Summary
在这篇文章中，我们描述了一个协议，用于制造釉原蛋白，壳聚糖水凝胶浅表性搪瓷重建。组织在磷灰石晶体在水凝胶原位生长形成致密的搪瓷恢复界面，这将提高修复体的有效性和持久性。
Protocol
人类的臼齿提取以下在南加州大学牙奥斯特鲁夫学校的标准程序提取，并与机构审查委员会的批准处理。
1，酸腐蚀牙齿的制备切片
- 选择一个人第三磨牙没有任何恢复龋齿。
- 取出摩尔的根部，并切断摩尔的冠纵切成片2mm厚使用水冷式低速金刚石锯。超声波清洗这些片2分钟，然后用去离子水冲洗一下3倍。
- 以模拟糜烂性病变，蚀刻牙片，用30％磷酸，持续30秒，然后立即冲洗它们与去离子水。
- 超声波清洗蚀刻片2分钟，然后用去离子水冲洗一下3倍。
2，釉原蛋白的制备壳聚糖水凝胶
- 准备事项n个壳聚糖原液
- 溶解1％（重量/体积），脱乙酰壳多糖（中分子量75-85％的脱乙酰化），在1％（V / V）的乙酸溶液中，随后在80℃的CO / N搅拌
- 将溶液冷却至室温后，用0.45μm的过滤器过滤脱乙酰壳多糖溶液。通过加入1M NaOH溶液将pH值调节至5.0。
- 钙与磷酸盐贮备液的制备（0.1M）
- 称出氯化钙（ 氯化钙 ）和制备的0.1M溶液，然后混合使用涡旋直至溶液澄清。通过加入1M NaOH溶液将pH值调节到11。
- 称取磷酸氢二钠（的Na 2 HPO 4）和制备的0.1M溶液，然后混合使用涡旋直至溶液澄清。
- 表达和重组釉原蛋白17-18的净化
这里所用的重组全长猪釉原蛋白（rP172）具有172个氨基酸，并且是充分的模拟长度的天然猪P173，但缺乏N-末端蛋氨酸，以及对Ser16 18上的磷酸基团。- 加20克溶原性肉汤（LB）琼脂粉末到500ml去离子水，高压灭菌20分钟，将溶液在121℃（液体设置）。让琼脂冷却到〜55℃，加入氨苄青霉素（100微克/毫升）放入琼脂溶液。
- 转移琼脂溶液至培养皿，让每个板冷却，直到它是固体，然后翻转，以避免在琼脂凝结。店板块在塑料袋在4°C
- 条纹的LB琼脂平板上以从甘油原液的重组细胞（ 大肠杆菌 -BC21）（-80℃）。孵育板O / N，37°C。
- 准备50毫升NZCYM媒体和高压灭菌介质在121℃，30分钟。允许介质冷却，加50微升的100微克/毫升氨苄青霉素容量为50毫升的媒体。
- 从LB琼脂平板上接种单菌落到辅以ampicill置50ml NZCYM媒体在37°C英寸孵育的细胞O / N在振荡培养箱
- 准备1升NZCYM媒体和高压灭菌介质在121℃，30分钟。加入1毫升100毫克/毫升的氨苄青霉素至千毫升媒体。采用了光学密度（OD）的阅读与使用紫外可见分光光度计的空白。注意：一读后不要丢弃此。
- 接种从步骤2.3.5将10ml细胞培养物的成千毫升媒体从步骤2.3.6。接种后立即读出的光密度在595nm处。取的光密度读数定期跟踪生长的影响。注：外径取每次阅读的空白。
- 诱导用700微升异丙醇-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG，1M）的当细菌生长达到约0.75〜0.8 OD在595nm处。
- 收获细胞，当外径达到1.1。倒入烧瓶中的内容复制到6的塑料瓶。平衡，并使用离心机前权衡瓶。离心20分钟，8,554×g离心，在4°C。保持细胞沉淀在-20℃的CO / N。
- 取出细胞沉淀，并将其合并在一个50毫升管。添加3.5毫升4M盐酸胍的每升发酵。每次声处理2-3次，在冰上，30秒，以1分钟的间隔。
