Summary
En este artículo, se describe un protocolo para fabricar un hidrogel amelogenina quitosano para la reconstrucción del esmalte superficial. Organizado en el crecimiento in situ de los cristales de apatita en el hidrogel formado una densa interfaz de esmalte-restauración, lo que mejorará la eficacia y durabilidad de las restauraciones.
Protocol
Los molares humanos se extrajeron siguiendo los procedimientos estándar para la extracción de la Escuela Ostrow de Odontología de la Universidad del Sur de California y manipulados con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional.
1. Preparación del Diente grabado con ácido, Slice
- Seleccionar un tercer molar humano sin ningún tipo de caries restaurados.
- Retire la parte de la raíz del molar, y cortar la corona del molar longitudinalmente en rodajas de 2 mm de grosor utilizando una sierra de diamante de baja velocidad refrigerado por agua. Ultrasonidos limpiar estas rodajas durante 2 minutos, y luego enjuague con agua desionizada 3 veces.
- Para simular lesiones erosivas, grabar las rodajas de dientes con un 30% de ácido fosfórico durante 30 segundos luego enjuagar inmediatamente con agua desionizada.
- Ultrasonidos limpiar las rodajas grabadas durante 2 minutos, y luego enjuague con agua desionizada 3 veces.
2. Preparación de amelogenina-quitosano hidrogel
- PREPARACIÓNn de la solución madre quitosano
- Disolver 1% (w / v) de quitosano (peso molecular medio, 75-85% desacetilado) en una solución al 1% (v / v) de ácido acético seguido de agitación a 80 ° CO / N.
- Después de enfriar la solución a TA, se filtra la solución de quitosano utilizando un filtro de 0,45 micras. Ajustar el valor de pH a 5,0 mediante la adición de solución 1 M de NaOH.
- Preparación de calcio y la solución de stock de fosfato (0,1 M)
- Pesar de cloruro de calcio (CaCl2) y preparar una solución de 0,1 M, a continuación, mezclar usando un vórtice hasta que la solución es clara. Ajustar el valor de pH a 11 mediante la adición de solución 1 M de NaOH.
- Pesar de fosfato de sodio dibásico (Na 2 HPO 4) y preparar una solución de 0,1 M, a continuación, mezclar usando un vórtice hasta que la solución es clara.
- Expresión y purificación de amelogenina recombinante 17-18
La amelogenina recombinante de longitud completa de porcino (rP172) utilizado aquí tiene 172 aminoácidos y es un análogo de la plenaDe longitud P173 porcina natural, pero que carece de la metionina N-terminal, así como un grupo fosfato en Ser16 18.- Añadir 20 g de caldo de Lisogenia (LB) polvo de agar en 500 ml de agua desionizada, la solución en autoclave a 121 ° C (ajuste de líquido) durante 20 min. Deje enfriar el agar a ~ 55 ° C, añadir ampicilina (100 mg / ml) en solución de agar.
- Transferir la solución de agar a placas de Petri, que cada plato fresco hasta que esté sólido, y luego la vuelta para evitar la condensación en el agar. Placas, almacenarlas en bolsas de plástico a 4 ° C.
- Racha de la placa de agar LB con células recombinantes (E. coli-FC21) de la solución madre en glicerol (-80 ° C). Las placas se incuban O / N a 37 ° C.
- Preparar 50 ml de medio NZCYM y esterilizar en autoclave los medios de comunicación a 121 ° C durante 30 min. Permita que el medio se enfríe, añadir 50 l de 100 mg / ml de ampicilina a 50 ml de medio.
- Inocular una sola colonia de la placa de agar LB en los medios de comunicación NZCYM 50ml suplementado con ampicillpulg incuban las células O / N en una incubadora de agitación a 37 º C.
- Preparar 1 l de medio NZCYM y los medios de comunicación en autoclave a 121 ° C durante 30 min. Añadir 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina a 1000 ml de medio. Tome una densidad óptica (DO) como blanco utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. NOTA: No se deshaga de esto después de la primera lectura.
