Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تطوير أميلوجينين-الشيتوزان هيدروجيل ل Published: July 10, 2014 doi: 10.3791/51606
Automatic Translation
1, 1
1Center for Craniofacial Molecular Biology, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

Summary

في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكول للافتعال وهيدروجيل-أميلوجينين الشيتوزان لإعادة الإعمار المينا سطحية. نظمت النمو الموضع من بلورات الأباتيت في هيدروجيل في تشكيل واجهة المينا استعادة الكثيفة، التي من شأنها تحسين فعالية ومتانة الترميم.

Protocol

تم استخراج الأضراس الإنسان وفقا للإجراءات القياسية لاستخراج في كلية طب الأسنان OSTROW من جامعة جنوب كاليفورنيا، والتعامل معها على موافقة مجلس المراجعة المؤسساتي.

1. إعداد الأسنان حمض محفورا-شريحة

  1. تحديد الضرس الثالث الإنسان دون أي تسوس المستعادة.
  2. إزالة جزء جذر ضرس، وقطع تاج الرحى طوليا إلى شرائح سميكة 2 مم باستخدام سرعة منخفضة ورأى الماس المياه المبردة. بالموجات فوق الصوتية تنظيف هذه الشرائح لمدة 2 دقيقة، ثم شطف لهم مع الماء منزوع الأيونات 3 مرات.
  3. لمحاكاة آفات التآكل، حفر شرائح الأسنان مع 30٪ حامض الفوسفوريك لمدة 30 ثانية ثم شطف على الفور لهم مع الماء منزوع الأيونات.
  4. بالموجات فوق الصوتية تنظيف شرائح محفورا لمدة 2 دقيقة، ثم شطف لهم مع الماء منزوع الأيونات 3 مرات.

