Summary
이 문서에서는, 우리는 표면의 에나멜 재건을위한 유전자 성별 감식 - 키토산 하이드로 겔을 제조하는 프로토콜을 설명합니다. 하이드로 겔의 인회석 결정의 현장 성장 조직은 수복물의 효율성과 내구성을 향상하는 조밀 한 에나멜 복원 인터페이스를 형성했다.
Protocol
인간의 어금니는 남부 캘리포니아 대학의 치과의 스트로우 학교에서 추출을위한 표준 절차에 따라 추출 및 기관 검토위원회의 승인을 처리했다.
1. 산 - 에칭 치아의 준비 조각
- 복원 된 모든 충치가없는 사람의 세 번째 어금니를 선택합니다.
- 어금니의 뿌리 부분을 제거하고, 길이 방향으로 두께 수냉식 저속 다이아몬드 톱을 사용하여 조각 2mm에 몰의 왕관을 잘라. 초음파로 2 분 동안이 조각을 청소 한 다음 탈 이온수로 3 회를 씻어.
- , 미란 성 병변을 시뮬레이트 30 초 동안 30 % 인산으로 치아 슬라이스 에칭 후 즉시 탈 이온수로 헹구어.
- 초음파로 2 분 동안 에칭 조각을 청소 한 후 탈 이온수로 3 회를 씻어.
성별 감정 - 키토산 하이드로 겔의 2. 준비
- 촬영 준비키토산 원액 N
- 1 % 녹여 80 ° CO / N.에서 교반하여 1 % (v / v) 아세트산 용액 (w / v) 키토산 (중간 분자량 75-85% 탈 아세틸)
- RT로 용액을 냉각 한 후, 0.45 μm의 필터를 사용하여 키토산 용액을 고를. 1 M NaOH 용액을 첨가하여 5.0으로 pH 값을 조정한다.
- 칼슘과 인산 원액의 제조 (0.1 M)
- 염화칼슘 (염화칼슘)를 밖으로 달아 0.1 M 용액을 제조 한 후 솔루션가 선명해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 1 M NaOH 용액을 첨가하여 11 pH 값을 조정합니다.
- 인산 수소 나트륨 인산염 (Na 2 HPO 4)을 칭량하고 0.1 M 용액을 제조하고 용액을 클리어 할 때까지 소용돌이를 사용하여 혼합한다.
- 표현과 재조합 유전자 성별 감식 17-18의 정화
여기에 사용되는 재조합 전체 길이 돼지 유전자 성별 감식 (rP172)는 172 개의 아미노산을 가지고 있으며, 전체의 아날로그길이 네이티브 돼지를 P173 만 N-말단 메티오닌 등 Ser16 18 인산기 결여.- , 탈 이온수 500 ㎖에 Lysogeny 국물 (LB) 한천 가루 20g을 추가 20 분 동안 121 ° C (액체 설정)에서 솔루션을 압력솥. ~ 55 ° C가, 한천 용액에 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 추가 한천 멋진하자.
- 중후 때까지 각 판은 식지, 페트리 접시에 한천 솔루션을 전송 한 후 한천에 응축을 방지하기 위해 플립. 4 ° C에서 비닐 봉투에 보관 판
- 글리세롤 재고 재조합 세포 (대장균-BC21)와 행진 LB 한천 플레이트 (-80 ° C). 37 ° C에서 접시 O / N을 품어
- NZCYM 미디어 50 ㎖를 준비하고 30 분 동안 121 ° C에서 미디어를 압력솥. 미디어가 식을 때까지 허용, 50 ㎖ 미디어에 100 ㎍ / ㎖의 암피실린 50 μl를 추가합니다.
- ampicill 보충 50 ㎖ NZCYM 미디어에 LB 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 접종높은 37 ℃에서 진탕 배양기에서 세포를 O / N을 품어
- NZCYM 미디어 1 L를 준비하고 30 분 동안 121 ° C에서 미디어를 압력솥. 1,000 ml의 미디어에 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 1 ML을 추가합니다. UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 빈으로 광학 밀도 (OD) 측정 값이 표시됩니다. 참고 : 첫 번째 독서 후이를 폐기하지 마십시오.
- 단계 2.3.6에서 1,000 ml로 미디어에 2.3.5 단계에서 세포 배양의 10 ㎖를 접종한다. 즉시 접종 후 595 nm에서 광학 밀도를 참조하십시오. 성장을 추적하기 위해 주기적으로 광학 밀도의 측정 값이 표시됩니다. 참고 : OD이 촬영 될 때마다 빈을 읽어보십시오.