- Inocular 10 ml de cultivo celular de la etapa 2.3.5 en 1000 ml de medios de comunicación desde el paso 2.3.6. Lea la densidad óptica a 595 nm inmediatamente después de la inoculación. Tome la lectura de la densidad óptica periódicamente para hacer un seguimiento del crecimiento. NOTA: Lea el blanco cada vez que se toma la OD.
- Inducir con 700 l de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 1 M) cuando el crecimiento bacteriano llega a alrededor de 0,75 ~ 0,8 OD a 595 nm.
- Recoger las células cuando el OD alcanza 1,1. Verter el contenido del matraz a 6 botellas de plástico. Balanzas y pesar las botellas antes de utilizar la centrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 8554 xga 4 º C.Mantenga el sedimento celular en el -20 ° CO / N.
- Saque los sedimentos celulares y combinarlos en un tubo de 50 ml. Añadir 3,5 ml de HCl de guanidina 4M por l de fermentación. Veces Sonicar 2-3 sobre hielo, 30 segundos cada vez, con intervalos de 1 min.
- Hacer diluciones 6x de volumen de células con ácido fórmico al 0,5% y dejar que se revuelva en la cámara fría durante 2 horas. Centrifugar durante 30 min, 8554 xga 4 º C. Mantenga el sobrenadante. Añadir sulfato de amonio saturado al 20% utilizando la solución madre saturadas y revuelo en la sala fría, O / N.
- Centrifugar durante 30 min, 8.554 xg a 4 ° C y mantener el sedimento. Reconstituir los pellets en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), la carga en una columna C4 (10 x 250 mm, 5 micras), y fraccionar utilizando un gradiente lineal de A = 0,1% de TFA y B = 60% de acetonitrilo en TFA, en un tasa de 1,5 ml · min -1 fluir.
- Congelar la solución de proteína en hielo seco y liofilizar la congelada muestra O / N.
- Preparación de amelogenina-quitosano (CS-AMEL) hydrogEL (Figura 1A)
- Añadir 200 g de rp172 en un tubo que contiene 960 l de solución de quitosano al 1%, a continuación, mezclar usando un vórtice hasta que la solución es clara.
- Añadir 25 l de solución de CaCl M 0,1 2 seguido por 15 l de 0,1 M de Na 2 HPO 4 solución a la solución de quitosano que contiene amelogenina-, a continuación, mezclar usando un vórtice durante 5 min.
- Ajustar el pH de la solución de CS-AMEL a 6,5 por adición cuidadosa de solución 1 M de NaOH. CS-AMEL hidrogel formará cuando el valor de pH alcanza 6,5.
3. Esmalte Recrecimiento en Amelogenin-quitosano hidrogel
- Preparación de la solución de saliva artificial
- Disolver una cierta cantidad de cloruro de magnesio (MgCl2, 0,2 mM), cloruro de calcio (CaCl2, 1 mM), fosfato dihidrógeno de potasio (KH 2 PO 4, 4 mM), cloruro de potasio (KCl, 16 mM) y cloruro de amonio ( NH4Cl, 4,5 mM) en 20 mM de HEPES(4 - (2-hidroxietil) piperazina-1-etano-sulfónico) tampón 12.
- Ajustar el pH a 7.0 con 1 M de NaOH y almacenar la solución de saliva artificial a 4 ° C.
- Antes de utilizar la solución, agregar fluoruro de sodio (NaF, 300 ppm).
- Aplicación de la CS-AMEL hidrogel
- Aplicar sobre 20 l de hidrogel CS-AMEL a la rebanada diente se graban mediante una jeringa (Figura 1B).
- Secar la rebanada diente de hidrogel cubierto en un desecador a temperatura ambiente durante 2 h.
- Transferir la rebanada diente a un vaso de precipitados que contiene 30 ml de solución de saliva artificial. Cubrir el vaso con papel de aluminio, y luego mantener el vaso de precipitados en un horno a 37 ° C durante 7 días.
- Retire el trozo de diente y secarlo en un desecador a temperatura ambiente.
4. Caracterización de la interfaz entre la capa recién cultivado y esmalte
La microestructura de la interfaz entre la capa recién crecido y esmalte fue observaciónved por microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión de alta revolución (HR-TEM). La muestra de TEM se preparó usando un haz de iones enfocado técnica (FIB), los pasos para los que son de la siguiente manera.
