Este rotador consiste en un Dremel (punta de flecha) y una rueda de roedores corriendo (*). (B) Una vista superior del rotor. Los ratones se colocan dentro de la cámara (punta de flecha) en el centro de la rueda de funcionamiento. 
Aparato Barra de equilibrio Figura 4.. (A) El aparato de barra de equilibrio inclinada tiene una base de 80,3 cm de largo, con el inicio de la viga situada 52,5 cm por encima del suelo y el área chica (*) levantado 60 cm del suelo. (B ) El comportamiento de los ratones en la barra de equilibrio es registrada por dos cámaras colocadas en el extremo inferior de la viga. Los videos grabados proporciona la visión izquierda y derechas de los ratones a medida que atraviesan el haz y se utilizan para el análisis posterior. 
.. Figura 5 el rendimiento de Rotarod disminuye con la edad los ratones 1 mes de edad (n = 6) fueron capaces de permanecer en los pasadores de rotación significativamente más tiempo que los ratones 9 meses de edad (n = 8) (*, p <0,05). Los datos se representan como media ± DE. 
Figura 6. El impacto de la estimulación vestibular en el rendimiento de barra de equilibrio es mayor con la edad. Estimulación vestibular aumentó el tiempo para recorrer en 9 meses de edad (n = 6) y 13 meses de edad, los ratones (n = 5), pero no en 1 mes (n = 9) ratones de edad. Cuando la interacción entre la edad y los cambios relacionados con estímulo-vestibulares en TTT se evalúa el impacto de la estimulación vestibular en balrendimiento haz ción es significativamente mayor en los ratones 9 meses de edad, y 13 meses de edad, en comparación con los ratones de 1 mes de edad. Los datos se representan como media ± DE. *; p <0,05 **; p <0,01 ***; p <0,001.
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Discussion
Pasos críticos en el Protocolo
El trabajo previo ha demostrado que es fácil de overtrain ratones tanto en el cilindro giratorio y el aparato de barra de equilibrio y como consecuencia, la adquisición de mediciones precisas puede ser un reto 15. Por ejemplo, el sobreentrenamiento en el cilindro giratorio puede dar lugar a ratones intencionalmente saltar de los tacos durante los períodos de aclimatación y de ensayo, mientras que el sobreentrenamiento en la barra de equilibrio puede conducir a la parada más frecuentes (comportamiento exploratorio) y viajando en la dirección opuesta (es decir, hacia la la línea de salida) 15. En última instancia, el sobreentrenamiento puede conducir a una subestimación de la capacidad real del motor. Por tanto, es fundamental que las curvas de formación se evaluarán antes del análisis.
Otro paso fundamental dentro del protocolo rotarod es asegurar que los ratones se enfrentan a la dirección correcta (dirección opuesta a la rotación) antes de comenzar cada ensayo. Los ratones que se enfrenta la dirección equivocadación cuando las espigas comienzan a girar tienen dificultad para mantener el equilibrio en la espiga y por consiguiente caer temprano, lo que podría sobreestimar el impacto de la prueba. Además, en la prueba de barra de equilibrio, es importante para transferir los ratones lo más rápidamente posible desde el rotador de la barra de equilibrio como la recuperación de la desafío vestibular comienza inmediatamente. Esto puede significar que el desequilibrio causado por el rotor y la posterior reducción en el rendimiento puede ser subestimada.
Modificaciones y Solución de problemas
Se pueden hacer modificaciones a tanto el cilindro giratorio y la prueba de barra de equilibrio con el fin de alterar la sensibilidad de las pruebas. La prueba rotarod se puede modificar fácilmente para cambiar el nivel de dificultad de la tarea necesaria del motor para detectar déficits de la balanza y de motor. Esto se puede lograr mediante la manipulación de la velocidad a la que los pasadores giran durante la prueba, y también si o no estas rotaciones aceleran largo de la duración de la prueba. Para la prueba de barra de equilibrio diferentes anchos de haz se pueden usar para ajustar la sensibilidad de la prueba, con anchos de haz más pequeñas engendrando un nivel más alto de dificultad. Vigas con secciones transversales rectangulares también se pueden utilizar, aunque en un estudio anterior utilizando este enfoque, se demostró que los ratones fueron capaces de agarre en los lados de la viga que conducen a mediciones aberrantes de tiempo para recorrer 15. En tanto rotarod y pruebas viga de equilibrio, los ratones pueden ser impugnadas con el estímulo vestibular y ensayarse en el aparato hasta 3 veces. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los ratones son a menudo reticentes a completar la tarea después de someterse a la primera prueba con el estímulo vestibular.
Limitaciones
Las mediciones de equilibrio y la capacidad del motor puede verse afectada por el tamaño y el peso de los ratones individuales se están probando 14. Esto significa que hay una posibilidad de que el impacto de la edad en el rendimiento del motor puede ser aumentada por los efectos de losla gravedad y el centro de masa. De hecho, se ha demostrado que los ratones con la masa corporal relativamente más alta para llevar a cabo peor en la prueba de rodillo giratorio 16. La aplicación del rotador vestibular sin embargo minimiza el grado en que el desempeño equilibrio es confundida por el peso y facilita la atribución de prestaciones equilibrio al impacto del envejecimiento sobre el sistema vestibular.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes y Métodos Alternativos
Ha habido pocos estudios que investiguen directamente envejecimiento en el sistema vestibular de cualquier especie. Comúnmente estos estudios han utilizado el VOR para evaluar la función vestibular y han demostrado que la función VOR se conserva hasta 60 semanas de edad con sólo pequeños cambios después de la edad adulta se alcanza 17,18. Además pruebas VOR requieren normalmente un grado de invasividad para unir las bobinas de grabación a la córnea del animal, y a menudo requieren un período de recuperación 3. Debido al pequeño tamaño del ojo del ratón la alternativa más comúnmente utilizado, el seguimiento de los ojos de vídeo, también es difícil de lograr. En conjunto, estas dificultades han limitado el número de estudios de VOR en el modelo murino.