- 박테리아의 성장은 595 nm에서 약 0.75 ~ 0.8 OD에 도달 할 때 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG, 1 M) 700 μL로 유도한다.
- OD가 1.1에 도달하면 세포를 수확. 6 패트병로 플라스크의 장입 물을 붓는다. 균형과 원심 분리기를 사용하기 전에 병을 무게. 4 ° C에서 8,554 XG에 20 분 동안 원심 분리-20 ° CO / N.에 세포 펠렛을 유지
- 세포 알약을 꺼내 50 ㎖ 튜브에 그들을 결합. 발효의 L 당 4M 구아니딘 염산의 3.5 ML를 추가합니다. 1 분 간격으로 얼음, 30 초에 초음파 처리 2 ~ 3 시간마다.
- 0.5 % 포름산과 세포 부피의 6 배 희석을 확인하고 2 시간 동안 추운 방에 저어 보자. 4 ℃에서 30 분, 8,554 XG에 원심 분리기 뜨는을 유지합니다. 추운 방에서 포화 원액과 파문을 사용하여 20 % 포화 황산 암모늄을 추가, O / N.
- 4 ° C에서 30 분, 8,554 XG에 원심 분리기와 펠렛을 유지합니다. C4 칼럼 (10 × 250mm, 5 μM)에 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 부하의 펠릿을 재구성하고,이면 TFA에서 A = 0.1 % TFA 및 B = 60 % 아세토 니트릴의 선형 구배를 사용하여 분별 1.5 ML · 분 -1의 유량.
- 드라이 아이스에 단백질 용액을 동결 및 냉동 샘플 O / N을 냉동 건조
- 유전자 성별 감식 - 키토산의 제조 (CS-AMEL) hydrog엘 (그림 1A)
- 200 ㎍의 rp172을 1 % 키토산 용액 960 μl를 함유하는 튜브에 가입 한 후 용액이 클리어 될 때까지 소용돌이를 사용하여 혼합한다.
- 유전자 성별 감식 함유 키토산 용액에 0.1 M 나 2 HPO 4 용액을 15 μL 다음 0.1 M 염화칼슘 용액 25 μl를 추가하고 5 분 동안 소용돌이를 사용하여 섞는다.
- 정중 1 M NaOH 용액을 첨가하여 6.5 CS-AMEL 용액의 pH를 조정한다. pH 값이 6.5에 도달 할 때 CS-AMEL 하이드로 겔이 형성됩니다.
성별 감정 - 키토산 하이드로 겔 3. 에나멜 재성장
- 인공 타액 용액의 조제
- 특정 염화 마그네슘의 양 (MgCl2를, 0.2 ㎜), 칼슘 염화물 (염화칼슘, 1 ㎜), 인산이 수소 칼륨 (KH 2 PO 4, 4 ㎜), 염화칼륨 (KCl을 16 ㎜) 및 염화 암모늄 (디졸브 20 mM의 HEPES에있는 NH 4 망할 CIA, 4.5 ㎜)(4 - (2 - 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1 - 에탄 술폰산) (12)를 버퍼링.
- 1 M NaOH로 7.0으로 산도를 조정하고 4 ℃에서 인공 타액 솔루션을 저장
- 용액을 사용하기 전에, 불화 나트륨 (NaF로, 300 PPM)를 추가한다.
- CS-AMEL 하이드로 겔의 응용 프로그램
- 주사기 (그림 1B)를 사용하여 에칭 치아 슬라이스 약 20 μL CS-AMEL 하이드로 겔을 적용합니다.
- 2 시간 동안 실온에서 데시 케이 터에서 하이드로 겔 덮인 치아 조각을 건조.
- 인공 타액 용액 30 ㎖를 함유하는 비이커에 치아 슬라이스 전송. 알루미늄 호일로 비커를 덮고, 그 후에을 7 일 동안 37 ° C의 오븐에서 비커를 유지합니다.
- 치아 조각을 제거하고 실온에서 건조기에 건조.
새로 성장 층과 에나멜 사이의 인터페이스 4. 특성
새로 성장 층과 멜 계면의 미세 구조는 obser이었다전자 현미경 (SEM) 및 높은 회전 투과 전자 현미경 (HR-TEM)을 주사함으로써 VED. TEM 샘플은 집속 이온 빔 (FIB) 기술은 다음과 같이되어있는 절차를 사용하여 제조 하였다.