- Cargue la muestra en un instrumento FIB-SEM y terminar todas las alineaciones de acuerdo a las instrucciones de funcionamiento. NOTA: El ajuste de Z Fine se debe realizar por lo menos 2 veces.
- Depositar una capa de carbono (15 × 3 micras) sobre la muestra para proteger la estructura subyacente (Figura 2A).
- Moler la muestra cuidadosamente en los lados superior, inferior y derecho de la capa de carbón para preparar una pieza delgada de la muestra y, a continuación, cortar la parte inferior de esta pieza delgada. NOTA: Compruebe la alineación del haz de iones antes de cada etapa de molienda (Figura 2B).
- Weld una punta de Pt sobre la pieza fina y cortar la parte izquierda para separar la pieza de muestra (Figura 3C). NOTA: Compruebe la alineación del haz de iones antes de la etapa de soldadura.
- Levante tque PT punta con la muestra lentamente, y montar la muestra laminar sobre una rejilla TEM lift-out.
- Separe la punta de la muestra, y diluir la muestra hasta que su grosor es inferior a 100 nm (Figura 3D). Retire la muestra del instrumento para llevar a cabo la observación TEM. NOTA: Compruebe la alineación del haz de iones antes de cada proceso de adelgazamiento.
5. Evaluación de propiedades de unión y mecánicas de la capa recién Grown
- La fuerza de unión se evalúa por tratamiento ultrasónico. Mantener la rebanada diente reparado en un limpiador de ultrasonidos (42 kHz, 100 W) durante 10 min, y a continuación, observar la interfaz entre la capa de esmalte natural y reparado con un análisis SEM de retrodispersión de electrones.
- Medir la dureza y módulo elástico a 20 puntos de prueba en cada superficie del esmalte reparado (n = 3) por un nano-penetrador con una punta Berkovich.
6. Inmunofluorescencia La tinción
- Lave el diente con slice Tris buffer solución salina (TBS) durante 15 min.
- Bloque con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en TBS durante 15 min.
- Eliminar el líquido y se incuba la muestra O / N con 1 ° Ab (1:500 pollo anti-amelogenina) diluido en TBS (0,1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
- Lavar la muestra con TBS durante 30 min y se incuba O / N con 2 ° Ab (1:100 FITC anti-pollo) diluido en TBS.
- Lavar la muestra con TBS durante 30 minutos y dejar secar durante otros 30 min.
- Observar al microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
La eficacia del protocolo descrito aquí se demuestra por microscopía electrónica de barrido (SEM), difracción de electrones área seleccionada (SAED) y difracción de rayos X (DRX) análisis. Después de la reparación por amelogenina-quitosano (CS-AMEL) hidrogel durante 7 días, se formó una capa similar al esmalte con un espesor de 15 micras en la superficie de esmalte grabado. La capa recién crecido-se hizo de matrices altamente ordenadas de cristales con un diámetro de ~ 50 nm, preferentemente creciente a lo largo del eje c, perpendicular a la superficie (flechas en la Figura 3A). Es de destacar que estos cristales en forma de aguja se organizan en paquetes, que son similares a las unidades fundamentales de esmalte natural (Figura 3B). El resultado SAED de la capa reparado exhibió un patrón en forma de arco que revela una alineación jerárquica de los cristales recién crecido a lo largo de la [002] dirección (Figura 3C). Análisis de difracción de rayos X confirmó que la capa recién crecido-se compone de apatitacristales, que se alinean a lo largo del eje c cristalográfico, de acuerdo con las observaciones de SEM y SEAD (Figura 3D).