2. إعداد أميلوجينين-الشيتوزان هيدروجيل

  1. محضراتن من محلول المخزون الشيتوزان
    1. حل 1٪ (ث / ت) الشيتوزان (الوزن الجزيئي المتوسط، 75-85٪ deacetylated) في 1٪ (V / V) حل حامض الخليك تليها اثارة في 80 ° CO / N.
    2. بعد التبريد الحل لRT، تحديد الحل الشيتوزان باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 5.0 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم 1 M حل.
  2. إعداد الكالسيوم والفوسفات محلول المخزون (0.1 M)
    1. تزن من كلوريد الكالسيوم (و CaCl 2) وإعداد 0.1 M الحل، ثم مزيج باستخدام الدوامة حتى الحل واضح. ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 11 بإضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم الحل.
    2. تزن من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (نا 2 هبو 4) وإعداد 0.1 M الحل، ثم مزيج باستخدام الدوامة حتى الحل واضح.
  3. التعبير وتنقية أميلوجينين المؤتلف 17-18
    كامل طول أميلوجينين الخنازير المؤتلف (rP172) تستخدم هنا لديها 172 الأحماض الأمينية وهو التناظرية من الكاملطول الأم الخنازير P173، ولكن تفتقر إلى ميثيونين N-محطة فضلا عن مجموعة الفوسفات على Ser16 18.
    1. إضافة 20 غرام من استذابة مرق (LB) آجار مسحوق في 500 مل منزوع الأيونات الماء، الأوتوكلاف الحل في درجة حرارة 121 مئوية (الإعداد السائل) لمدة 20 دقيقة. السماح لتبرد أجار إلى ~ 55 درجة مئوية، إضافة الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) في حل أجار.
    2. نقل الحل أجار إلى أطباق بتري، والسماح كل لوحة باردة حتى صلبة، ثم الوجه لتجنب التكثيف على أجار. لوحات مخزن في أكياس بلاستيكية في 4 درجات مئوية.
    3. خط لوحة آغار LB مع الخلايا المؤتلف (القولونية-BC21) من الأسهم الجلسرين (-80 درجة مئوية). احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية.
    4. تحضير 50 ​​مل من وسائل الإعلام NZCYM والأوتوكلاف وسائل الإعلام في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. السماح لوسائل الإعلام ليبرد، إضافة 50 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين إلى 50 مل سائل الإعلام.
    5. تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة LB أجار في وسائل الإعلام 50ML NZCYM تستكمل مع ampicillفيها احتضان الخلايا O / N في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية.
    6. تحضير 1 لتر من وسائل الإعلام NZCYM والأوتوكلاف وسائل الإعلام في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 1 مل من 100 ملغ / مل الأمبيسلين إلى 1،000 مل سائل الإعلام. تأخذ الكثافة الضوئية (OD) القراءة باعتبارها فارغة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيز. ملاحظة: لا تجاهل هذا بعد القراءة الأولى.
    7. تطعيم 10 مل من ثقافة الخلية من الخطوة 2.3.5 إلى 1،000 مل سائل الإعلام من الخطوة 2.3.6. قراءة الكثافة البصرية في 595 نانومتر مباشرة بعد التلقيح. أخذ القراءة الكثافة البصرية بشكل دوري للحفاظ على مسار النمو. ملاحظة: اقرأ فارغة في كل مرة يتم أخذ OD.
    8. حمل مع 700 ميكرولتر من الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG، 1 M) عندما يصل نمو البكتيريا إلى حوالي 0.75 ~ 0.8 OD في 595 نانومتر.
    9. حصاد الخلايا عندما يصل OD 1.1. صب محتويات القارورة في 6 زجاجات من البلاستيك. تحقيق التوازن وتزن الزجاجات قبل باستخدام أجهزة الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 8،554 XG في 4 درجات مئوية.الحفاظ على بيليه خلية في -20 درجة CO / N.
    10. إخراج الكريات الخلايا والجمع بينهما في أنبوب 50 مل. إضافة 3.5 مل من حمض الهيدروكلوريك في 4M الجوانيدين L التخمر. مرات يصوتن 2-3 على الجليد، 30 ثانية في كل مرة، مع فترات 1 دقيقة.
    11. جعل التخفيفات 6X من حجم الخلية مع حمض الفورميك بنسبة 0.5٪ والسماح لها ضجة في غرفة باردة لمدة 2 ساعة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة، 8،554 XG في 4 درجات مئوية. إبقاء طاف. إضافة 20٪ كبريتات الأمونيوم المشبعة باستخدام محلول المخزون المشبعة وضجة في غرفة باردة، O / N.
    12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة، 8،554 x ج في 4 درجات مئوية والحفاظ على بيليه. إعادة تشكيل الكريات في حمض 0.1٪ trifluoroacetic (TFA)، والحمل على العمود C4 (10 × 250 مم، 5 ميكرون)، ويجزئ باستخدام الانحدار الخطي من A = 0.1٪ TFA و B = 60٪ في أسيتونتريل TFA، في معدل 1.5 مل · دقيقة -1 التدفق.
    13. تجميد الحل البروتين على الجليد الجافة والمجمدة يجفد عينة O / N.
  4. إعداد أميلوجينين-الشيتوزان (CS-AMEL) hydrogش (الشكل 1A)
    1. إضافة 200 ميكروغرام من rp172 في أنبوب يحتوي على 960 ميكرولتر من 1٪ من محلول الشيتوزان، ثم مزيج باستخدام الدوامة حتى الحل واضح.
    2. إضافة 25 ميكرولتر من 0.1 م 2 و CaCl حل تليها 15 ميكرولتر من 0.1 M نا 2 هبو 4 الحل في حل الشيتوزان التي تحتوي على أميلوجينين، ثم مزيج باستخدام الدوامة لمدة 5 دقائق.
    3. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل CS-AMEL إلى 6.5 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم M 1 بعناية الحل. سوف CS-AMEL هيدروجيل تشكل عندما تصل قيمة الرقم الهيدروجيني 6.5.