- FIB-SEM 악기로 샘플을로드하고 운영 지침에 따라 모든 정렬을 마무리합니다. 참고 : 미세 Z 조정이 최소 2 번 수행해야합니다.
- 기본 구조 (그림 2A)를 보호하기 위해 샘플에 탄소 층 (15 × 3 μm의) 보증금.
- 공장은 탄소 층의, 상하과 오른쪽에서 조심스럽게 샘플은 샘플의 얇은 조각을 준비하고, 다음이 얇은 조각의 바닥면을 잘라. 참고 : 각 분쇄 공정 (그림 2B) 전에 이온 빔 정렬을 확인합니다.
- 용접 백금 얇은 조각에 팁과 샘플 조각 (그림 3C)를 분리하기 위해 왼쪽을 잘라. 참고 : 용접 단계 이전에 이온 빔 정렬을 확인합니다.
- 티셔츠를 들어 올려그는 천천히 샘플 팁 및 리프트 아웃 TEM 그리드에 층상 샘플을 탑재 PT.
- 두께가 100nm 이하 (그림 3D)가 될 때까지 샘플과 팁, 얇은 샘플을 분리합니다. TEM 관찰을 수행하는 기기에서 샘플을 제거합니다. 참고 : 각 숱이 프로세스가 완료되기 전에 이온 빔 정렬을 확인합니다.
새로 성장 층의 바인딩 및 기계적 성질 5. 평가
- 결합력은 초음파 처리에 의해 평가된다. 10 분 동안 초음파 세척기 (42 kHz에서, 100 W)에 수리 치아 슬라이스 유지하고 후방 산란 전자-SEM 분석을 수리 층과 천연 에나멜 사이의 계면을 관찰한다.
- 각 수리 에나멜 표면에 20 테스트 포인트 (N = 3) 베르 코 비치 팁과 나노 압입에 의해에서 경도와 탄성 계수를 측정한다.
6. 면역 형광 염색법
- 트리스 buffe와 치아 조각을 세척15 분 동안 R 식염수 (TBS).
- 15 분 동안 TBS에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단.
- 액체를 제거하고 TBS (0.1 % BSA, 0.3 % 트리톤 X-100)에 희석 1 ° AB (1:500 치킨 안티 성별 감정)를 이용하여 시료의 O / N을 배양한다.
- 30 분 TBS와 함께 샘플을 세척하고 TBS에 희석 2 ° AB (1:100 안티 닭 FITC)와 O / N을 품어.
- 30 분 TBS와 함께 샘플을 세척하고 또 다른 30 분 동안 건조 둡니다.
- 형광 현미경으로 관찰한다.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜의 효과는 전자 현미경 (SEM), 선택 영역 전자 회절 (SAED) 및 X 선 회절 (XRD) 분석을 스캔에 의해 입증된다. 칠일위한 유전자 성별 감식-키토산 (CS-AMEL) 하이드로 겔에 의한 수리 후, 15 ㎛의 두께를 에나멜 조의 층이 에칭 된 에나멜 표면에 형성 하였다. 새로 성장 된 층 (도 3a의 화살표) 표면에 수직 인 C 축을 따라 우선적으로 성장하고, 50 ~ nm의 직경이 결정의 고도로 정렬 된 배열을 만들었다. 이들 침상 결정이 천연 에나멜 (그림 3B)의 기본 단위와 유사하다 번들로 구성되었다는 것을 주목할 필요가있다. 수리 층의 SAED 결과는 [002] 방향 (도 3c)을 따라 새로 성장 된 결정의 계층 적 정렬을 드러내는 호형 패턴을 나타내었다. XRD 분석은 새로 성장 된 층을 아파타이트로 이루어지는 것이 확인SEM 및 SEAD 관측 (도 3d)에 따라, 결정 학적 C-축을 따라 정렬 된 결정.
도 4는 새로 성장 층 및 천연 에나멜 간의 인터페이스의 미세 구조를 보여준다. 결정이 원래 에나멜 결정자와 같은 방향으로 성장하지 않았다고합니다. 이는 단백질 - 매개 아파타이트 성장 천연 에나멜 결정 (도 4a)에 대하여 새롭게 성장한 결정의 수직 방향의 결과임을 알 수있다. CA-P 클러스터의 안정화 및 유전자 성별 감식에 의해 그들의 이후의 조직 결정을 포함하여 제안 된 복구 메커니즘은 우리의 이전의 연구 (16)에 제시되었다. 새로 설립 및 기존 결정 사이의 차이점은 에나멜과 융합 수리 층의 결정과 성장을 나타내는 서로 다른 패턴을 보여 주었다 (FFT) 분석을 고속 푸리에 변환에 의해 밝혀졌다다른 방향 16. 또한, 복구 된 법랑 층과 기판 사이의 계면에서 명백한 차이가 없다. 나노 스케일에서, 에나멜과 재성장 결정 (그림 (b)에서 검은 색 화살표) 원활한 인터페이스를 형성하기 위해 함께 융합.