- 使细胞体积与0.5％甲酸6倍稀释，让它在寒冷的房间2小时搅拌。离心30分钟，8,554 XG在4°C。保留上清液。加入20％饱和硫酸铵使用饱和原液，搅拌在寒冷的房间，O / N。
- 离心30分钟，8554×g离心，在4℃，并保持颗粒。重建在0.1％三氟乙酸（TFA），负载粒料上的C4柱（10×250毫米，5微米），并分馏使用A = 0.1％TFA和B中的TFA = 60％乙腈的线性梯度洗脱，在一个流速1.5ml·分钟-1率。
- 冻结干冰的蛋白质溶液和冻干的冷冻样品的O / N。
- 釉原蛋白，壳聚糖的制备（CS-AMEL）hydrogEL（ 图1A）
- 加200 rp172微克到含有960微升的1％脱乙酰壳多糖溶液的管，然后混合使用涡旋直至溶液澄清。
- 加25微升0.1M的氯化钙溶液中，接着加入15μl0.1M的磷酸氢二钠溶液与含釉原蛋白，脱乙酰壳多糖溶液，然后混合使用涡旋5分钟。
- 通过仔细加入1M NaOH溶液调节CS-AMEL溶液至6.5的pH值。当pH值达到6.5的CS-AMEL水凝胶会形成。
3，搪瓷愈合中釉原蛋白，壳聚糖水凝胶
- 人工唾液溶液的制备
- 溶解一定量的氯化镁（MgCl 2的，0.2毫摩尔），氯化钙（ 氯化钙 ，1毫摩尔），磷酸二氢钾（KH 2 PO 4，4毫摩尔），氯化钾（氯化钾，16毫摩尔）和氯化铵（ 氯化铵 ，4.5毫摩尔）在20毫米肝素钠（4 - （2 -羟乙基）哌嗪-1 -乙烷磺酸）缓冲液中12。
- 调节pH值至7.0 1 M氢氧化钠和人工唾液溶液储存在4℃
- 使用该溶液前，加入氟化钠（NaF，为300ppm）。
- 的CS-AMEL水凝胶的应用
- 应用约20微升CS-AMEL水凝胶，以使用注射器（ 图1B）经蚀刻的齿片。
- 干燥的水凝胶覆盖的齿切片在干燥器中于室温搅拌2小时。
- 牙片转移到含有30毫升人工唾液溶液的烧杯中。用铝箔覆盖烧杯中，然后保持该烧杯在烘箱中在37℃下7天。
- 去除牙片和干燥在干燥器中于室温。
4，新生长层和搪瓷之间的接口特性
的新生长层和搪瓷之间的界面的微观结构是安装前后通过扫描电子显微镜（SEM）和高转速透射电子显微镜（HR-TEM）粘弹性阻尼器。在TEM样品，用聚焦离子束（FIB）技术，为此，如下所示的步骤制备。
- 样品装入一个FIB-SEM的仪器，并根据操作指示完成所有的路线。注：细Ž调整应至少进行2次。
- 沉积在样品上的碳层（15×3微米），以保护下面的结构（ 图2A）。
- 磨小心将样品在碳层的上，下，右两侧，以制备薄片样品，然后切断该薄片的底侧。注：每个铣步骤（ 图2B）之前，请先检查离子束对准。
- 在薄片焊接的Pt尖和剪切左侧分开的样品片（ 图3C）。注意：焊接步骤之前，请检查离子束对准。
- 提起出吨他PT与样品尖慢，安装片状样品到电梯出TEM网格。
- 分离来自样品的尖端，而薄的样品，直到它的厚度小于100纳米（ 图3D）。从仪器上取下样品进行TEM观察。注：每个细化的过程之前，请检查离子束对准。
新生长层的绑定和力学性能的影响5。评估
- 的结合强度是通过超声波处理进行评估。保持牙齿修复片在超声波清洗机（42千赫，100 W）处理10分钟，然后观察修复层和天然牙釉质与背散射电子扫描电镜分析之间的接口。
- 测量的硬度和弹性模量在每个修复牙釉质表面20个测试点（N = 3）由纳米压痕具有Berkovich压头。
6，免疫荧光染色
- 用Tris buffe洗齿片Ř盐水（TBS）15分钟。
- 用1％牛血清白蛋白（BSA）在TBS中阻断15分钟。
