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Bioengineering

Desenvolvimento de Amelogenina-quitosana Hidrogel para Published: July 10, 2014 doi: 10.3791/51606

Summary

Neste artigo, nós descrevemos um protocolo para a fabricação de um hidrogel amelogenina-quitosana para reconstrução de esmalte superficial. Organizado em crescimento situ de cristais de apatita no hidrogel formado uma interface esmalte-restauração densa, o que irá melhorar a eficácia e durabilidade das restaurações.

Protocol

Os molares humanos foram extraídos seguindo os procedimentos padrão para a extração da Escola Ostrow de Odontologia da University of Southern California e manipulados com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional.

1. Preparação de dente ácido-gravadas Slice

  1. Selecione um terceiro molar humano sem cárie restauradas.
  2. Retirar a porção de raiz do molar, e cortar a coroa do molar longitudinalmente em fatias de 2 mm de espessura, utilizando uma baixa velocidade de serra de diamante arrefecida com água. Ultrassonicamente limpar essas fatias por 2 minutos, em seguida, enxágüe-os com água deionizada 3 vezes.
  3. Para simular lesões erosivas, gravar as fatias de dentes com 30% de ácido fosfórico por 30 segundos, em seguida, lave-os imediatamente com água deionizada.
  4. Ultrassonicamente limpar as fatias gravadas por 2 min, e em seguida, enxágüe-os com água deionizada 3 vezes.

2. Preparação de Hidrogel amelogenina-quitosano

  1. Preparation da solução de quitosana
    1. Dissolve-se 1% (w / v) de quitosano (peso molecular médio, 75-85% desacetilada) numa (v / v) de solução a 1% de ácido acético, seguido por agitação a 80 ° CO / N.
    2. Depois de arrefecer a solução até à temperatura ambiente, filtra-se a solução de quitosano utilizando um filtro de 0,45 um. Ajustar o valor de pH para 5,0 por adição de solução de NaOH 1 M.
  2. Preparação de cálcio e uma solução de partida de fosfato (0,1 M)
    1. Pesar de cloreto de cálcio (CaCl2) e preparar uma solução 0,1 M, em seguida misturar com um vortex até que a solução é límpida. Ajustar o valor de pH para 11 por adição de solução de NaOH 1 M.
    2. Pesar de fosfato de sódio dibásico (Na 2 HPO 4) e preparar uma solução 0,1 M, em seguida misturar com um vortex até que a solução é límpida.
  3. Expressão e purificação de amelogenina recombinante 17-18
    O full-length amelogenina porcino recombinante (rP172) usado aqui tem 172 aminoácidos e é um análogo de cheiaDe comprimento P173 porcina nativa, mas sem a metionina N-terminal, bem como um grupo fosfato em Ser16 18.
    1. Adicionar 20 g de caldo de Lisogenia (LB) agar em pó em 500 ml de água desionizada, a solução em autoclave a 121 ° C (ajuste líquido) durante 20 min. Deixe arrefecer ágar para ~ 55 ° C, adicionar ampicilina (100 ug / ml) em solução de agar.
    2. Transferir a solução agar para placas de Petri, que cada placa fria até que ele é sólido, em seguida, virar para evitar a condensação no ágar. Armazene as placas em sacos de plástico a 4 ° C.
    3. Raia a placa de agar LB com células de E. coli recombinante (-BC21) a partir do stock de glicerol (-80 ° C). Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
    4. Preparar 50 ml de meio NZCYM e os meios de comunicação autoclave a 121 ° C durante 30 min. Permita que os meios de comunicação para esfriar, adicione 50 mL de 100 mg / ml de ampicilina para os 50 ml de mídia.
    5. Inocule uma colónia isolada a partir da placa de LB agar para os meios de 50ml NZCYM suplementado com ampicillpol Incubar as células S / N em um incubador com agitação a 37 ° C.
    6. Prepare 1 litro de mídia NZCYM e autoclave a mídia a 121 ° C por 30 min. Adicionar 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina a 1000 ml de meio. Tome uma densidade óptica (DO) a leitura como um espaço em branco usando um espectrofotômetro UV-Vis. NOTA: Não descartar este após a primeira leitura.
    7. Inocular 10 ml de cultura de células a partir do passo 2.3.5 em 1000 ml de meio a partir do passo 2.3.6. Ler a densidade óptica a 595 nm, imediatamente após a inoculação. Pegue a leitura da densidade óptica periodicamente para acompanhar o crescimento. NOTA: Leia o branco cada vez que o OD está tomada.
    8. Induzir com 700 ul de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 1 H), quando o crescimento bacteriano atinge a cerca de 0,75 ~ 0,8 OD a 595 nm.
    9. Colheita das células, quando o OD atinge 1,1. Verter o conteúdo do balão para 6 frascos de plástico. Equilíbrio e pesar as garrafas antes de usar a centrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 8554 xg, a 4 ° C.Manter o pellet celular no -20 ° CO / N.
    10. Retire as pelotas de células e combiná-los em um tubo de 50 ml. Adicionar 3,5 ml de cloridrato de guanidina 4M por L de fermentação. Sonicate 2-3 vezes no gelo, 30 seg de cada vez, com intervalos de 1 min.
    11. Fazer diluições 6x de volume das células com ácido fórmico 0,5% e deixá-lo mexer na câmara fria durante 2 horas. Centrifugar durante 30 minutos, 8554 xg, a 4 ° C. Manter o sobrenadante. Adicionar 20% de sulfato de amônio saturada utilizando a solução de saturada e agitação na sala fria, O / N.
    12. Centrifugar durante 30 minutos, 8554 xg, a 4 ° C e manter o sedimento. Reconstituir os peletes em 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), a carga em uma coluna C4 (10 x 250 mm, 5 mm), e fraccionar usando um gradiente linear de A = 0,1% de TFA e B = 60% de acetonitrilo em TFA, com uma taxa de 1,5 ml · min -1 fluir.
    13. Congelar a solução de proteína em gelo seco e liofilizar a amostra congelada S / N.
  4. Preparação de amelogenina-quitosana (CS-AMEL) hydrogel (Figura 1A)
    1. Adicionar 200 mg de rp172 para um tubo contendo 960 ml de solução de quitosano a 1%, em seguida misturar com um vortex até que a solução é límpida.
    2. Adicionar 25 ul de 0,1 M de solução de CaCl2, seguido de 15 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 a solução a solução de quitosano contendo amelogenina, em seguida misturar com um vortex durante 5 min.
    3. Ajustar o pH da solução de CS-AMEL para 6,5 ​​por adição cuidadosa de solução de NaOH 1 M. CS-AMEL hidrogel irá formar-se quando o valor do pH atingir 6,5.