3. المينا اعادة استزراعها في أميلوجينين-الشيتوزان هيدروجيل

  1. إعداد الحل اللعاب الاصطناعي
    1. تذوب كمية معينة من كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2، 0.2 ملم)، وكلوريد الكالسيوم (و CaCl 2، 1 ملم) والبوتاسيوم هيدروجين فوسفات (KH 2 PO 4، 4 ملم)، وكلوريد البوتاسيوم (بوكل، 16 ملي) وكلوريد الأمونيوم ( NH 4 CL، 4.5 ملم) في 20 ملي HEPES(4 - (2-هيدروكسي إيثيل) بيبرازين-1-الإيثان السلفونيك حمض) العازلة 12.
    2. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم وتخزين الحل اللعاب الاصطناعي في 4 درجات مئوية.
    3. قبل استخدام الحل، إضافة فلوريد الصوديوم (ناف، و 300 جزء في المليون).
  2. تطبيق CS-AMEL هيدروجيل
    1. تطبيق حوالي 20 ميكرولتر CS-AMEL هيدروجيل إلى شريحة الأسنان محفورا باستخدام حقنة (1B الشكل).
    2. تجفيف شريحة الأسنان المغطاة هيدروجيل في مجفف في RT لمدة 2 ساعة.
    3. نقل شريحة الأسنان إلى دورق يحتوي على 30 مل من محلول اللعاب الاصطناعي. تغطية الكأس بورق الألمنيوم، ومن ثم الحفاظ على الكأس في الفرن عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
    4. إزالة شريحة الأسنان وجففه في مجفف في RT.

4. توصيف واجهة بين طبقة المينا ونمت حديثا

كان المجهرية واجهة بين طبقة المينا نمت حديثا واملالحظاتفيد بواسطة المجهر الإلكتروني (SEM) والثورة عالية لنقل المجهر الإلكتروني (HR-TEM). تم إعداد العينة TEM باستخدام شعاع ايون مركزة (فيبوناتشي) تقنية، والخطوات التي هي كما يلي.

  1. تحميل العينة إلى أداة الاكذوبه ووزارة شؤون المرأة والانتهاء من جميع التحالفات وفقا للتعليمات التشغيل. ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ التعديل Z الجميلة 2 مرات على الأقل.
  2. إيداع طبقة الكربون (15 × 3 ميكرون) على عينة لحماية البنية الأساسية (الشكل 2A).
  3. طاحونة العينة بعناية في الجانبين العلوي، وانخفاض وحق طبقة الكربون لإعداد قطعة رقيقة من العينة، ومن ثم خفض الجانب السفلي من هذا قطعة رقيقة. ملاحظة: تحقق من محاذاة شعاع ايون قبل كل خطوة الطحن (الشكل 2B).
  4. لحام طرف حزب العمال على قطعة رقيقة وخفض الجانب الأيسر لفصل العينة قطعة (الشكل 3C). ملاحظة: تحقق من محاذاة شعاع ايون قبل الخطوة اللحام.
  5. اخراج رانه حزب العمال تلميح مع العينة ببطء، وتركيب رقائقي نموذج الصعود إلى الشبكة تيم رفع التدريجي.
  6. فصل غيض من العينة، والعينة رقيقة حتى سمكه أقل من 100 نانومتر (الشكل 3D). إزالة عينة من أداة لتنفيذ المراقبة TEM. ملاحظة: تحقق من محاذاة شعاع ايون قبل كل عملية ترقق.

5. تقييم خصائص وتجليد والميكانيكية للطبقة نمت حديثا

  1. ويتم تقييم قوة ملزمة عن طريق العلاج بالموجات فوق الصوتية. الحفاظ على شريحة الأسنان إصلاحه في نظافة بالموجات فوق الصوتية (42 كيلو هرتز، 100 W) لمدة 10 دقيقة، ومن ثم مراقبة واجهة بين طبقة المينا وإصلاحه الطبيعية مع تحليل SEM المرتدة الإلكترون.
  2. قياس صلابة ومعامل مرونة في 20 نقطة الاختبار على كل سطح المينا إصلاحه (ن = 3) من قبل نانو إندينتر مع طرف بركوفيتش.