- 除去液体并孵育样品O / N 1°抗体（1:500鸡抗釉原蛋白）稀释在TBS（0.1％BSA，0.3％的Triton X-100）。
- 样品用TBS 30分钟洗净，并培育O / N 2°抗体（1:100抗鸡FITC）稀释在TBS。
- 样品用TBS 30分钟洗净，留下干燥30分钟。
- 通过荧光显微镜观察。
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Representative Results
这里描述的协议的有效性证明用扫描电子显微镜（SEM），选择区域电子衍射（SAED）和X-射线衍射（XRD）分析。修复由牙釉质蛋白 - 壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶7天之后，形成在蚀刻釉质表面的搪瓷状层的厚度为15微米的。新生长层呈结晶的高度有序阵列的直径为约50 nm，优选沿c轴生长，垂直于表面（ 图3A中箭头）。值得注意的是，这些针状晶体被组织成束，这是类似天然牙釉质（ 图3B）的基本单位。修补层的选区电子衍射结果显示出一个弧形图案显露沿[002]方向（ 图3C）的新生长的晶体的分层对应。 X射线衍射分析证实该新生长层由磷灰石的晶体，将其沿所述晶体的c-轴排列，根据扫描电子显微镜和选区电子衍射的观察（ 图3D）。
图4示出了新生长层和天然釉质之间的界面的微观结构。注意，该晶体在相同的方向为原来的搪瓷晶粒不生长。可以看出，该蛋白介导的磷灰石增长导致相对于天然牙釉质的晶体（ 图4A）新生长的晶体的一垂直方位。建议的修复机制包括钙磷集群的稳定和其随后举办的釉原蛋白结晶已经呈现在我们以前的研究16。新形成的和原来的晶体之间的区别已被发现通过快速傅立叶变换（FFT）分析，这表明不同的图案，表明在釉质和熔融修复层中的晶体生长不同方向的16。此外，存在于界面处的修补层和搪瓷衬底之间没有明显的间隙。在纳米级，搪瓷和再生长的晶体熔融在一起，形成无缝接口（在图4B中黑色箭头所示）。
修复的层和天然牙釉质间的粘合强度，通过超声波处理16进行评估。超声处理10分钟后，形成在CS-AMEL水凝胶的新生长层仍然紧紧地结合于牙釉质表面（ 图5A），以及组织结构被保留下来（ 图5B）。对于壳聚糖水凝胶治疗无釉原蛋白样品，然而，搪瓷和修复层之间有很大的差距，观察下面的超声处理（ 图5C）。
到新生长层和天然牙釉质，在新的釉原蛋白之间的明确区分LY生长层，免疫荧光标记。釉原蛋白的存在证明了绿色免疫新生长层中（ 图6）。
机械性能，如硬度和新生长层的弹性模量是由纳米压痕试验16进行分析。 如图7，下列酸蚀刻牙釉质表面的硬度和弹性模量分别下降了将近98％和88％。壳聚糖水凝胶无釉原蛋白治疗，对照组仅表现在硬度和弹性模量有限的改善。相比之下，矿化CS-AMEL水凝胶后，我们观察到增长了近4倍，模量和硬度9倍。
图1中釉原蛋白，壳聚糖（CS-AMEL）H照片 ydrogel一个典型的CS-AMEL水凝胶（A）图片（B）上的酸蚀刻牙片对CS-AMEL水凝胶的应用。