3. Esmalte Regrowth em Amelogenina-quitosana Hidrogel

  1. Preparação de solução de saliva artificial
    1. Dissolve-se uma certa quantidade de cloreto de magnésio (MgCl2, 0,2 mM), cloreto de cálcio (CaCl 2, 1 mM), fosfato de potássio (KH 2 PO 4, 4 mM), cloreto de potássio (KCl, 16 mM) e cloreto de amónio ( NH 4 Cl, 4,5 mM) em HEPES 20 mM(4 - (2-hidroxietil)-etano-sulfónico piperazina-1 de ácido) de tampão 12.
    2. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 1 M e armazenar a solução de saliva artificial a 4 ° C.
    3. Antes de usar a solução, adicionar fluoreto de sódio (NaF, 300 ppm).
  2. Aplicação de CS-AMEL hidrogel
    1. Aplicar cerca de 20 ul de hidrogel CS-AMEL ao corte de dente gravado utilizando uma seringa (Figura 1B).
    2. Seca-se o corte de dente coberta de hidrogel num exsicador à TA durante 2 horas.
    3. Transferir o corte de dente para um copo contendo 30 ml de solução de saliva artificial. Cobrir a proveta com folha de alumínio, e, em seguida, manter o recipiente num forno a 37 ° C durante 7 dias.
    4. Remover o corte de dente e secá-lo num exsicador à TA.

4. Caracterização da interface entre a camada recentemente crescido e Esmalte

A microestrutura da interface entre a camada recentemente crescido e esmalte foi observed por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão de alta rotação (HR-TEM). A amostra TEM foi preparado utilizando um feixe de íons focalizado (FIB), técnica, os passos para o que são os seguintes.