6. المناعي تلطيخ

  1. غسل الأسنان مع شريحة تريس العازلهص المالحة (TBS) لمدة 15 دقيقة.
  2. منع 1٪ مع ألبومين المصل البقري (BSA) في TBS لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة السائل واحتضان العينة O / N ° 1 مع أب (1:500 الدجاج مكافحة أميلوجينين) مخففة في TBS (0.1٪ BSA، 0.3٪ تريتون X-100).
  4. غسل العينة مع TBS لمدة 30 دقيقة واحتضان O / N ° 2 مع أب (1:100 مكافحة الدجاج FITC) مخففة في TBS.
  5. غسل العينة مع TBS لمدة 30 دقيقة وتترك لتجف لمدة 30 دقيقة أخرى.
  6. مراقبة بواسطة المجهر مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأظهرت فعالية بروتوكول الموصوفة هنا عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، اختارت منطقة حيود الإلكترون (سعيد) وحيود الأشعة السينية (XRD) يحلل. بعد الترميم من قبل أميلوجينين-الشيتوزان (CS-AMEL) هيدروجيل لمدة 7 أيام، وتشكلت طبقة المينا مثل بسماكة 15 ميكرون على سطح المينا محفورا. وقدم طبقة نمت حديثا من صفائف أمر غاية من البلورات التي يبلغ قطرها 50 نانومتر ~، وتزايد بشكل تفضيلي على طول المحور ج، عمودي على سطح (الأسهم في الشكل 3A). من الجدير بالذكر أن نظمت هذه البلورات مثل إبرة في حزم، والتي هي مماثلة للوحدات الأساسية للالمينا الطبيعية (الشكل 3B). وSAED نتيجة لطبقة إصلاحه عرضت نمط على شكل قوس يكشف عن تشكيلة هرمية من بلورات نمت حديثا على طول [002] الاتجاه (الشكل 3C). أكد تحليل XRD أن طبقة نمت حديثا كان يتألف من الأباتيتالبلورات، والتي كانت تتماشى على طول المحور ج البلورات، وفقا لوزارة شؤون المرأة وSEAD الملاحظات (الشكل 3D).

ويبين الشكل 4 المجهرية واجهة بين طبقة نمت حديثا والمينا الطبيعية. لاحظ أن بلورات لم تنمو في نفس الاتجاهات كما البلورة المينا الأصلي. ويمكن أن نرى أن النمو الأباتيت بوساطة البروتين أدى إلى التوجه عمودي من بلورات نمت حديثا نسبة إلى بلورات المينا الطبيعية (الشكل 4A). وقد عرضت آليات إصلاح المقترحة بما في ذلك استقرار مجموعات كا ف والتي تبلور تنظيم اللاحقة أميلوجينين في دراستنا السابقة 16. وقد كشفت التمييز بين البلورات التي تشكلت حديثا والأصلي من تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس) تحليل أنماط مختلفة والتي أظهرت مشيرا الى ان البلورات في المينا وطبقة إصلاحه تنصهر نمت معالتوجه مختلفة 16. وعلاوة على ذلك، ليس هناك فجوة واضحة في واجهة بين طبقة إصلاحه والركيزة المينا. في المقياس النانوي، والمينا وبلورات بإعادة تنمية تنصهر معا لتشكل واجهة سلسة (السهام السوداء في الشكل 4B).

تم تقييم قوة الترابط بين طبقة المينا وإصلاحه عن طريق العلاج الطبيعي بالموجات فوق الصوتية 16. بعد صوتنة لمدة 10 دقيقة، وطبقة نمت حديثا شكلت في هيدروجيل CS-AMEL كان لا يزال بإحكام على سطح المينا (الشكل 5A)، وكان الحفاظ على هيكل المنظمة (الشكل 5B). للعينة تعامل مع هيدروجيل الشيتوزان دون أميلوجينين، ومع ذلك، لوحظ وجود فجوة كبيرة بين المينا وطبقة إصلاحه بعد العلاج بالموجات فوق الصوتية (الشكل 5C).