图2典型的聚焦离子束过程的TEM样品制备。 （一）沉积在修复牙釉质表面的碳层（B）仔细铣削样品周围的碳层来制作一块薄薄的样品（C）焊接在一块薄薄的铂一角。（四）细化样本直到它的厚度小于100纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3。表征矿化牙釉质蛋白-壳聚糖水凝胶7天以后新生长层。 （A）经过7天 的矿化与釉原蛋白-壳聚糖水凝胶，所形成的刻蚀牙釉质的表面上的搪瓷状层。插图显示新生长层的厚度;矩形显示对应于A的面积。白色箭头表示的新生长层中的磷灰石方向。被发现已修复的层内的有组织的结晶（B）的分发包。箭头指向的新生长层内晶体并联一个典型的捆绑。插图显示了修复层的均匀表面。新生长层（C）的选区电子衍射（SAED）图像。插图给出了通过聚焦离子束（FIB）铣削修复层的TEM图像（D）X射线衍射后新生长层的光谱矿化在釉原蛋白，壳聚糖水凝胶为7天。转载自参考16的许可。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图4。组织的新生长层和天然牙釉质之间的接口。修补层的再矿化中釉原蛋白-壳聚糖凝胶3天，表现出新生长层熔合到天然牙釉质的表面后（A）的横截面SEM图像。白色和黑色箭头表示晶体的晶体取向的新生长层和天然釉质中，分别。间的虚线示出了天然牙釉质和新生长层的界面（B）高分辨图像面对牙釉质和再生长的晶体之间，表现出对修复牙釉质晶体的无缝增长。黑色箭头表示再生长和釉质的晶体之间的界面处。转载自参考16的许可。
图5。绑定新生长层和釉质表面之间的实力。的横截面，和（B）与壳聚糖釉原水凝胶而得到的超声波处理的新生长层的表面上的第二电子图像（A）的背散射电子图像。插图显示该表面的典型形态在更高的放大倍率（C）没有牙釉质蛋白与壳聚糖水凝胶而得到的超声波处理的新生长层的横截面的背散射电子图像。转载自参考16的许可。<A HREF =“https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg”目标=“_blank”>请点击这里查看该图的放大版本。
的新生长层的横截面的图6。荧光图像。矩形中A表示对应于B中的选定区域。 B中的箭头表示在釉质表面新生长层。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7。硬度和ELAS健康的牙釉质，腐蚀牙釉质，并重建珐琅质壳聚糖水凝胶带和不带釉原蛋白修复的抽动模量。缩进面积为类似于先前已报道19。转载与引用16的许可。
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Discussion
而牙釉质的矿物质含量高使得它在人体中最硬的矿化组织，这种生物陶瓷是易受除盐处理，这往往会出现龋齿或侵蚀。基因突变也可导致薄或软珐琅导致一系列的釉质畸形称为牙釉质发育不全20的遗传性疾病。含氟化物或CPP-ACP的口腔保健产品已在市场上几年（ 即 ，清漆，牙膏和漱口水），以促进初始釉质龋再矿化。然而，没有这些市售品，有促进组织磷灰石晶体的形成的潜力。深搪瓷腔的传统治疗方法包括机械钻孔和随后的填充人工材料，如银汞合金，陶瓷或复合树脂。这样的做法是不理想的早期病变和情况下，当大型AR侵蚀EAS发生在牙釉质。这是因为健康的牙釉质不成比例必须拆除令到牙齿更大的伤害。银汞合金和复合树脂只是暂时的“修复”牙齿与这种馅料通常不会阻止牙齿的蛀牙。原来牙齿表面，并且在填充物之间的粘附健壮是因为材料收缩而在化学成分和微观结构的不同的挑战。
CS-AMEL水凝胶的优势