  1. Coloque a amostra em um instrumento FIB-SEM e terminar todos os alinhamentos de acordo com as instruções de operação. NOTA: Ajuste fino Z deve ser realizada pelo menos duas vezes.
  2. Depositar uma camada de carbono (15 x 3 mm) com a amostra para proteger a estrutura subjacente (Figura 2A).
  3. Moinho da amostra cuidadosamente os lados superior, inferior e direita da camada de carbono para preparar um pequeno pedaço de amostra e, em seguida, corte a parte inferior desta peça fina. NOTA: Verifique o alinhamento do feixe de iões antes de cada etapa de moagem (Figura 2B).
  4. Solda uma ponta Pt sobre a parte fina e corte do lado esquerdo para separar o pedaço de amostra (Figura 3C). NOTA: Verifique o alinhamento do feixe de iões antes da etapa de soldagem.
  5. Retire tEle PT ponta com a amostra lentamente, e montar a amostra lamelar dentro de uma grade TEM elevador-out.
  6. Retire a ponta da amostra, e fina a amostra até a sua espessura é menor do que 100 nm (Figura 3D). Retirar a amostra do instrumento para realizar a observação MET. NOTA: Verifique o alinhamento do feixe de iões antes de cada processo de desbaste.

5. Avaliação da vinculação e propriedades mecânicas da camada recém-Grown

  1. A força de ligação é avaliada por tratamento de ultra-sons. Mantenha o corte de dente reparado em um limpador ultra-sônico (42 kHz, 100 W) por 10 min, e em seguida, observar a interface entre a camada de esmalte reparado e natural com uma análise SEM retroespalhados-elétron.
  2. Medir a dureza e módulo de elasticidade aos 20 pontos de teste em cada superfície do esmalte reparado (n = 3) por uma nano-penetrador com uma ponta de Berkovich.

6. Imunofluorescência Coloração

  1. Lave a fatia de dente com Tris buffer salino (TBS) durante 15 min.
  2. Bloquear com 1% de albumina sérica bovina (BSA) em TBS durante 15 min.
  3. Remover o líquido e incubar a amostra S / N com 1 ° Ab (1:500 galinha anti-Amelogenina) diluído em TBS (0,1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
  4. Lava-se a amostra com TBS durante 30 min e incubar S / N ° 2 com Ab (1:100 Anti-galinha FITC) diluído em TBS.
  5. Lava-se a amostra com TBS durante 30 minutos e deixou-se secar durante mais 30 min.
  6. Observar por microscópio de fluorescência.

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Representative Results

A eficácia do protocolo aqui descrito é demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV), difração de elétrons selecionado área (SAED) e difração de raios-X (XRD) analisa. Após o reparo por amelogenina-quitosana (CS-AMEL) hidrogel por 7 dias, uma camada de esmalte com uma espessura de 15 mm foi formada na superfície esmalte condicionado. A camada recentemente cultivadas foi efectuada de matrizes altamente ordenada de cristais com um diâmetro de cerca de 50 nm, de preferência crescente ao longo do eixo c, perpendicular à superfície (setas na Figura 3A). Vale ressaltar que estes cristais em forma de agulha foram organizados em pacotes, que são similares às unidades fundamentais de esmalte naturais (Figura 3B). O resultado SAED de camada reparado exibiu um padrão em forma de arco que revela um alinhamento hierárquico dos cristais recentemente cultivadas ao longo da [002] sentido (Figura 3C). A análise de DRX confirmou que a camada de recém-cultivadas era composto de apatitacristais, que foram alinhados ao longo do eixo c cristalográfica, em conformidade com as observações SEM e SEAD (Figura 3D).

A Figura 4 mostra a microestrutura do interface entre a camada de recém-cultivados e esmalte natural. Note-se que os cristais não cresceu nas mesmas direções como cristais do esmalte originais. Pode ver-se que o crescimento de apatita mediada por proteína resultou numa orientação perpendicular de cristais recém-cultivadas em relação aos cristais de esmalte naturais (Figura 4A). Os mecanismos de reparo propostos, incluindo a estabilização de clusters Ca-P e sua posterior cristalização organizado pela amelogenina foram apresentados em nosso estudo anterior 16. A distinção entre cristais recém-formados e originais foi revelado pela transformação rápida de Fourier (FFT) análise que mostrou diferentes padrões que indicam que os cristais do esmalte e na camada reparado fundido cresceu comdiferente de orientação 16. Além disso, não há uma diferença aparente na interface entre a camada de reparação e o substrato de esmalte. Em nanoescala, o esmalte e os cristais regrown fundidos em conjunto para formar uma interface contínua (setas pretas na Figura 4B).

A força da ligação entre a camada de esmalte e reparado naturais foi avaliada por tratamento de ultra-sons 16. Após a ultra-sons durante 10 min, a camada formada recentemente crescido no hidrogel CS-AMEL ainda estava firmemente ligado à superfície do esmalte (Figura 5A), e a estrutura organizada foi preservado (Figura 5B). Para a amostra tratada com o hidrogel de quitosano sem amelogenina, no entanto, uma grande diferença entre o esmalte e uma camada reparado foi observado após o tratamento de ultra-sons (Figura 5C).

