Summary
In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines amelogenin-Chitosan-Hydrogel für oberflächliche Zahnschmelz Wiederaufbau. In-situ-Wachstum von Apatitkristalle in dem Hydrogel Organisiert bildeten einen dichten Schmelz-Wiederherstellung-Schnittstelle, die die Wirksamkeit und Haltbarkeit von Restaurationen zu verbessern.
Protocol
Die menschliche Molaren wurden nach den Standardverfahren zur Extraktion bei der Ostrow School of Dentistry der University of Southern California extrahiert und mit Zustimmung des Institutional Review Board behandelt.
1. Vorbereitung der geätzten Zahn Scheibe
- Wählen Sie einen menschlichen dritten Molaren ohne restauriert Karies.
- Entfernen der Wurzelabschnitt des molaren, und schneiden die Krone des molaren Längsrichtung in Scheiben von 2 mm Dicke unter Verwendung einer wassergekühlten Niedergeschwindigkeits-Diamantsäge. Diese Scheiben reinigen mit Ultraschall für 2 Minuten und dann spülen Sie mit VE-Wasser 3-mal.
- Um Erosionen zu simulieren, ätzen die Zahnscheiben mit 30% Phosphorsäure für 30 Sekunden, dann sie sofort gründlich mit VE-Wasser.
- Ultraschall reinigen die Scheiben geätzt für 2 Minuten und dann spülen Sie mit VE-Wasser 3-mal.
2. Vorbereitung der Amelogenin-Chitosan-Hydrogel
- Präparaten von Chitosan-Stammlösung
- Man löst 1% (w / v) Chitosan (mittleres Molekulargewicht 75-85% deacetyliertes) in einer 1% (v / v) Essigsäure-Lösung, gefolgt von Rühren bei 80 ° CO / N
- Nach Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur filtriert man das Chitosan-Lösung unter Verwendung eines 0,45 &mgr; m. Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 durch Zugabe von 1 M NaOH-Lösung.
- Herstellung von Calcium-und Phosphat-Stammlösung (0,1 M)
- Abwiegen Calciumchlorid (CaCl 2) und bereiten eine 0,1 M Lösung, dann mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Einstellen des pH-Werts auf 11 durch Zugabe von 1 M NaOH-Lösung.
- Abwiegen Natriummonohydrogenphosphat (Na 2 HPO 4) und bereiten eine 0,1 M Lösung, dann mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist.
- Expression und Reinigung von rekombinantem Amelogenin 17-18
Das rekombinante voller Länge Schweine amelogenin (rP172) welche hier hat 172 Aminosäuren und ist ein analoges VollLängen-Nativschweine P173, aber nicht über die N-terminale Methionin sowie eine Phosphatgruppe auf Ser16 18.- 20 g Lysogenität Brühe (LB)-Agar-Pulver in 500 ml VE-Wasser, die Lösung im Autoklaven bei 121 ° C (flüssiger Einstellung) für 20 min. Lassen Agar cool zu ~ 55 ° C, fügen Ampicillin (100 ug / ml) in Agar-Lösung.
- Übertragen Sie die Agar-Lösung auf Petrischalen, lassen jede Platte abkühlen, bis es fest ist, dann drehen, um Kondensation auf dem Agar zu vermeiden. Speicher Platten in Kunststoffbeutel bei 4 ° C.
- Streak die LB-Agar-Platte mit rekombinanten Zellen (E.coli-BC21) von der Glycerin-Stamm (-80 ° C). Die Platten O / N bei 37 ° C.
- Vorbereitung 50 ml NZCYM-Medium und das Medium autoklaviert bei 121 º C für 30 min. Ermöglichen, dass die Medien abkühlen, 50 &mgr; l 100 &mgr; g / ml Ampicillin für die 50 ml Medium.
- Impfen eine einzige Kolonie von der LB-Agar-Platte in den Medien mit 50ml NZCYM ampicill ergänztin. die Zellen O / N bei 37 ° C inkubieren in einem Schüttelinkubator
- Herstellung von 1 l NZCYM-Medien und autoklavieren Medien bei 121 ° C für 30 min. 1 ml 100 mg / ml Ampicillin bis 1000 ml Medium. Nehmen Sie eine optische Dichte (OD) als Rohling mit einem UV-Vis-Spektrophotometer. HINWEIS: Werfen Sie diese nach der ersten Lesung.