수리 층과 천연 에나멜 간의 접합 강도가 초음파 처리 (16)에 의해 평가 하였다. 10 분 동안 초음파 처리 한 후, CS-AMEL 하이드로 겔 형성 새로 성장 층은 여전히 밀접 에나멜 표면 (도 5a)에 결합하고, 조직 구조 (도 5b) 보존되었다. 유전자 성별 감식 않고 키토산 하이드로 겔로 처리 샘플은, 그러나, 에나멜 및 수리 층 사이에 큰 간극이 초음파 처리 (도 5c) 다음 관찰 하였다.
분명히 새로 성장 층과 천연 에나멜, 새의 유전자 성별 감식을 구별하는LY-성장 층은 면역 형광 표시했다. 유전자 성별 감식의 존재는 새롭게 성장 층에있는 녹색 면역 형광 (그림 6)에 의해 증명되었다.
이러한 경도와 새로 성장 층의 탄성률 등의 기계적 특성은 나노 압입 테스트 (16)에 의해 분석 하였다. 산성 에나멜 표면의 경도 및 탄성률은 각각 약 98 % 및 88 % 감소 에칭 뒤에,도 7에 도시 된 바와 같이. 유전자 성별 감식 않고 키토산 하이드로 겔에 의해 처리 된 대조군는 경도 및 탄성률에 모두 제한된 개선을 보여 주었다. 반면, CS-AMEL 하이드로 겔의 광물 후에, 우리는 계수의 약 4 배의 증가와 경도 9 번 관찰했다.
그림 1. 유전자 성별 감식 - 키토산 (CS-AMEL) H의 사진 ydrogel 일반적인 CS-AMEL 하이드로 겔의. (A) 이미지. (B) 산 - 에칭 치아 슬라이스 CS-AMEL 하이드로 겔의 응용 프로그램.
그림 2. TEM 샘플 준비를위한 일반적인 집중 이온 빔 처리. 수리 에나멜 표면에 탄소 층의 (A) 증착. (B) 시료의 얇은 조각을 준비하는 탄소 층의 주위 깊게 샘플 밀링. (C) 얇은 조각 편 끝을 용접. (D) 샘플을 엷게 두께가 100nm 이하가 될 때까지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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칠일에 대한 유전자 성별 감식 - 키토산 하이드로 겔의 광물 후 새로 성장 층의 그림 3. 특성. (A) 유전자 성별 감식 - 키토산 하이드로 겔, 에칭 에나멜의 표면에 형성된 에나멜 층과 같은 광물의 7 일 후. 삽입은 새로 성장 층의 두께를 보여줍니다; 사각형에 해당하는 영역을 보여줍니다. 흰색 화살표는 새로 성장 층의 인회석의 방향을 나타냅니다. 조직의 결정 (B) 번들이 수리 층 내부에서 발견되었다. 화살표는 새로 성장 층 내부 병렬 결정의 일반적인 번들을 가리 킵니다. 삽입 된 페이지는 수리 층의 균일 한 표면을 보여줍니다. 새로 성장 층의 (C) 선택 영역 전자 회절 (SAED) 이미지. 삽입 된 집속 이온 빔 (FIB) 밀링으로 제조 수리 층의 TEM 이미지를 보여줍니다. 새로 성장 층의 (D) XRD 스펙트럼 후칠일에 대한 유전자 성별 감식 - 키토산 하이드로 겔의 광물. 참조 16의 허가를 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
새로 성장 층과 자연 에나멜 사이의 인터페이스의 그림 4. 미세. 자연 에나멜의 표면에 융합 새로 성장 층을 보여주는 3 일, 대한 유전자 성별 감식 - 키토산 겔의 재석 회화 후 수리 층의 (A) 단면 SEM 이미지. 흰색과 검은 색 화살표는 새로 성장 층과 자연 에나멜 결정의 결정 방향을 표시였다. 인터의 점선은 자연 에나멜 및 새로 성장 층의 경계를 나타낸다. (B) HRTEM 이미지에나멜에 수리 결정의 원활한 성장을 보이고, 에나멜과 재성장 결정 사이에 직면하고 있습니다. 검은 색 화살표는 재성장 에나멜 결정 사이의 인터페이스를 나타냅니다. 참조 16의 허가를 재현.