التمييز بوضوح بين طبقة نمت حديثا والمينا الطبيعية، وأميلوجينين في الجديدةوقد نمت طبقة لاي-المناعي المسمى. وقد تجلى حضور أميلوجينين من قبل المناعي الخضراء في طبقة نمت حديثا (الشكل 6).

وقد تم تحليل الخواص الميكانيكية مثل الصلابة ومعامل مرونة طبقة نمت حديثا من قبل اختبار nanoindentation 16. كما هو مبين في الشكل 7، بعد حمض النقش انخفض صلابة ومعامل سطح المينا تقريبا 98٪ و 88٪ على التوالي. وأظهرت المجموعة الضابطة يعامل بها هيدروجيل الشيتوزان دون أميلوجينين فقط تحسن محدود في كل من صلابة ومعامل. في المقابل، بعد تمعدن في هيدروجيل CS-AMEL، لاحظنا زيادة ما يقرب من 4 مرات في معامل و 9 مرات في صلابة.

الشكل 1
الرقم 1. صور من أميلوجينين-الشيتوزان (CS-AMEL) ح ydrogel. (A) صورة نموذجية CS-AMEL هيدروجيل. (B) تطبيق هيدروجيل CS-AMEL على شريحة الأسنان حمض محفورا.

الرقم 2
الشكل 2. نموذجي عملية تركز أيون شعاع لإعداد عينة تيم. (A) ترسب طبقة الكربون على إصلاح سطح المينا. (B) الطحن العينة بعناية حول طبقة الكربون لإعداد قطعة رقيقة من العينة. (C) لحام طرف حزب العمال على قطعة رقيقة. (D) ترقق العينة حتى سمكها أقل من 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

5IN "سرك =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 3. توصيف طبقة نمت حديثا بعد تمعدن في أميلوجينين الشيتوزان هيدروجيل لمدة 7 أيام. (A) وبعد 7 أيام من تمعدن مع أميلوجينين الشيتوزان هيدروجيل، طبقة المينا مثل تشكلت على سطح المينا محفورا. يظهر أقحم سمك طبقة نمت حديثا؛ المستطيل يظهر المنطقة المقابلة لA. السهام البيضاء تدل على توجهات الأباتيت في طبقة نمت حديثا. تم العثور على (B) حزم من بلورات المنظمة داخل طبقة إصلاحه. تشير الأسهم إلى حزمة نموذجية من البلورات موازية داخل طبقة نمت حديثا. أقحم يظهر على السطح طبقة متجانسة إصلاحه. (C) منطقة مختارة حيود الإلكترون (سعيد) صورة طبقة نمت حديثا. أقحم يبين TEM صورة طبقة إصلاحه من قبل مركزة شعاع ايون (فيبوناتشي) الطحن إعداد (D) XRD أطياف طبقة نمت حديثا بعدتمعدن في هيدروجيل-أميلوجينين الشيتوزان لمدة 7 أيام. مستنسخة بإذن من المرجع 16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. المجهرية من واجهة بين طبقة نمت حديثا والمينا الطبيعية. (A) المقطع العرضي SEM صورة طبقة إصلاحه بعد إعادة التمعدن في أميلوجينين الشيتوزان هلام لمدة 3 أيام، والتي تبين طبقة نمت حديثا تنصهر إلى سطح المينا الطبيعية. السهام البيضاء والسوداء تشير إلى التوجهات البلورات من البلورات في طبقة نمت حديثا والمينا الطبيعية، على التوالي. يظهر خط منقط حدود المينا الطبيعية وطبقة نمت حديثا. (B) صورة HRTEM من أمورمواجهة بين المينا والكريستال إنمائها، والتي تبين النمو السلس للإصلاح الكريستال على المينا. السهام السوداء تشير إلى واجهة بين البلورات بإعادة تنمية والمينا. مستنسخة بإذن من المرجع 16.