La figura 4 muestra la microestructura de la interfaz entre la capa recién crecido-y esmalte natural. Tenga en cuenta que los cristales no crecen en las mismas direcciones que los cristalitos de esmalte originales. Se puede observar que el crecimiento de apatita mediada por la proteína resultó en una orientación perpendicular de cristales recién cultivadas-relativos a los cristales de esmalte naturales (Figura 4A). Los mecanismos de reparación propuestas, incluyendo la estabilización de las agrupaciones de Ca-P y su cristalización posterior organizada por amelogenina se han presentado en nuestro estudio anterior 16. La distinción entre los cristales recién formado y originales ha sido revelado por la transformada rápida de Fourier (FFT) que mostraron diferentes patrones que indican que los cristales en el esmalte y en la capa reparado fusionado con crecierondiferente orientación 16. Además, no hay ninguna diferencia aparente en la interfaz entre la capa y el sustrato reparado esmalte. En la nanoescala, el esmalte y los cristales vuelto a crecer fusionan para formar una interfaz perfecta (flechas negras de la figura 4B).
La resistencia de la unión entre la capa de reparado y esmalte natural se evaluó por tratamiento ultrasónico 16. Después de sonicación durante 10 min, la capa recién crecido formado en el hidrogel CS-AMEL todavía estaba fuertemente unido a la superficie del esmalte (Figura 5A), y la estructura organizada se conservó (Figura 5B). Para la muestra tratada con hidrogel de quitosán sin amelogenina, sin embargo, se observó una gran diferencia entre el esmalte y una capa reparado tras el tratamiento con ultrasonidos (Figura 5C).
Para distinguir claramente entre la capa recién crecido-y el esmalte natural, la amelogenina en el nuevocapa crecido-LY fue etiquetado de inmunofluorescencia. La presencia de amelogenina se demostró por la inmunofluorescencia verde en la capa recién crecido (Figura 6).
Propiedades mecánicas tales como dureza y módulo de elasticidad de la capa recién crecido se analizaron por la prueba de nanoindentación 16. Como se muestra en la Figura 7, después de grabado ácido de la dureza y el módulo de superficie de esmalte se redujo casi 98% y 88%, respectivamente. El grupo de control tratado con hidrogel quitosano sin amelogenina sólo mostró una mejoría limitada, tanto en dureza y el módulo. En contraste, después de la mineralización en el hidrogel CS-AMEL, se observó un aumento de casi 4 veces en el módulo y 9 veces en la dureza.
Figura 1. Fotografías de amelogenina-quitosano (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Imagen de un típico hidrogel CS-AMEL. (B) La aplicación del hidrogel CS-AMEL en una rebanada de dientes al ácido.
Figura 2. Proceso focalizado de iones de haz típico para la preparación de muestras TEM. (A) La deposición de una capa de carbono en la superficie del esmalte reparado. (B) moler la muestra con cuidado alrededor de una capa de carbono para preparar una fina pieza de muestra. (C) Soldadura de la punta de Pt en la pieza delgada. (D) Adelgazamiento de la muestra hasta que su grosor es inferior a 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Caracterización de la capa recién crecido-después de la mineralización en hidrogel-amelogenina quitosano durante 7 días. (A) Después de 7 días de mineralización con-amelogenina quitosano hidrogel, una capa similar al esmalte formada en la superficie del esmalte grabado. El recuadro muestra el espesor de la capa recién crecido; rectángulo muestra el área que corresponde a A. Las flechas blancas indican las orientaciones de apatita en la capa recién crecido. (B) Los bloques de cristales organizados se encontraron dentro de la capa reparado. Las flechas apuntan a un paquete típico de cristales paralelos dentro de la capa recién crecido-. El recuadro muestra la superficie homogénea de la capa reparado. (C) Área seleccionada difracción de electrones (SAED) Imagen de la capa recién crecido. El recuadro muestra la imagen de TEM de la capa reparado preparado por haz de iones focalizado (FIB) de molienda. (D) los espectros de difracción de rayos X de la capa recién crecido-despuésmineralización en un hidrogel de quitosano-amelogenina durante 7 días. Reproducido con permiso de referencia 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Microestructura de interfaz entre la capa recién crecido-y esmalte natural. (A) Sección transversal imagen SEM de la capa reparado después de la remineralización en gel amelogenina quitosano durante 3 días, mostrando capa recién crecido fusionados a la superficie del esmalte natural. Las flechas blancas y negras indican las orientaciones cristalográficas de los cristales en la capa recién crecido-y esmalte natural, respectivamente. La línea punteada muestra el límite del esmalte natural y la capa recién crecido. (B) Imagen HRTEM del interenfrentar entre el esmalte y cristal vuelto a crecer, con un crecimiento continuo de cristal reparado en el esmalte. Las flechas negras indican la interfaz entre cristales vuelto a crecer y esmalte. Reproducido con permiso de referencia 16.