Para distinguir claramente entre a camada recém-crescido eo esmalte natural, a amelogenina na novacamada ly-cultivadas foi Imunofluorescência rotulado. A presença de amelogenina foi demonstrada pela imunofluorescência verde na camada recentemente cultivadas (Figura 6).

As propriedades mecânicas, tais como a dureza e módulo de elasticidade da camada recentemente crescidas foram analisados ​​pelo teste nanoindentação 16. Como mostrado na Figura 7, a seguir ácido gravura a dureza e módulo de superfície do esmalte diminuiu cerca de 98% e 88%, respectivamente. O grupo de controle tratado por hidrogel quitosana sem amelogenina só mostrou melhora limitada em ambos dureza e módulo. Por outro lado, após a mineralização no hidrogel CS-AMEL, observamos um aumento de cerca de 4 vezes em módulo e 9 vezes na dureza.

Figura 1
Figura 1. Fotografias de amelogenina-quitosana (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Imagem de um típico hidrogel CS-AMEL. (B) Aplicação do hidrogel CS-AMEL em uma fatia de dente ácido-gravadas.

Figura 2
Figura 2. Processo focado-ion-beam típica para preparação de amostras TEM. (A) A deposição de uma camada de carbono na superfície do esmalte reparado. (B) trituração da amostra cuidadosamente em torno de uma camada de carbono para preparar um pequeno pedaço de amostra. (C) de soldadura da ponta de Pt sobre o pedaço fino. (D) Diluição da amostra até que a sua espessura é inferior a 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Caracterização da camada recém-cultivados após mineralização em hidrogel amelogenina-quitosano durante 7 dias. (A) Após 7 dias de mineralização com amelogenina-quitosano hidrogel, uma camada de esmalte formados na superfície do esmalte condicionado. Inset mostra espessura da camada recém-crescidos; retângulo mostra a área correspondente a um. As setas brancas indicam as orientações de apatita na camada recém-crescidos. (B) Os quadros de cristais organizados foram encontrados dentro da camada reparado. As setas apontam para um conjunto típico de cristais paralelas dentro da camada recentemente cultivadas. Inset mostra a superfície homogênea da camada reparado. (C) Área selecionada difração de elétrons (SAED) imagem da camada recém-crescidos. Inset mostra imagem TEM da camada reparado preparado por feixe de íons focalizado (FIB) moagem. (D) os espectros de DRX da camada recém-cultivada apósmineralização em um hidrogel amelogenina-quitosana por 7 dias. Reproduzido com permissão da referência 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Microestrutura do interface entre a camada de recém-cultivados e esmalte natural. (A) imagem SEM-de seção transversal da camada reparado após remineralização em gel amelogenina-quitosana, durante 3 dias, mostrando camada recém-grown fundido à superfície do esmalte natural. As setas brancas e pretas indicam as orientações cristalográficas dos cristais na camada recém-crescidos e esmalte naturais, respectivamente. A linha pontilhada mostra a fronteira do esmalte natural e a camada recentemente crescido. (B) imagem HRTEM da interenfrentam entre o esmalte e cristal regrown, mostrando um crescimento contínuo de cristal reparado no esmalte. As setas pretas indicam a interface entre os cristais regrown e esmalte. Reproduzido com permissão da referência 16.

Figura 5
Figura 5. Encadernação força entre a camada recém-crescidos e superfície do esmalte. (A) imagem de electrões Backscattered da segunda imagem de electrões da superfície da camada de um recém-cultivadas tratadas com ultra-sons obteve com hidrogel de quitosano-amelogenina secção transversal, e (B). Inserção mostra a morfologia típica da superfície a uma maior ampliação. Imagem de electrões Backscattered da secção transversal de uma camada de recém-cultivadas tratadas com ultra-sons obteve com hidrogel de quitosano sem amelogenina (C). Reproduzido com permissão da referência 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Imagens de fluorescência da secção transversal da camada de recém-cultivadas. Retangular em que A representa a área seleccionada correspondente a B. As setas em B indicam a camada recém-crescidos na superfície do esmalte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Dureza e elasticimódulo de tic do esmalte saudável, esmalte condicionado e esmalte reconstruído reparado por hidrogel de quitosana com e sem amelogenina. travessão A área foi semelhante ao que foi relatado anteriormente 19. Reproduzido com permissão da referência 16.