الرقم 5
الرقم 5. تجليد القوة بين طبقة نمت حديثا وسطح المينا. (أ) صورة الإلكترون المرتدة من المقطع العرضي، و (ب) صورة الإلكترون الثاني من سطح طبقة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، نمت حديثا حصلت مع الشيتوزان أميلوجينين هيدروجيل. يظهر أقحم التشكل نموذجية من السطح في التكبير العالي. (C) صورة الإلكترون المرتدة من المقطع العرضي للطبقة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، نمت حديثا تم الحصول عليها مع هيدروجيل الشيتوزان دون أميلوجينين. مستنسخة بإذن من المرجع 16. <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" الهدف = "_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. الصور الإسفار من المقطع العرضي للطبقة نمت حديثا. مستطيل في وتمثل المنطقة المختارة الموافق B. الأسهم في B تشير إلى طبقة نمت حديثا على سطح المينا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. صلابة وELASمعامل التشنج المينا صحية، المينا محفورا، والمينا التي أعيد بناؤها إصلاحه من قبل هيدروجيل الشيتوزان مع وبدون أميلوجينين. كانت المنطقة البادئة على غرار ما تم الإبلاغ سابقا 19. مستنسخة بإذن من المرجع 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في حين أن المحتوى المعدني من المينا وعالية مما يجعلها أصعب الأنسجة المعدنية في جسم الإنسان، وهذا هو bioceramic عرضة لعمليات التنقية، والتي تحدث في كثير من الأحيان كما تسوس الأسنان أو التآكل. طفرات الجينات يمكن أيضا أن يسبب المينا رقيقة أو ناعمة مما يؤدي إلى سلسلة من الأمراض الموروثة من المينا تشوه دعا تخلق الميناء الناقص 20. وكانت منتجات الرعاية الصحية عن طريق الفم المحتوية على الفلورايد أو CPP-ACP في السوق لعدة سنوات (أي والورنيش، وغسولات الفم ومعاجين الأسنان) لتعزيز إعادة التمعدن المينا للآفات الأولية. ومع ذلك، فإن أيا من هذه المنتجات المتاحة تجاريا لديها القدرة على تشجيع تشكيل بلورات الأباتيت المنظمة. العلاجات التقليدية للتجاويف عميقة تنطوي على المينا الحفر الميكانيكية وملء لاحقة مع المواد الاصطناعية مثل ملغم، السيراميك أو الراتنج المركب. مثل هذا النهج ليست مثالية للآفات المبكر والحالات ع كبيرقمة شرق اسيا تآكل تحدث على المينا. وذلك لأن كمية غير متناسبة من المينا صحية يجب إزالة جلب المزيد من الأضرار التي لحقت الأسنان. راتنجات الملغم والمركب 'اصلاح' مؤقتة فقط الأسنان والحشوات مثل هذه عادة لا تتوقف تسوس الأسنان و. التصاق قوي بين الأصلي سطح الأسنان وذلك من مواد الحشو هو التحدي بسبب الانكماش المادية والاختلافات في التركيب الكيميائي والمجهرية.

مزايا CS-AMEL هيدروجيل

استراتيجية واحدة بديلة للتغلب على التحديات المذكورة أعلاه هي لتنمو طبقة المينا مثل مباشرة على سطح المينا الأصلي عند ضيق الاتصال الكيميائية إلى الركيزة الطبيعية يمكن تشكيلها. في هذه المقالة الفيديو، ونحن تقديم استراتيجية إعادة الإعمار المينا الرواية التي يستخدم-أميلوجينين الشيتوزان (CS-AMEL) هيدروجيل أن تنمو بلورات المنظمة في المختبر على سطح المينا. مقارنة مع غيرها من محطات الصرف الصحي بيوميمتيكاليلة، CS-AMEL هيدروجيل هو أسهل للتحضير للاستخدام السريري. بالإضافة إلى توافق مع الحياة والتحلل البيولوجي، له خصائص مضادة للميكروبات والتصاق فريدة من نوعها التي تعتبر مهمة لتطبيقات طب الأسنان 16. ميزة أخرى هي أن واجهة قوية بين الاصطناعية وبلورات المينا الطبيعية تعزز الترابط القوي بين طبقة نمت حديثا وسطح الأسنان. في طب الأسنان السريري ضعف الترابط هو السبب الرئيسي لفشل استعادة المواد المتاحة حاليا. التصاق الفقراء النتائج عادة في الفجوات في واجهة المينا الترميم، والتي تزيد من خطر لتسرب البكتيريا وتسوس الثانوية. وبالتالي، فإن التعلق القوي للطبقة نمت حديثا شكلت في هيدروجيل CS-AMEL لديه القدرة على تجنب تشكيل تسوس جديدة على هامش ترميم وتحسين متانة الترميم.