- Beimpfen von 10 ml der Zellkultur von Schritt 2.3.5 in 1000 ml Medium aus Schritt 2.3.6. Messen der optischen Dichte bei 595 nm unmittelbar nach Inokulation. Nehmen Sie die optische Dichte Lese regelmäßig zu verfolgen, das Wachstum zu halten. HINWEIS: Lesen Sie die leere jedes Mal die OD genommen wird.
- Induziert mit 700 &mgr; l Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG, 1 M), wenn das bakterielle Wachstum erreicht, bis etwa 0,75 bis 0,8 OD bei 595 nm auf.
- Ernten Sie die Zellen, wenn die OD erreicht 1.1. Den Inhalt des Kolbens in 6 Kunststoffflaschen. Balancieren und wiegen die Flaschen vor der Verwendung der Zentrifuge. Zentrifugieren für 20 min bei 8.554 × g bei 4 ° C.Halten des Zellpellets in der -20 ° CO / N
- Nehmen Sie die Zellpellets und kombinieren sie in einem 50-ml-Tube. In 3,5 ml 4 M Guanidin-HCl pro Liter der Gärung. Ultraschallbad 2-3 mal auf Eis, 30 Sek. jedes Mal, mit 1-Minuten-Intervallen.
- Machen 6x Verdünnungen des Zellvolumens mit 0,5% Ameisensäure und lassen Sie es im Kühlraum für 2 h rühren. Zentrifugieren für 30 min, 8.554 x g bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand. In 20% Gesättigte Ammoniumsulfat mit der gesättigten Stammlösung und Aufsehen in der kalten Raum, O / N.
- Zentrifugieren für 30 min, 8554 × g bei 4 ° C und halten die Pellets. Rekonstitution der Pellets in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), Last auf eine C4-Säule (10 x 250 mm, 5 &mgr; m) und Fraktionierung unter Verwendung eines linearen Gradienten von A = 0,1% TFA und B = 60% Acetonitril in TFA, bei einer Durchflussrate von 1,5 ml · min -1.
- Einfrieren der Proteinlösung auf Trockeneis und lyophilisiert die gefrorene Probe O / N.
- Vorbereitung der amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) HYDROGel (Fig. 1A)
- In 200 ug rp172 in ein Röhrchen mit 960 ul 1% Chitosan-Lösung, dann mit einem Vortex mischen, bis die Lösung klar ist.
- In 25 ul 0,1 M CaCl 2-Lösung, gefolgt von 15 ul 0,1 M Na 2 HPO 4 Lösung des amelogenin haltigen Chitosan-Lösung, dann mischen mit einem Vortex für 5 min.
- Den pH-Wert des CS-AMEL Lösung auf 6,5 durch vorsichtige Zugabe von 1 M NaOH-Lösung. CS-AMEL Hydrogel zu bilden, wenn der pH-Wert 6,5 erreicht.
3. Emaille Nachwachsen in Amelogenin-Chitosan-Hydrogel
- Herstellung von künstlichen Speichellösung
- Man löst eine bestimmte Menge von Magnesiumchlorid (MgCl 2, 0,2 mM), Calciumchlorid (CaCl 2, 1 mM), Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4, 4 mM), Kaliumchlorid (KCl, 16 mM) und Ammoniumchlorid ( NH 4 Cl, 4,5 mM) in 20 mM HEPES(4 - (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethan-sulfonsäure)-Puffer 12.
- PH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH und speichern die künstliche Speichellösung bei 4 ° C.
- Vor der Verwendung der Lösung werden Natriumfluorid (NaF, 300 ppm).
- Anwendung von CS-Hydrogel AMEL
- Gelten etwa 20 &mgr; l CS-AMEL Hydrogel auf die geätzte Zahnscheibe mit einer Spritze (Abbildung 1B).