그림 5. 새로 성장 층과 에나멜 표면 사이의 강도를 바인딩. 단면, 및 (B) 유전자 성별 감식 키토산 하이드로 겔로 얻은 초음파 처리 새로 성장 층의 표면의 제 2 전자 화상의 (A) 후방 산란 된 전자 이미지. 인셋은 높은 배율에서 표면의 일반적인 형태를 나타낸다. (C) 유전자 성별 감식 않고 키토산 하이드로 겔로 얻은 초음파 처리 새로 성장 층의 단면의 후방 산란 전자 이미지. 참조 16의 허가를 재현. <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg"대상 = "_blank"는>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
새로 성장 층의 단면의 그림 6. 형광 이미지.에있는 사각형은 B에 해당하는 선택 영역을 나타냅니다. B의 화살표는 에나멜 표면에 새로 성장 층을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 경도 및 ELAS건강한 에나멜, 에칭 에나멜과 함께하고 유전자 성별 감식하지 않고 키토산 하이드로 겔에 의해 수리 복원 에나멜의 TIC 계수. 들여 쓰기 영역은 이전에 19. 기준 16의 허가를 재현보고 된 것과 유사했다.
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Discussion
에나멜의 미네랄 함량이 높은 그것을 인간의 몸에서 가장 단단한 광물 조직을 만드는 동안,이 바이오 세라믹은 종종 충치 또는 부식으로 발생하는 탈염 공정에 영향을 받기 쉽다. 유전자 돌연변이는 Amelogenesis 부전증 (20)라는 에나멜 기형의 상속 질병의 시리즈로 이어지는 얇은 또는 연약한 사기질을 일으킬 수 있습니다. 불소 또는 CPP-ACP를 포함하는 구강 건강 관리 제품은 몇 년 초기 에나멜 병변의 재석 회화를 촉진하기 위해 (즉, 니스, 치아 페이스트 및 구강 세정제)를위한 시장에왔다. 그러나, 이들 시판품 중에 조직 인회석 결정의 형성을 촉진 할 가능성이 없다. 깊은 에나멜 충치에 대한 기존의 치료는 기계적 드릴링과 같은 아말감, 세라믹 또는 합성 수지와 같은 인공 물질과 이후의 작성을 포함한다. 이러한 접근 방식은 초기 병변의 경우에 적합하지 않을 경우 큰 AR침식의 EAS는 에나멜에 발생합니다. 건강 에나멜의 과도한 양이 치아에 더 손상을 가져 제거해야하기 때문이다. 아말감 및 복합 수지 임시 '수리'는 치아와 같은 충전재는 일반적으로 치아의 부식을 중지하지 않습니다. 일본어 치아 표면과 충전재의 사이에 강력한 접착력 때문에 재료의 수축 및 화학적 조성 및 미세 구조의 차이의 도전이다.
CS-AMEL 히드로 겔의 장점
위의 문제를 극복하는 하나의 대안 전략은 직접 자연의 기판에 꽉 화학 접점이 형성 될 수있는 원래의 에나멜 표면에 에나멜과 같은 층을 자라게하는 것입니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 에나멜 표면에 체외에서 조직의 결정을 성장 유전자 성별 감식 - 키토산 (CS-AMEL) 하이드로 겔을 사용하는 새로운 에나멜 재건 전략을 제시한다. 다른 생체 모방 treatme에와 비교국세청, CS-AMEL 하이드로 겔은 임상을 준비하는 것이 더 쉽습니다. 생체 적합성과 생분해 성 외에, 그것은 치과 응용 프로그램 16 중요한 고유의 항균 및 접착 특성을 가지고 있습니다. 또 다른 장점은 합성 및 천연 에나멜 결정 간의 견고한 인터페이스를 새로 성장 층과 치아 표면 사이의 강한 결합을 촉진한다는 것이다. 임상 치과에 약한 결합은 현재 사용 가능한 물질의 복원 실패의 주된 이유입니다. 접착 불량은 일반적으로 세균의 누설 및 이차 우식의 위험을 증가하는 에나멜 복원 인터페이스에 차이가 발생합니다. 따라서, CS-AMEL 하이드로 겔 형성 새로 성장 층의 강력한 첨부 파일이 복원의 여백에 새로운 충치의 형성을 방지하고 수복물의 내구성을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
과제 및 향후 계획
오전의 수리 후elogenin - 키토산 하이드로 겔은, 에칭 된 에나멜 표면의 기계적 특성이 현저히 향상 하였다. CS-AMEL 하이드로-수리 법랑 때문에 법랑 구조물 (21)과 유사한 인회석 결정의 조직 번들의 상당히 큰 경도 및 제어 샘플에 비해 탄성률을 나타내었다. 이 기술은 그러나 다음과 같은 제한이 있습니다 (I) 경도와 탄성 계수는 여전히 의한 유기 물질과 heirarchial 프리즘 - interprismatic 구조의 부족의 존재로 자연 건강 에나멜의 수준을 충족하지 않는; (II) 시간의 연장 금액 (3-7 일) 완료 하이드로 겔 및 광물 건조에 필요한.