Los métodos descritos en este aparato de empleo de papel utilizan comúnmente para evaluar la coordinación motora y el equilibrio. Además, estos métodos se han utilizado para investigar los cambios que ocurren durante el desarrollo y el envejecimiento y las debidas a modificaciones genéticas 5,7,19,20. Como se ha demostrado la coordinación motora y el equilibrio a disminuir después de 3 meses de edad, el uso adicional de un estímulo vestibular simple en este documento facilita la investigación del sistema vestibular en un modelo murino de envejecimiento sin el uso de técnicas más difíciles e invasivos descrito anteriormente 8. Esta información puede entonces ser utilizada para correlacionar el comportamiento con los cambios celulares y subcelulares subyacentes que se producen en el sistema vestibular con la edad.
tep "> Aplicación Futuro o llegar después de dominar esta técnicaAunque los métodos descritos aquí no cuantifican el nivel de desequilibrio experimentado por el animal después de la rotación, más la aplicación de un estímulo vestibular puede ser modificado para incluir un sistema de puntuación basado en la presencia de síntomas como la micción, defecación y temblores 21. Otras formas de cuantificar la cantidad de desequilibrio experimentado por los ratones incluyen la medición de la sacarina y caolín captación como se muestra previamente 11,21. En última instancia, la capacidad de marcar el efecto vestibular relacionada con el envejecimiento en un ratón individual permite la investigación sobre las correlaciones entre el rendimiento de equilibrio y procesos celulares / subcelular utilizando posterior electrofisiológico, molecular y técnicas de microscopía de dos fotones 22.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotarod | IITC Life Science Inc. | #755 | "Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex. |
| iPhone | Apple | Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm. | |
| 3D articulated arm | Fisso/Baitella | Classic 3300-28 | Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment. |
| Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter | A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters | ||
| Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards | |||
| Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam. | Brace all joins with small steel brackets. | ||
| Black paint (water based) | Handycan | Acrylic Matt Black | 2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus |
| Clear finish | Wattle Estapol | Polyurethane Matt | Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus |
| Foam, packaging material | To cushion any falls from the balance beam | ||
| 70% Ethanol, paper towels | Clean beam and goal box between each animal. | ||
| Gauze pads/paper towels | To line the floor of the goal box | ||
| Mouse house (from home cage) |
References
- Agrawal, Y., et al. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Arch. Intern. Med. 169, 938-944 (2009).
- Schwab, C. W., Kauder, D. R. Trauma in the geriatric patient. Arch. Surg. 127, 701-706 (1992).
- Stahl, J. S., et al. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J. Neurosci. Methods. 99, 101-110 (2000).
- Takemura, K., King, W. M. Vestibulo-collic reflex (VCR) in mice. Exp. Brain Res. 167, 103-107 (2005).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J. Neurosci. 19, 3248-3257 (1999).
- Wallace, J. E., et al. Motor and reflexive behavior in the aging rat. J. Gerontol. 35, 364-370 (1980).
- Ingram, D. K., et al. Differential effects of age on motor performance in two mouse strains. Neurobiol. Aging. 2, 221-227 (1981).
- Serradj, N., Jamon, M. Age-related changes in the motricity of the inbred mice strains 129/sv and C57BL/6j. Behav. Brain Res. 177, 80-89 (2007).
- Gage, F. H., et al. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol. Aging. 5, 43-48 (1984).
- Rustay, N. R., et al. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behav. Brain Res. 141, 237-249 (2003).
- Xiaocheng, W., et al. Expression of calcitonin gene-related peptide in efferent vestibular system and vestibular nucleus in rats with motion sickness. PloS One. 7, (2012).
- Beraneck, M., et al. Ontogeny of mouse vestibulo-ocular reflex following genetic or environmental alteration of gravity sensing. PloS One. 7, (2012).
- Carter, R. J., et al. Motor coordination and balance in rodents. Curr. Protoc. Neurosci. , (2001).
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10, 519-529 (2009).
- Luong, T. N., et al. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- McFadyen, M. P., et al. Differences among eight inbred strains of mice in motor ability and motor learning on a rotorod. Genes Brain Behav. 2, 214-219 (2003).
- Shiga, A., et al. Aging effects on vestibulo-ocular responses in C57BL/6 mice: comparison with alteration in auditory function. Audiol. Neurootol. 10, 97-104 (2005).
- Stahl, J. S. Eye movements of the murine P/Q calcium channel mutant rocker, and the impact of aging. J. Neurophysiol. 91, 2066-2078 (2004).
- Fahlstrom, A., et al. Behavioral changes in aging female C57BL/6 mice. Neurobiol. Aging. 32, 1868-1880 (2011).
- Bâ, A., Seri, B. V. Psychomotor functions in developing rats: ontogenetic approach to structure-function relationships. Neurosci. Biobehav. Rev. 19, 413-425 (1995).
- Yu, X., et al. A novel animal model for motion sickness and its first application in rodents. Physiol. Behav. 92, 702-707 (2007).
- Tung, V. W., et al. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