- Trocknen Sie die Hydrogel-bedeckten Zahnscheibe in einem Exsikkator bei RT für 2 Stunden.
- Übertragen der Zahnscheibe in ein Becherglas, das 30 ml Lösung künstlichen Speichels. Das Becherglas mit Aluminiumfolie, und dann halten Sie den Becher in einem Ofen bei 37 ° C für 7 Tage.
- Entfernen Sie die Zahnscheibe und trocknen Sie sie in einem Trockenschrank bei RT.
4. Charakterisierung der Schnittstelle zwischen neu gewachsenen Schicht und Emaille
Die Mikrostruktur der Grenzfläche zwischen dem neu gewachsenen Schicht und Emaille Beobachdurch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und hohen Drehtransmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM) ved. Die TEM-Probe wurde unter Verwendung eines fokussierten Ionenstrahls (FIB)-Technik, die für die Schritte sind wie folgt hergestellt.
- Legen Sie die Probe in ein FIB-SEM Instrument und beenden Sie alle Ausrichtungen nach der Betriebsanleitung. HINWEIS: Z Feineinstellung sollte mindestens 2 mal durchgeführt werden.
- Abscheiden einer Kohlenstoffschicht (15 × 3 &mgr; m) auf der Probe, um die darunterliegende Struktur (2A) zu schützen.
- Mühle die Probe vorsichtig an den oberen, unteren und rechten Seite der Kohlenstoffschicht, ein dünnes Stück Probe herzustellen, und dann schneiden Sie die untere Seite dieser dünnen Stück. HINWEIS: Überprüfen Sie die Ionenstrahl-Ausrichtung vor jedem Schleifschritt (Abbildung 2B).
- Weld ein Pt-Spitze auf dem dünnen Stück und schneiden Sie die linke Seite, um das Probestück (3C) zu trennen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Ionenstrahl-Ausrichtung vor dem Schweißschritt.
- Heben Sie tPT er mit der Probe langsam kippen, und montieren Sie die Lamellen Probe auf einem Lift-out-TEM-Gitter.
- Nehmen Sie die Spitze aus der Probe und die Probe dünn, bis seine Dicke weniger als 100 nm (Abbildung 3D). Entfernen der Probe aus dem Gerät, um die TEM-Beobachtung durchzuführen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Ionenstrahl-Ausrichtung vor jedem Verdünnungsprozess.
5. Beurteilung der Bindung und mechanische Eigenschaften der neu gewachsenen Schicht
- Die Bindungsfestigkeit wird durch Ultraschallbehandlung beurteilt. Halten Sie die reparierte Zahnscheibe in einem Ultraschallreiniger (42 kHz, 100 W) für 10 min und dann beobachten, die Schnittstelle zwischen der Schicht und repariert natürlichen Zahnschmelz mit einem Rückstreuelektronen-REM-Analyse.
- Messung der Härte und der Elastizitätsmodul bei 20 Testpunkte für jedes repariert Schmelzoberfläche (n = 3) durch eine Nanoindenters mit einer Berkovich-Spitze.
6. Immunfluoreszenzfärbungen
- Waschen Sie die Zahnscheibe mit Tris buffer Kochsalzlösung (TBS) für 15 min.
- Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBS für 15 min.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit und Inkubation der Probe O / N 1 ° Ab (1:500 Huhn Anti-Amelogenin) in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100) verdünnt.
- Waschen Sie die Probe mit TBS für 30 min und Inkubation O / N mit 2 ° Ab (1:100 Anti-Huhn FITC) in TBS verdünnt.
- Waschen Sie die Probe mit TBS für 30 min und zu verlassen, um für weitere 30 Minuten trocknen.
- Beachten durch Fluoreszenz-Mikroskop.