Figura 5. Fuerza entre capa recién crecido-y la superficie del esmalte de unión. (A) Imagen de electrones retrodispersados de la sección transversal, y (B) segunda imagen electrónica de la superficie de una capa recién crecido tratados ultrasónicamente-obtenido con hidrogel de quitosán amelogenina. El recuadro muestra la morfología típica de la superficie con un mayor aumento. Imagen de electrones retrodispersados de la sección transversal de una capa recién crecido tratados ultrasónicamente-obtenido con hidrogel de quitosán sin amelogenina (C). Reproducido con permiso de referencia 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Las imágenes de fluorescencia de la sección transversal de la capa recién crecido-. Rectángulo en A representa el área seleccionada correspondiente a B. Las flechas en B indican la capa recién crecido en la superficie del esmalte. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Dureza y ELASmódulo tic del esmalte sano, esmalte grabado, y el esmalte reconstruida reparado por hidrogel quitosano con y sin amelogenina. La zona guión fue similar a lo que se ha informado anteriormente 19. Reproducido con permiso de referencia 16.
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Discussion
Mientras que el contenido mineral del esmalte es alto por lo que es el tejido mineralizado más duro del cuerpo humano, este biocerámico es susceptible a los procesos de desmineralización, que suelen aparecer como caries dental o erosión. Las mutaciones genéticas también pueden hacer que el esmalte delgadas o blandas que conducen a una serie de enfermedades hereditarias de la malformación del esmalte llamado amelogénesis imperfecta 20. Productos para el cuidado de la salud oral que contienen fluoruro o CPP-ACP han estado en el mercado desde hace varios años (por ejemplo, barnices, pastas de dientes y enjuagues bucales) para promover la remineralización de las lesiones iniciales de esmalte. Sin embargo, ninguno de estos productos disponibles en el mercado tienen el potencial de promover la formación de cristales de apatita organizados. Los tratamientos convencionales para esmalte cavidades profundas implican la perforación mecánica y posterior llenado con materiales artificiales tales como amalgama, de cerámica o de las resinas compuestas. Este enfoque no es ideal para las lesiones tempranas y los casos cuando grandes arEAS de la erosión se producen en el esmalte. Esto se debe a una cantidad desproporcionada de esmalte sano debe ser eliminado con lo que más daños al diente. Resinas amalgama y sólo temporal "reparar" el diente y tales rellenos normalmente no se detienen la caries del diente. Adhesión robusta entre la superficie de diente original y la de los materiales de relleno es un desafío debido a la contracción del material y las diferencias en la composición química y microestructura.
Ventajas de la CS-AMEL hidrogel
Una estrategia alternativa para superar los problemas mencionados es para volver a crecer una capa similar al esmalte directamente sobre la superficie del esmalte original cuando se puede formar contacto químico ajustado al sustrato natural. En este artículo de vídeo, se presenta una nueva estrategia de reconstrucción del esmalte que usa un-amelogenina quitosano (CS-AMEL) hidrogel para crecer cristales organizados in vitro sobre una superficie de esmalte. En comparación con otros trat biomiméticoNTS, CS-AMEL hidrogel es más fácil de preparar para el uso clínico. Además de la biocompatibilidad y biodegradabilidad, que tiene propiedades antimicrobianas y de adhesión únicas que son importantes para aplicaciones dentales 16. Otra ventaja es que la interfaz robusta entre el sintético y cristales de esmalte naturales promueve la fuerte unión entre la capa recién crecido y la superficie del diente. En odontología clínica unión débil es una razón principal para el fracaso de la restauración de los materiales disponibles en la actualidad. Mala adherencia usualmente resulta en brechas en la interfase esmalte-restauración, lo que aumenta el riesgo de filtración bacteriana y caries secundaria. Por lo tanto, la unión robusta de la capa recién crecido formado en el hidrogel CS-AMEL tiene el potencial de evitar la formación de nuevas caries en el margen de la restauración y mejorar la durabilidad de las restauraciones.