التحديات والخطط المستقبلية

بعد الترميم التي كتبها amهيدروجيل elogenin-الشيتوزان، الخواص الميكانيكية للسطح المينا محفورا تحسنت بشكل ملحوظ. أظهرت CS-AMEL-إصلاحه هيدروجيل المينا أكبر بكثير صلابة ومعامل مرونة من عينات السيطرة بسبب حزم نظمت من بلورات الأباتيت مماثلة لبنية المينا 21. ولكن هذه التقنية للقيود التالية: (ط) صلابة ومعامل تزال لا تلبي مستوى المينا الصحية الطبيعية بسبب وجود المواد العضوية وعدم وجود هيكل المنشورية-المواشير heirarchial؛ (ب) هناك حاجة إلى الكمية طويلة من الوقت (3-7 أيام) لتجفيف هيدروجيل وتمعدن لإكمال.

وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات للتغلب على القيود المذكورة أعلاه. واحد استراتيجية ممكنة لتحسين الخواص الميكانيكية أن يكون التطبيق المتكرر لCS-AMEL هيدروجيل باعتبارها وسيلة فعالة للحصول على طبقة أكثر سمكا إصلاحه. هضم المواد العضوية أثناء عملية تمعدن سترا أخرىtegy لتحسين الخواص الميكانيكية. التجارب جارية لاختصار الوقت تجفيف هيدروجيل فضلا عن التقدم تمعدن 22. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من الضروري تطوير نظام نموذجي تسوس التي تمثل آثار البروتينات اللعابية على النمو وضوح الشمس.

خطوات حاسمة والعوامل

في إعداد هيدروجيل CS-AMEL لإعادة الإعمار المينا، واحدة من أهم الخطوات الحاسمة لتحقيق طبقة المينا مثل مع واجهة كثيفة يتم ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني للهيدروجيل بسبب التفاعل تعتمد على درجة الحموضة بين الشيتوزان وأميلوجينين 16. الشيتوزان هو السكاريد سلسلة خطية تضم الجلوكوزامين وN-أسيتيل بقايا الجلوكوزامين انضمت معا بواسطة β-1 ،4-غليكوزيدية السندات. لأن المجموعات الأمينية، والخواص الكيميائية والفيزيائية للالشيتوزان يمكن ضبطها من خلال تغيير قيم درجة الحموضة وسائل الإعلام. على سبيل المثال، في نظام CS-AMEL، في قيم درجة الحموضة أقل، جتفاعلت مع hitosan أميلوجينين من خلال التفاعل الكهربائي، ولكن في درجة الحموضة أعلى من 5.5، وكان التفاعل الشيتوزان ضعيفة بسبب ذوبانه منخفضة ونزع بروتون 16. هذه الميزة يجعل درجة الحموضة الاستجابة هيدروجيل الشيتوزان ليس فقط حاملة أميلوجينين مثالية، ولكن أيضا طبقة المينا فعالة حماية من التآكل. في بيئة الفم الحمضية، يمكن للمجموعة الأمينية من الشيتوزان التقاط أيونات الهيدروجين، وتشكيل حاجز إيجابية لمنع انتشار أيونات الهيدروجين على سطح المينا، فضلا عن التفاعل مع أميلوجينين لتجنب خسارتها في اللعاب. عند استعادة الحموضة الطبيعية عن طريق اللعاب يتم تحرير أميلوجينين من CS-AMEL هيدروجيل للسيطرة على إعادة نمو المينا.