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Representative Results
Die Wirksamkeit der hier beschriebenen Protokoll wird durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Bereichsbeugung (SAED) und Röntgenbeugung (XRD)-Analyse bewiesen. Nach der Reparatur von Amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) Hydrogel für 7 Tage wurde ein emailartigen Schicht mit einer Dicke von 15 um auf der geätzten Zahnschmelzoberfläche ist. Die neu gewachsene Schicht von hochgeordneten Anordnungen von Kristallen mit einem Durchmesser von ~ 50 nm, wächst vorzugsweise entlang der c-Achse, senkrecht zur Oberfläche (Pfeile in Fig. 3A). Es ist bemerkenswert, dass diese nadelartigen Kristalle wurden zu Bündeln, die ähnlich zu den Grundeinheiten des natürlichen Schmelzes (3B) organisiert sind. Die SAED Ergebnis repariert Schicht wies einen bogenförmigen Muster enthüllt eine hierarchische Anordnung der neu gewachsenen Kristalle entlang der [002]-Richtung (Fig. 3C). XRD-Analyse bestätigt, dass die neu gewachsenen Schicht wurde von Apatit zusammenKristalle, die entlang der kristallographischen c-Achse ausgerichtet wurden, in Übereinstimmung mit den SEM-Beobachtungen und SEAD (Fig. 3D).
Figur 4 zeigt die Mikrostruktur der Grenzfläche zwischen dem neu aufgewachsenen Schicht und dem natürlichen Zahnschmelz. Beachten Sie, dass die Kristalle nicht in den gleichen Richtungen wie Original Emaille Kristallite wachsen. Es kann gesehen werden, dass die Apatit-Protein-vermittelte Wachstum resultierte in einer senkrechten Ausrichtung der neu gewachsenen Kristallen relativ zu den natürlichen Zahnschmelz Kristalle (4A). Die vorgeschlagenen Reparaturmechanismen einschließlich der Stabilisierung der Ca-P-Cluster und deren anschließende organisiert Kristallisation durch amelogenin haben in unserer früheren Studie 16 vorgestellt. Die Unterscheidung zwischen neu gebildeten Kristalle und original ist durch die schnelle Fourier enthüllt Transformation (FFT)-Analyse, die unterschiedliche Muster, die zeigte, dass die Kristalle im Schmelz und im geschmolzenen repariert Schicht wuchs mit16 andere Ausrichtung. Darüber hinaus gibt es keine offensichtliche Lücke an der Grenzfläche zwischen der Schicht und dem reparierten Schmelz Substrat. Im Nanometerbereich, die Schmelz-und die nachgewachsenen Kristalle miteinander verschmolzen, um eine nahtlose Grenzfläche (schwarze Pfeile in Fig. 4B).
Die Bindungsstärke zwischen dem reparierten Schicht und natürlichen Zahnschmelz wurde durch Ultraschallbehandlung 16 bewertet. Nach Beschallung für 10 min, die neu gewachsenen Schicht in der CS-AMEL Hydrogel noch fest an der Schmelzoberfläche (5A) gebunden ist, und die organisierte Struktur erhalten wurde (5B). Für die Probe mit Chitosan-Hydrogel ohne Amelogenin behandelt, jedoch eine große Lücke zwischen dem Schmelz und eine reparierte Schicht wurde nach der Ultraschallbehandlung (Fig. 5C) beobachtet.
Um klar zwischen dem neu gewachsenen Schicht und dem natürlichen Zahnschmelz, der in der neuen amelogenin unterscheidenly-gewachsenen Schicht wurde Immunfluoreszenz markiert. Die Anwesenheit von Amelogenin wurde durch die grüne Immunfluoreszenz in der neu aufgewachsenen Schicht (Fig. 6) gezeigt.
Mechanische Eigenschaften, wie Härte und Elastizitätsmodul der neu gewachsenen Schicht durch Nanoindentierung Test 16 analysiert. Wie in Fig. 7 gezeigt, nach Säureätzen die Härte und den Modul des Schmelzoberfläche sank fast 98% und 88% betragen. Die Kontrollgruppe von Chitosan-Hydrogel ohne amelogenin behandelt wurden, zeigten nur begrenzte Verbesserung sowohl in der Härte und E-Modul. Im Gegensatz dazu nach der Mineralisierung in der CS-Hydrogel AMEL, beobachteten wir eine Steigerung von fast 4-mal in Modul und 9-mal in der Härte.