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Discussion

Embora o conteúdo mineral do esmalte é alta tornando-o mais difícil de tecido mineralizado no corpo humano, esta biocerâmica é suscetível a processos de desmineralização, que muitas vezes ocorrem como cárie dentária ou erosão. Mutações no gene, também podem causar esmalte finas ou macias que conduzem a uma série de doenças hereditárias de malformação esmalte chamado Amelogenesis imperfeita 20. Produtos de cuidados de saúde oral que contenham flúor ou CPP-ACP ter sido no mercado há vários anos (isto é, vernizes, pastas de dente e enxaguatórios bucais) para promover a remineralização de lesões iniciais em esmalte. No entanto, nenhum destes produtos comercialmente disponíveis têm o potencial para promover a formação dos cristais de apatite organizados. Os tratamentos convencionais para cavidades esmalte profundas envolvem perfuração mecânica e enchimento posterior com materiais artificiais, como amálgama, cerâmica ou resinas compostas. Tal abordagem não é ideal para lesões precoces e casos em que grande areas de erosão ocorre em esmalte. Isso ocorre porque uma quantidade desproporcional de esmalte saudável deve ser removido trazendo mais danos ao dente. Resinas compostas e amálgama 'reparação' apenas temporária do dente e esses recheios tipicamente não param decadência do dente. Adesão forte entre a superfície do dente original e que os materiais de enchimento é um desafio devido a encolhimento de material e as diferenças na composição química e microestrutura.

Vantagens de CS-AMEL Hidrogel

Uma estratégia alternativa para superar os desafios acima é a regredir uma camada de esmalte diretamente sobre a superfície do esmalte original quando apertado contato químico ao substrato natural pode ser formada. Neste artigo de vídeo, apresentamos uma estratégia de reconstrução esmalte romance que usa um hidrogel amelogenina-quitosana (CS-AMEL) para crescer cristais organizados in vitro em uma superfície de esmalte. Comparado com o outro treatme biomiméticonts, ​​CS-AMEL hidrogel é mais fácil para se preparar para o uso clínico. Além da biocompatibilidade e biodegradabilidade, tem propriedades antimicrobianas e adesão únicas que são importantes para aplicações dentárias 16. Outra vantagem é que a interface forte entre o sintético e cristais naturais esmalte promove a forte ligação entre a camada recentemente crescido e a superfície do dente. Na odontologia clínica vínculo fraco é a principal razão para o fracasso de restauração dos materiais atualmente disponíveis. Má aderência geralmente resulta em falhas na interface esmalte-restauração, que aumentam o risco de infiltração bacteriana e cáries secundárias. Portanto, a ligação robusta da camada recentemente formado crescido no hidrogel CS-AMEL tem o potencial de evitar a formação de novas cáries na margem da restauração e melhorar a durabilidade das restaurações.

Desafios e Planos para o futuro

Após o reparo por amhidrogel elogenin-quitosano, as propriedades mecânicas da superfície esmalte condicionado foram notavelmente melhorada. O esmalte reparado-hidrogel CS-AMEL mostrou significativamente maior dureza e módulo de elasticidade do que as amostras de controle por causa dos pacotes organizados de cristais de apatita semelhante à estrutura do esmalte 21. A técnica, entretanto, tem as seguintes limitações: (i) a dureza e módulo ainda não conhecer o nível de esmalte natural e saudável, devido à presença de material orgânico e falta de estrutura prismática-interprismática heirarchial; (Ii) a quantidade de tempo prolongado (3-7 dias) necessário para a secagem do hidrogel e para completar a mineralização.

Mais estudos são necessários para superar as limitações acima. Uma estratégia possível para melhorar as propriedades mecânicas serão a aplicação repetida de CS-AMEL hidrogel como uma forma eficaz para obter uma camada mais espessa reparado. A digestão de material orgânico durante o processo de mineralização é outro straTEGy para melhorar as propriedades mecânicas. As experiências estão em andamento para encurtar o tempo de secagem do hidrogel bem como do progresso mineralização 22. Além disso, é necessário o desenvolvimento de um sistema modelo de cárie, que conta para os efeitos das proteínas salivares no crescimento do cristal.