Retos y Planes para el futuro
Después de la reparación por la mañanahidrogel elogenin-quitosano, las propiedades mecánicas de la superficie del esmalte grabado al agua fuerte se mejoraron notablemente. El esmalte de hidrogel reparado CS-AMEL mostró significativamente mayor dureza y módulo de elasticidad de las muestras de control debido a los haces de organizados de cristales de apatita similares a la estructura del esmalte 21. La técnica, sin embargo tiene las siguientes limitaciones: (i) la dureza y el módulo aún no cumplen con el nivel de esmalte natural para la salud debido a la presencia de materia orgánica y la falta de estructura prismática interprismática heirarchial; (Ii) la cantidad extendida de tiempo (3-7 días) necesario para el secado del hidrogel y la mineralización para completar.
Se necesitan más estudios para superar las limitaciones anteriores. Una posible estrategia para mejorar las propiedades mecánicas será la aplicación repetida de CS-AMEL hidrogel como una manera eficaz de obtener una capa más gruesa reparado. La digestión del material orgánico durante el proceso de mineralización es otro Strategia para mejorar las propiedades mecánicas. Los experimentos están en curso para acortar el tiempo de secado del hidrogel, así como el progreso de la mineralización 22. Además, es necesario desarrollar un sistema de modelo de la caries que dan cuenta de los efectos de las proteínas salivares en el crecimiento de cristales.
Etapas críticas y los factores
En la preparación del hidrogel CS-AMEL para la reconstrucción del esmalte, uno de los pasos más críticos para el logro de una capa similar al esmalte con una interfaz denso es ajustar el valor de pH de hidrogel debido a la interacción dependiente de pH entre quitosano y amelogenina 16. El quitosano es un polisacárido de cadena lineal que comprende glucosamina y residuos de N-acetil glucosamina unidas por enlaces β-1 ,4-glucosídicos. Debido a sus grupos amino, las propiedades químicas y físicas del quitosano se pueden sintonizar mediante la variación de los valores de pH de los medios de comunicación. Por ejemplo, en un sistema CS-AMEL, a valores de pH más bajos, Chitosan interactuó con amelogenina través de la interacción electrostática, sin embargo, a pH superior a 5,5, la interacción quitosano fue débil debido a su baja solubilidad y desprotonación 16. Esta característica hace que la capacidad de respuesta del pH de hidrogel de quitosán no sólo un soporte de amelogenina ideal, pero también una capa efectiva de la erosión del esmalte. En un ambiente oral ácida, el grupo amino de quitosano podría capturar los iones de hidrógeno, formando una barrera positiva para prevenir la difusión de iones de hidrógeno a la superficie del esmalte, así como la interacción con amelogenina para evitar su pérdida en la saliva. Cuando el pH normal se restaura por la saliva de la amelogenina se libera de CS-AMEL hidrogel para controlar el rebrote de esmalte.
Durante la regeneración del esmalte, la presencia amelogenina es un factor crítico en el control del crecimiento orientado y alargada de cristales de apatita. En un hidrogel CS-AMEL, los grupos de Ca-P pre-nucleación, estabilizadas por amelogenina, se agregan para formar Lincadenas de los oídos, que además se fusionan con cristales de esmalte y finalmente transforma para cristales de apatita similar al esmalte 16,23-24. El crecimiento continuo de cristales forma una interfaz densa, que promueve una excelente unión entre la capa recién crecido y el esmalte.
En resumen, se introduce un amelogenina-quitosano (CS-AMEL) hidrogel prometedor para la reconstrucción del esmalte superficial. La microestructura similar al esmalte organizada formada en el hidrogel puede mejorar significativamente las propiedades mecánicas del esmalte grabado; Mientras tanto, la fijación robusta de la capa reparado puede evitar la formación de nuevas caries en el margen de la restauración y potencialmente mejorar la durabilidad de las restauraciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