Abbildung 1. Fotografien von amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Bild von einem typischen CS-AMEL Hydrogel. (B) Anwendung der CS-AMEL Hydrogel auf einer geätzten Zahnscheibe.
Abbildung 2. Typische fokussierten Ionenstrahl-Verfahren zur TEM Probenvorbereitung. (A) Abscheidung einer Kohlenstoffschicht auf repariert Schmelzoberfläche. (B) Fräsen der Probe vorsichtig um eine Kohlenstoffschicht, ein dünnes Stück Probe herzustellen. (C) Schweiß die Pt Spitze auf dem dünnen Stück. (D) Verdünnen der Probe bis seine Dicke von weniger als 100 nm ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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3. Charakterisierung neu gewachsenen Schicht nach Mineralisierung in Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für 7 Tage. (A) Nach 7 Tagen Mineralisierung mit Amelogenin-Chitosan-Hydrogel, einem emailartigen Schicht auf der Oberfläche des geätzten Schmelz gebildet. Inset zeigt Dicke der neu gewachsenen Schicht; Rechteck zeigt den Bereich entsprechend A. Weiße Pfeile zeigen die Apatit-Orientierungen in der neu gewachsenen Schicht. (B) Bundles der organisierten Kristalle wurden innerhalb der repariert Schicht gefunden. Die Pfeile weisen auf eine typische Bündel paralleler Kristallen innerhalb der neu gewachsenen Schicht. Inset zeigt die homogene Oberfläche der Schicht repariert. (C) Ausgewählte Bereichselektronenbeugung (SAED) Bild des neu gewachsenen Schicht. Inset zeigt TEM-Bild des reparierten Schicht von fokussierten Ionenstrahl (FIB)-Fräsen hergestellt. (D) XRD-Spektren der neu gewachsenen Schicht nachMineralisierung in einer amelogenin-Chitosan-Hydrogel für 7 Tage. Mit Genehmigung aus Lit. 16 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Gefüge von Schnittstelle zwischen dem neu gewachsenen Schicht und der natürlichen Zahnschmelz. (A) Querschnitt REM-Bild repariert Schicht nach Remineralisation in amelogenin-Chitosan-Gel für 3 Tage, zeigt neu aufgewachsene Schicht auf der Oberfläche des natürlichen Zahnschmelzes fusioniert. Die weißen und schwarzen Pfeile zeigen die kristallographischen Orientierungen der Kristalle in der neu gewachsenen Schicht und natürlichen Zahnschmelz auf. Die gestrichelte Linie zeigt die Grenze des natürlichen Zahnschmelz und dem neu gewachsenen Schicht. (B) HR-TEM-Bild der interGesicht zwischen Schmelz und nachgewachsenen Kristall, zeigt nahtlose Wachstum repariert Kristall auf der Schmelz. Die schwarzen Pfeile zeigen die Schnittstelle zwischen nachgewachsenen und Schmelzkristallen. Mit Genehmigung aus Lit. 16 wiedergegeben.
Abbildung 5. Bindungsstärke zwischen neu gewachsenen Schicht und Zahnschmelzoberfläche. (A) rückgestreutes Elektronenbild des Querschnitts, und (B) zweites Elektronenbild der Oberfläche eines mit Chitosan-Hydrogel erhalten Amelogenin ultraschallbehandelt neu aufgewachsenen Schicht. Einschub zeigt die typische Morphologie der Oberfläche bei höherer Vergrößerung. (C) rückgestreutes Elektronenbild der Querschnitt eines mit Chitosan-Hydrogel ohne Amelogenin erhalten ultraschallbehandelt neu aufgewachsenen Schicht. Mit Genehmigung aus Lit. 16 wiedergegeben. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Fluoreszenzaufnahmen des Querschnitts des neu aufgewachsenen Schicht. Rechteck in einer für den ausgewählten Bereich B entspricht. Die Pfeile in B zeigen die neu gewachsenen Schicht auf der Zahnschmelzoberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Härte und Elastic-Modul von gesundem Zahnschmelz, geätzte Schmelz und rekonstruierten Zahnschmelz durch Chitosan-Hydrogel mit und ohne amelogenin repariert. Die Gedankenstrich Bereich war ähnlich zu dem, was bereits berichtet worden 19. mit Genehmigung aus Lit. 16 wiedergegeben.