Etapas críticas e Fatores

Na preparação do hidrogel CS-AMEL para a reconstrução de esmalte, um dos passos mais importantes para alcançar uma camada de esmalte com uma interface densa está a ajustar o valor de pH hidrogel devido à interação dependente do pH entre quitosana e amelogenina 16. O quitosano é um polissacárido de cadeia linear compreendendo glucosamina e N-acetil de resíduos de glucosamina unidas por ligações β-1 ,4-glicosídicas. Por causa dos seus grupos amino, a propriedades químicas e físicas de quitosano pode ser sintonizada por variação dos valores de pH dos meios de comunicação. Por exemplo, em um sistema de CS-AMEL, a valores de pH mais baixos, chitosan interagiu com amelogenina através da interação eletrostática, porém em pH superior a 5,5, a interação quitosana foi fraco, devido à sua baixa solubilidade e desprotonação 16. Esta característica faz com que a capacidade de resposta de pH hidrogel quitosana não apenas um portador de amelogenina ideal, mas também uma camada eficiente esmalte da erosão. Em um ambiente bucal ácido, o grupo amino de quitosano pode capturar os iões de hidrogénio, formando uma barreira positiva para evitar a difusão de iões de hidrogénio para a superfície do esmalte, assim como interagindo com amelogenina para evitar a sua perda na saliva. Quando o pH normal é restaurado pela saliva a amelogenina é liberado do CS-AMEL hidrogel para controlar o crescimento de esmalte.

Durante a rebrota esmalte, presença amelogenina é um fator crítico no controle do crescimento orientado e alongada de cristais de apatita. Num hidrogel CS-AMEL, os pré-nucleação aglomerados de Ca-P, estabilizados por meio de amelogenina, agregado para formar lincadeias de ouvido que mais se fundem com cristais do esmalte e, finalmente, se transforma em cristais de apatita do esmalte-como 16,23-24. O crescimento de cristais de forma contínua uma interface densa, o que promove uma excelente ligação entre a camada recentemente crescido e o esmalte.

Em resumo, nós introduzimos um amelogenina-quitosana (CS-AMEL) hidrogel promissor para a reconstrução do esmalte superficial. A microestrutura de esmalte organizado formado no hidrogel pode melhorar significativamente as propriedades mecânicas do esmalte condicionado; Enquanto isso, o anexo robusto da camada reparado pode evitar a formação de novas cáries na margem da restauração e, potencialmente, melhorar a durabilidade das restaurações.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human third molar  Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California  N/A The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board.
Recombinant pocine amelogenin Expression and purification  in lab N/A rP172, full-length 
Chitosan  Sigma-Aldrich 448877 Medium molecular weight, 75-85% deacetylated
Phosphoric acid  VWR AA033266
Acetic acid glacial VWR A036289
Sodium hydroxide VWR BDH9292
Calcium chloride  Sigma-Aldrich 223506
Dibasic sodium phosphate anhydrous VWR BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP  Agilent Technologies Inc. 230255
Ammonium sulfate VWR BDH8001
Trifluoroacetic acid VWR AAAL06374
Acetonitrile VWR BDH1103
Magnesium chloride  VWR BDH0244
Potassium dihydrogen phosphate  VWR BDH9268
Potassium chloride  VWR BDH0258
Ammonium chloride  VWR AAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) VWR AAA14777
Sodium fluoride  VWR AA11561
Tris-buffered saline Bio-Rad 170-6435 10× TBS
Bovine serum albumin EMD Millipore  12659 CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals 
Triton X-100 EMD Millipore  TX1568-1
Chicken Anti-Amelogenin N/A N/A A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California
Bovine Anti-Chicken IgY-FITC Santa Cruz Biotechnology Sc-2700
High Performance Liquid Chromatography System Agilent Technologies Inc. Varian Prostar 210
C4 column Phenomenx  Jupiter 5μ 300A
Scanning Electron Microscopy  JEOL  JSM-7001
FIB-SEM  JEOL  JIB-4500
Transmission Electron Microscopy  JEOL JEM-2100F
Digital low speed diamond saw MTI Corporation SYJ-150
Fluorescence microscopy Leica DMI3000 B
Ultrasonic cleaner  Branson  2510 42 kHz, 100 W
Nano-indenter  Agilent Technologies Inc. MTS XP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengenharia Esmalte Amelogenina Quitosana hidrogel apatita Biomiméticos a erosão a reconstrução do esmalte superficial a interface Densa
Desenvolvimento de Amelogenina-quitosana Hidrogel para<em&gt; In Vitro</em&gt; Esmalte Regrowth Com uma interface Densa
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Ruan, Q., Moradian-Oldak, J.More

Ruan, Q., Moradian-Oldak, J. Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface. J. Vis. Exp. (89), e51606, doi:10.3791/51606 (2014).

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