추가 연구는 상기 한계를 극복하기 위해 필요하다. 기계적 성질을 개선하는 한 가지 전략은 수리 두꺼운 층을 얻기위한 효과적인 방법으로서 CS-AMEL 하이드로 겔의 반복 애플리케이션 일 것이다. 광물 공정 중에 유기 물질의 분해는 다른 스트라이다기계적 성질을 개선 tegy. 실험은 하이드로 겔의 건조 시간뿐만 아니라 광물 진행 (22)을 단축 진행한다. 또, 결정 성장에 타액 단백질의 효과를 설명 우식 모델 시스템을 개발하는 것이 필요하다.
중요한 단계 및 요인
에나멜 재건 고밀도 인터페이스 에나멜 조의 층을 달성하기위한 가장 중요한 단계 중 하나를위한 CS-AMEL 하이드로 겔의 제조에 의한 키토산 및 유전자 성별 감식 16 사이의 pH 의존적 상호 작용 하이드로 겔의 pH 값을 조정한다. 키토산은 β-1 ,4-글리코 시드 결합에 의해 함께 결합 글루코사민과 N-아세틸 글루코사민 잔기를 포함하는 직쇄 다당류이다. 워낙 아미노기 중에서, 키토산의 화학적 및 물리적 특성은 매체의 pH 값을 변화시킴으로써 조정될 수있다. 예를 들어, CS-AMEL 시스템에서, 낮은 pH 값에서, Chitosan 그러나 5.5보다 높은 pH에서, 정전 기적 상호 작용을 통해 유전자 성별 감식과 상호 작용, 키토산의 상호 작용으로 인해 낮은 용해도 및 탈 양성자 (16)에 약했다. 이 pH에 응답 기능은 키토산 하이드로 겔뿐만 아니라 이상적인 유전자 성별 감식 캐리어뿐만 아니라 침식 에나멜을 보호하는 효과가 층을 만든다. 산성 구강 환경에서, 키토산의 아미노기는 긍정적 에나멜 표면에 수소 이온의 확산을 방지하는 장벽뿐만 아니라, 타액에의 손실을 피하기 위하여 유전자 성별 감식과 상호 작용을 형성하는 수소 이온을 캡처 할 수있다. 정상적인 pH를 침에 의해 복원되면 유전자 성별 감식은 에나멜의 재성장을 제어하는 CS-AMEL 하이드로 겔에서 해제된다.
에나멜 재성장 동안 유전자 성별 감식 존재는 인회석 결정의 지향과 신장의 성장을 제어하는 중요한 요소이다. CS-AMEL 하이드로 겔에서 유전자 성별 감식 집계에 의해 안정화 미리 핵 CA-P 클러스터는 린을 형성궁극적으로 더 에나멜 크리스탈 퓨즈와 에나멜과 같은 인회석 결정 16,23-24에 변환 귀 체인. 결정의 지속적인 성장은 새롭게 성장 층과 에나멜 사이의 뛰어난 결합을 촉진하는 고밀도 인터페이스를 형성한다.
요약하면, 우리는 표면의 에나멜 재건을위한 유망한 유전자 성별 감식 - 키토산 (CS-AMEL) 하이드로 겔을 소개합니다. 하이드로 겔 형성 조직 에나멜 조의 미세 크게 에칭 에나멜의 기계적 특성을 개선 할 수있다; 한편, 수리 층의 강력한 첨부 파일이 복원의 여백에 새로운 충치의 형성을 방지하고 잠재적으로 수복물의 내구성을 향상시킬 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