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Discussion
Während der Mineralgehalt des Schmelz Hoch macht es das härteste mineralisiertem Gewebe im menschlichen Körper, ist dieses biokeramischen anfällig Entmineralisierung Prozesse, die oft auftreten, wie Karies oder Erosion. Genmutationen können auch dazu führen, dünnen oder weichen Zahnschmelz, was zu einer Reihe von Erbkrankheiten der Schmelzfehlbildungen genannt Amelogenesis imperfecta 20. Oral Gesundheitsprodukten Fluorid oder CPP-ACP enthalten, sind auf dem Markt seit mehreren Jahren (dh, Lacke, Zahnpasten und Mundspülungen), um die Remineralisierung initialer Schmelzläsionen fördern gewesen. Keine dieser im Handel erhältlichen Produkte haben jedoch die Möglichkeit, die Bildung von organisierten Apatitkristalle zu fördern. Die konventionellen Behandlungen für tiefe Kavitäten Emaille beinhalten mechanisches Bohren und anschließende Befüllung mit künstlichen Materialien wie Amalgam, Keramik-oder Composite-Harze. Dieser Ansatz ist nicht ideal für die frühe Läsionen und Fällen, wenn große areas der Erosion auftreten auf Schmelz. Das ist, weil ein unverhältnismäßig hoher Anteil der gesunden Zahnschmelz muss bringt mehr Schaden auf den Zahn entfernt werden. Amalgam und Composite-Harze nur vorübergehend "Reparatur" der Zahn und solche Füllungen in der Regel nicht der Zahn der Verfall zu stoppen. Robust Haftung zwischen ursprünglichen Zahnoberfläche und die der Füllmaterialien ist eine Herausforderung, weil der Materialschrumpfung und Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung und der Mikrostruktur.
Vorteile des CS-Hydrogel AMEL
Eine alternative Strategie, um die oben genannten Herausforderungen zu überwinden, ist es, eine schmelzähnliche Schicht direkt auf die Original-Email-Oberfläche, wenn enge chemischen Kontakt zu dem natürlichen Substrat gebildet werden wieder nachwachsen. In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine neue Emailwiederaufbaustrategie, die eine amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) Hydrogel verwendet, um die organisierte Kristalle in vitro auf einem Schmelzoberfläche wachsen. Verglichen mit anderen biomimetischen treatments, ist CS-AMEL Hydrogel einfacher, für den klinischen Einsatz vorzubereiten. Neben der Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit hat es einzigartige antimikrobielle und Hafteigenschaften, die für dentale Anwendungen 16. Ein weiterer Vorteil ist, dass die robuste Schnittstelle zwischen dem synthetischen und natürlichen Schmelzkristalle fördert starke Bindung zwischen dem neu gewachsenen Schicht und der Zahnoberfläche. In der klinischen Zahnmedizin schwache Bindung ist ein Hauptgrund für die Wiederherstellungsfehler der derzeit verfügbaren Materialien. Schlechte Haftung führt in der Regel Lücken bei den Schmelz-Wiederherstellung-Schnittstelle, die das Risiko für bakterielle Leckage-und Sekundärkaries zu erhöhen. Daher kann die stabile Befestigung der neu gewachsenen Schicht in der CS-AMEL Hydrogel gebildet hat das Potenzial, die Bildung von neuem Karies am Rand der Restauration zu vermeiden und zur Verbesserung der Haltbarkeit der Restauration.
Herausforderungen und Zukunftspläne
Nach der Reparatur von Uhrelogenin-Chitosan-Hydrogel, die mechanischen Eigenschaften der geätzten Zahnschmelzoberfläche wurde bemerkenswert verbessert. Die CS-AMEL Hydrogel repariert Schmelz zeigte deutlich größere Härte und Elastizitätsmodul als Kontrollproben wegen der organisierten Bündel von Apatitkristalle ähnlich Schmelzstruktur 21. Die Technik hat jedoch die folgenden Einschränkungen: (i) die Härte und E-Modul das Niveau der natürlichen, gesunden Zahnschmelz noch nicht erfüllen, aufgrund der Anwesenheit von organischem Material und der Mangel an heirarchial prismatisch-interprismaStruktur; (Ii) die verlängerte Zeitdauer (3-7 Tage) notwendig für die Trocknung des Hydrogels und Mineralisierung abgeschlossen.
Weitere Studien sind erforderlich, um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Eine mögliche Strategie zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften wird die wiederholte Anwendung von CS-AMEL Hydrogel als ein effektiver Weg, um eine dickere Schicht repariert zu erhalten. Verdauung des organischen Materials während der Mineralisierungsprozess ist ein weiterer stragie zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Experimente sind im Gange, um die Trocknungszeit des Hydrogels sowie die Mineralisierung Fortschritt 22 verkürzen. Darüber hinaus ist es notwendig, eine Karies-Modellsystem, das die Auswirkungen von Speichelproteinen auf Kristallwachstum Konto entwickeln.
Kritische Schritte und Faktoren
Bei der Herstellung des CS-AMEL Hydrogel für Schmelz Rekonstruktion, einer der wichtigsten Schritte zur Erzielung einer emailartigen Schicht mit einer dichten Schnittstelle wird der pH-Wert des Hydrogels aufgrund der pH-abhängigen Interaktion zwischen Chitosan und Amelogenin 16. Chitosan ist ein lineares Polysaccharid-Kette, umfassend Glucosamin und N-Acetylglucosamin-Reste von β-1 ,4-glykosidische Bindungen miteinander verbunden sind. Aufgrund seiner Aminogruppen kann die chemischen und physikalischen Eigenschaften von Chitosan durch Variation des pH-Wertes des Mediums eingestellt werden. Beispielsweise in einem CS-AMEL System bei niedrigeren pH-Werten, chitosan Wechselwirkung mit Amelogenin durch elektrostatische Wechselwirkung, jedoch bei höheren pH-Wert als 5,5, war die Wechselwirkung schwach Chitosan aufgrund seiner geringen Löslichkeit und Deprotonierung 16. Dieser pH-Reaktions Eigenschaft macht Chitosan-Hydrogel nicht nur eine ideale amelogenin Träger, sondern auch eine effektive Schicht Zahnschmelz vor Erosion schützen. In einer sauren oralen Umgebung könnte die Aminogruppe von Chitosan die Wasserstoffionen zu erfassen, wodurch eine positive Barriere gegen die Diffusion von Wasserstoffionen zu der Schmelzoberfläche zu verhindern, sowie die Interaktion mit Amelogenin um seinen Verlust in den Speichel zu vermeiden. Wenn der normale pH-Wert wird durch den Speichel wieder die amelogenin von CS-AMEL Hydrogel freigesetzt, um das Nachwachsen von Schmelz steuern.
Während des Schmelz Nachwachsen, Amelogenin Gegenwart ist ein kritischer Faktor bei der Steuerung der orientierten und Streckungswachstum von Apatitkristallen. In einer CS-Hydrogel AMEL, die vorgeKeim Ca-P-Clustern durch amelogenin, Aggregat stabilisiert lin bildenOhr-Ketten, die weitere Sicherung mit Schmelzkristalle verwandelt und schließlich in den schmelzähnlichen Apatitkristalle 16,23-24. Das kontinuierliche Wachstum der Kristalle bildet einen dichten Schnittstelle, die eine ausgezeichnete Bindung zwischen dem neu gewachsenen Schicht und der Zahnschmelz fördert.
Zusammenfassend stellen wir eine vielversprechende amelogenin-Chitosan (CS-AMEL) Hydrogel für oberflächliche Zahnschmelz Wiederaufbau. Die organisierte schmelzähnlichen Mikrostruktur in dem Hydrogel kann erheblich verbessern die mechanischen Eigenschaften der geätzten Zahnschmelz; Unterdessen kann die stabile Befestigung des reparierten Schicht die Bildung von neuem Karies am Rand der Restauration zu vermeiden und möglicherweise zur Verbesserung der Haltbarkeit von Restaurationen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
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