为了克服上述难题之一的替代策略是再生搪瓷状层，直接到时可以形成紧密的化学接触到的天然底物的原釉质表面。在这个视频文章中，我们提出一个使用釉原蛋白，壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶在搪瓷表面生长的晶体组织在体外一种新型搪瓷重建战略。与其他仿生treatme相比NTS，CS-AMEL水凝胶是更容易为临床使用做准备。除了 生物相容性和生物降解性，它具有独特的抗菌和粘接性能，这对于牙科应用16重要。另一个优点是，合成的和天然釉质晶体之间的强大的接口促进了新生长层与牙齿表面之间的强键合。在临床牙科弱粘结是一个主要的原因目前可用的材料的恢复失败。附着力差通常会导致差距在搪瓷恢复界面，这就增加了细菌渗漏和继发龋的风险。因此，强大的附着形成在CS-AMEL水凝胶的新生长层具有避免新龋齿的形成在修复的边缘和改善修复体的耐久性的可能性。
挑战和未来计划
由维修点之后elogenin - 壳聚糖水凝胶，经蚀刻的釉质表面的机械性能得到明显改善。在CS-AMEL水凝胶修复牙釉质表明，由于类似釉质结构21磷灰石晶体的组织束显著硬度较大，比对照样品的弹性模量。然而该技术具有下列限制：（ⅰ）的硬度和弹性模量仍然不符合天然健康釉质的水平，由于有机材料和缺乏heirarchial棱柱interprismatic结构的存在; （二）时间的延长量（3-7天），需要干燥的水凝胶和矿化完成。
还需要进一步研究，以克服上述局限性。一种可能的策略，以改善机械性能将是CS-AMEL水凝胶的重复应用，以获得较厚的修复层的有效方法。有机材料在矿化过程消化是另一个斯特拉tegy用于改善机械性能。实验正在进行中，以缩短该水凝胶的干燥时间以及矿化进展22。此外，有必要开发出占唾液蛋白对晶体生长的影响的龋模型系统。
关键步骤和因素
在制备CS-AMEL水凝胶搪瓷重建，用于与密接口实现的搪瓷状层中最关键的步骤之一是调节水凝胶的pH值由于脱乙酰壳多糖和釉原蛋白16之间的pH依赖性相互作用。脱乙酰壳多糖是一种直链多糖，包括葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺残基通过β-1，4 - 糖苷键连接在一起。因为它的氨基基团，脱乙酰壳多糖的化学和物理性质可以通过改变介质的pH值进行调整。例如，在一个CS-AMEL系统，在较低pH值，Chitosan互动与釉原蛋白通过静电相互作用，然而在pH值高于5.5时，脱乙酰壳多糖的相互作用是弱的，由于其低溶解性和去质子化16。这种pH值的响应特性使得壳聚糖水凝胶不仅是一个理想的釉原蛋白的载体，也是一种有效的保护层牙釉质不受侵蚀。在酸性的口腔环境中，脱乙酰壳多糖的氨基可以捕获氢离子，形成正屏障，以防止氢离子扩散至釉质表面，以及与釉原蛋白相互作用，以避免其损失到唾液。当正常的酸碱度是由唾液恢复釉原蛋白是从CS-AMEL水凝胶释放控制牙釉质的再生长。
于搪瓷再生，釉原蛋白的存在是在控制磷灰石晶体的导向和细长生长的关键因素。在CS-AMEL水凝胶，预成核钙磷集群，由釉原蛋白，聚合稳定化，以形成临耳链，进一步保险丝与牙釉质晶体，并最终转换成在搪瓷像磷灰石晶体16,23-24。晶体的连续生长形成了一个致密的界面，促进了新生长层和搪瓷之间极好的粘结。
综上所述，我们介绍一个有前途的釉原蛋白，壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶浅表性搪瓷重建。形成于所述水凝胶中的有组织的搪瓷状微观结构可以显著提高蚀刻牙釉质的机械性能;同时，强大的附件修理层能避免新的龋齿形成的恢复保证金，并潜在地提高修复体的耐用性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
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