خلال إعادة نمو المينا، وجود أميلوجينين يشكل عاملا حاسما في السيطرة على نمو المنحى وممدود من بلورات الأباتيت. في هيدروجيل CS-AMEL، وقبل التنوي كا ف مجموعات، استقرت من قبل أميلوجينين والركام لتشكيل لينسلاسل الأذن مما يزيد من الصمامات مع بلورات المينا، وفي نهاية المطاف تحول إلى بلورات الأباتيت مثل المينا 16،23-24. استمرار نمو بلورات يشكل واجهة كثيفة، والتي تروج لسندات ممتازة بين طبقة نمت حديثا والمينا.

باختصار، نحن نقدم لأميلوجينين-الشيتوزان (CS-AMEL) هيدروجيل واعدة لإعادة الإعمار المينا سطحية. المجهرية مثل المينا نظمت شكلت في هيدروجيل يمكن أن تحسن بشكل كبير من الخواص الميكانيكية للالمينا محفورا؛ وفي الوقت نفسه، المرفق القوي للطبقة اصلاحها ويمكن تجنب تشكيل تسوس جديدة على هامش ترميم ويحتمل تحسين متانة الترميم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human third molar  Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California  N/A The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board.
Recombinant pocine amelogenin Expression and purification  in lab N/A rP172, full-length 
Chitosan  Sigma-Aldrich 448877 Medium molecular weight, 75-85% deacetylated
Phosphoric acid  VWR AA033266
Acetic acid glacial VWR A036289
Sodium hydroxide VWR BDH9292
Calcium chloride  Sigma-Aldrich 223506
Dibasic sodium phosphate anhydrous VWR BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP  Agilent Technologies Inc. 230255
Ammonium sulfate VWR BDH8001
Trifluoroacetic acid VWR AAAL06374
Acetonitrile VWR BDH1103
Magnesium chloride  VWR BDH0244
Potassium dihydrogen phosphate  VWR BDH9268
Potassium chloride  VWR BDH0258
Ammonium chloride  VWR AAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) VWR AAA14777
Sodium fluoride  VWR AA11561
Tris-buffered saline Bio-Rad 170-6435 10× TBS
Bovine serum albumin EMD Millipore  12659 CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals 
Triton X-100 EMD Millipore  TX1568-1
Chicken Anti-Amelogenin N/A N/A A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California
Bovine Anti-Chicken IgY-FITC Santa Cruz Biotechnology Sc-2700
High Performance Liquid Chromatography System Agilent Technologies Inc. Varian Prostar 210
C4 column Phenomenx  Jupiter 5μ 300A
Scanning Electron Microscopy  JEOL  JSM-7001
FIB-SEM  JEOL  JIB-4500
Transmission Electron Microscopy  JEOL JEM-2100F
Digital low speed diamond saw MTI Corporation SYJ-150
Fluorescence microscopy Leica DMI3000 B
Ultrasonic cleaner  Branson  2510 42 kHz, 100 W
Nano-indenter  Agilent Technologies Inc. MTS XP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
  2. Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
  3. Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
  4. Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
  5. Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
  6. Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
  7. Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
  8. Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
  9. Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
  10. Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
  11. Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
  12. Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
  13. Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
  14. Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
  15. Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
  16. Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
  17. Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
  18. Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
  19. Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
  20. Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
  21. Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
  22. Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
  23. Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
  24. Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 89، المينا، أميلوجينين، الشيتوزان هيدروجيل، الأباتيت، المحاكاة البيولوجية، تآكل والتعمير المينا السطحية، واجهة الكثيفة
تطوير أميلوجينين-الشيتوزان هيدروجيل ل<em&gt; في المختبر</em&gt; إعادة نمو المينا مع واجهة الكثيفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruan, Q., Moradian-Oldak, J.… More

Ruan, Q., Moradian-Oldak, J. Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface. J. Vis. Exp. (89), e51606, doi:10.3791/51606 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter