Summary
Bu yazıda, yüzeysel emaye yeniden inşası için bir amelogenin kitosan hidrojel imalatı için bir protokol açıklar. Hidrojel apatit kristallerinin yerinde büyüme Organize restorasyonların etkinliğini ve dayanıklılığını artıracak yoğun bir emaye-restorasyon arayüzü kurdu.
Protocol
Insan dişleri Southern California Üniversitesi Diş Hekimliği Ostrow Okulu'nda çıkarılması için standart prosedürler takip ayıklanır ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile ele alındı.
1.. Asit kazınmış Diş hazırlanması Dilim
- Herhangi restore çürüğü olmayan bir insan üçüncü molar seçin.
- Molar kök kısmını çıkarın ve boylamasına kalın bir su soğutmalı düşük devirli elmas testere kullanarak dilimler 2 mm içine molar taç kesti. Ultrasonik 2 dakika boyunca bu dilimleri temiz ve daha sonra deiyonize su ile 3 kez yıkayın.
- , Aşındırıcı lezyonlar simüle 30 saniye için% 30 fosforik asit ile diş aşındırma dilim için hemen sonra iyonu giderilmiş su ile durulama.
- Ultrasonik 2 dakika için kazınmış dilimleri temizlemek ve daha sonra deiyonize su ile 3 kez yıkayın.
Amelogenin-kitosan hidrojelin 2. Hazırlanması
- Preparatlarçitosan stok çözeltisi n
- % 1 çözülür 80 ° CO / N. karıştırma ve ardından,% 1 (v / v) asetik asit çözeltisi (w / v) kitosan (orta moleküler ağırlık,% 75-85 deasetillenmiş)
- Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra çözelti, bir 0.45 um filtre kullanılarak çitosan solüsyonu filtre. 1 M NaOH çözeltisi ilave edilerek 5.0 'a pH değerini ayarlayın.
- Kalsiyum ve fosfat stok çözeltisinin hazırlanması (0.1 M)
- Kalsiyum klorür (CaCl2) tartılır ve bir 0.1 M solüsyon hazırlanır, sonra çözelti berrak olana kadar bir girdap ile karıştırın. 1 M NaOH çözeltisi eklenerek 11 pH değeri ayarlayın.
- Dibazik sodyum fosfat (Na 2 HPO 4) tartılır ve bir 0.1 M solüsyon hazırlanır, sonra çözelti berrak olana kadar bir girdap ile karıştırın.
- Ekspresyon ve rekombinant Amelogenin 17-18 saflaştırılması
Burada kullanılan rekombinant tam uzunluktaki domuz amelogenin (rP172) 172 amino asidi vardır ve tam bir analogudur-Boy nativ domuz P173, ancak N-terminal metionin gibi Ser16 18, bir fosfat grubu eksiktir.- Su, 500 ml deiyonize lizojeni suyu (LB) Agar tozu 20 g ekleyin, 20 dakika boyunca 121 ° C'de (sıvı ayar) de solüsyonu otoklav. ~ 55 ° C, agar çözeltisi içine ampisilin (100 ug / ml) ekleyin agar için soğumaya bırakın.
- Katı kadar her plaka soğuması, Petri yemekleri ağar çözüm aktarın, sonra agar üzerinde yoğunlaşmayı önlemek için çevirin. 4 ° C'de plastik torbalarda saklayın plakalar
- Gliserol stoğundan gelen yeniden birleştirici hücreler (E.coli 'de KG21) sahip hat LB agar plakası (-80 ° C). 37 ° C'de plakalar O / N inkübe
- NZCYM ortamı 50 ml hazırlayın ve 30 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav ortamı. Medya soğumasını bekleyiniz, 50 ml medyaya 100 ug / ml ampisilin 50 ul ekleyin.
- Ampicill ile takviye edilmiş 50 ml NZCYM ortamı içine LB agar levhasından tek bir koloni inoküleLütfen, 37 ° C'de çalkalayıcı bir inkübatör içinde hücreleri O / N inkübe
- NZCYM ortamı 1 L hazırlayın ve 30 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav ortamı. 1000 ml ortama 100 mg / ml ampisilin içinde 1 ml ilave edilir. UV-Vis spektrofotometre kullanılarak bir boş olarak bir optik yoğunluk (OD) okuma al. NOT: ilk okumadan sonra bu atmayın.
- Adım 2.3.6 1,000 ml ortam içine aşama 2.3.5 gelen hücre kültürü 10 ml inoküle. Inokülasyondan sonra hemen 595 nm'de optik yoğunluk okuyun. Büyüme izlemek için periyodik olarak optik yoğunluk okuma al. NOT: OD alınır her zaman boş okuyun.
- Bakteri büyümesi 595 nm 'de yaklaşık 0.75 ~ 0.8 OD ulaştığında İzopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG, 1 M), 700 ul neden.
- OD 1.1 ulaştığında hücreleri hasat. 6 plastik şişe içine şişenin içeriğini dökün. Denge ve santrifüj kullanılarak önce şişe tartın. 4 ° C'de 8554 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj-20 ° CO / N. hücre pelletini Ol
- Hücre pelet dışarı atın ve bir 50 ml tüp bunları birleştirmek. Fermentasyon, L başına 4M guanidin HCI 3.5 ml ilave edilir. 1 dakika aralıklarla buz, 30 saniye sonicate 2-3 kez, her zaman,.
- % 0.5 'lik formik asit ile hücre hacim 6x seyreltileri yapın ve 2 saat boyunca soğuk odada karıştırın sağlar. 4 ° C'de 30 dakika, 8554 x g 'için santrifüj Süpernatant tutun. Soğuk oda içindeki doymuş stok solüsyonu ve karıştırın kullanılarak% 20 doymuş amonyum sülfat eklenir, O / N
- 4 ° C'de 30 dakika, 8554 x g santrifüj ile pelet tutun. Bir C4 kolon (10 x 250 mm, 5 um) üzerinde,% 0.1 trifloroasetik asit (TFA), yük pelet sulandırın ve bir de, TFA içinde A =% 0.1 TFA ve B =% 60 asetonitril lineer bir miktar kullanılarak fraksiyonlanması , 1.5 ml min-1 akış oranı.
- Kuru buz üzerinde protein çözeltisi ve dondurma, dondurulmuş numune O / N liyofilize
- Amelogenin kitosanın hazırlanması (CS-AMEL) Hidrojen üretimiEl (Şekil 1A)
- 200 rp172 ug% 1 çitosan solüsyonu 960 ul ihtiva eden bir tüp içine ekleyin, sonra çözelti berrak olana kadar bir girdap ile karıştırın.
- Amelogenin ihtiva eden kitosan çözeltiye 0.1 M Na 2 HPO 4 çözeltisinin 15 ul ve ardından 0.1 M CaCl2 çözeltisi 25 ul, daha sonra 5 dakika boyunca bir vorteks ile karıştırın.
- Dikkatli bir şekilde 1 M NaOH çözeltisi eklenerek 6.5 'e CS-AMEL çözeltinin pH ayarlayın. PH değeri 6,5 ulaştığında CS-AMEL hidrojel oluşturacaktır.
Amelogenin-kitosan Hidrojeli 3. Emaye büyütme
- Yapay tükürük çözeltisinin hazırlanması
- Belli bir miktarda magnezyum klorür (MgCI2, 0.2 mM), kalsiyum klorür (CaCl2, 1 mM), potasyum dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4, 4 mM), potasyum klorür (KCl, 16 mM) ve amonyum klorür (çözülür 20 mM HEPES içinde NH4CI, 4.5 mM)(4 - (2-Hidroksietil) piperazin-1-etan-sülfonik asit) 12, tampon.
- 1 M NaOH ile pH 7.0 'ye ayarlayın, 4 ° C'de yapay tükürük çözelti depolamak
- Çözeltisi kullanılarak önce, sodyum florür (NaF, 300 ppm) ekleyin.
- CS-AMEL Hidrojel Uygulaması
- Bir şırınga (Şekil 1 B) kullanılarak kazınmış diş dilim için yaklaşık 20 ul CS-AMEL hidrojel uygulanır.
- 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir desikatör içinde hidrojel kaplı diş dilim kurutun.
- Yapay tükürük çözeltisi 30 ml ihtiva eden bir behere diş dilim aktarın. Alüminyum folyo ile beher Kapak ve daha sonra 7 gün boyunca 37 ° C'de bir fırın içinde beher tutun.
- Diş dilim çıkarın ve oda sıcaklığında bir desikatör içinde kurutun.
Yeni Yetiştirilen Katman ve emaye arasındaki Arayüz 4. Karakterizasyonu
Yeni yetişen tabakası ve mine arasındaki arayüzün mikro gözlenirken olduelektron mikroskobu (SEM) ve yüksek devirli transmisyon elektron mikroskobu (HR-TEM) tarayarak ved. TEM numune, odaklanmış iyon demeti (FİB) tekniği aşağıdaki gibi olduğu için adımları kullanılarak hazırlanmıştır.
- Bir yalan-SEM aracı haline örnek yükleyin ve işletme talimatlarına göre tüm hizalamalarını bitirmek. NOT: İnce Z ayarı en az 2 kez yapılmalıdır.
- Temel yapı (Şekil 2A) korumak için numune üzerine bir karbon tabakası (15 x 3 um) bırakın.
- Mill karbon tabakasının, üst alt ve sağ taraflarında Dikkatle numune numunenin ince bir parça hazırlamak, daha sonra bu ince parçanın alt tarafı kesmek. NOT: Her bir öğütme aşaması (Şekil 2B) önce İyon ışın hizasını kontrol edin.
- Kaynak Pt ince parça üzerinde uç ve örnek parça (Şekil 3C) ayırmak için sol tarafını kesti. NOT: Kaynak aşamasından önce İyon ışın hizasını kontrol edin.
- T kaldırıno yavaş yavaş numune ile uç ve bir asansör-out TEM ızgara üzerine lamel örnek monte pt.
- Kalınlığı en az 100 nm (Şekil 3D) kadar numuneden ucu ve ince numune kesin. TEM gözlemi gerçekleştirmek için aletten numuneyi çıkarın. NOT: Her inceltme işleminden önce İyon ışın hizasını kontrol edin.
Yeni Yetiştirilen Layer Binding ve Mekanik Özelliklerinin 5. Değerlendirilmesi
- Bağlama gücü, ultrasonik muamele ile değerlendirilir. 10 dakika boyunca ultrasonik temizleyici (42 kHz, 100 W) 'de tamir diş dilim tutun ve daha sonra, geri-saçılmalı elektron bir SEM analizi ile onarılan tabakası ve doğal mine arasındaki arayüzü izleyin.
- Her tamir emaye yüzeye 20 test noktaları (n = 3), bir ucu ile bir Berkovich nano-indenter olarak en sertlik ve esneklik modülüne ölçün.
6.. İmmünofloresan Boyama
- Tris büfesi i diş dilim yıkayın15 dakika boyunca r tuzlu su (TBS).
- 15 dakika süre ile TBS içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin.
- Sıvıyı çıkarın ve TBS (% 0.1 BSA,% 0.3 Triton X-100) içerisinde seyreltilmiş 1 ° Ab (1:500 tavuk anti-Amelogenin) ile örnek O / N inkübe edin.
- 30 dakika TBS ile örnek yıkayın ve TBS içinde seyreltilmiş 2 ° Ab (1:100 anti-tavuk FITC) ile O / N inkübe edin.
- 30 dakika TBS ile örnek yıkanır ve 30 dakika boyunca kurumaya bırakın.
- Floresan mikroskop ile gözlemlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen protokol etkinliği elektron mikroskobu (SEM), elektron kırınımı seçilen alan (SAED) ve X-ışını kırınımı (XRD) analizleri tarama ile gösterilmiştir. 7 gün boyunca amelogenin kitosan (CS-AMEL) hidrojel ile tamir sonra, 15 um bir kalınlığa sahip olan bir emaye benzeri tabaka kazınmış emaye yüzeyi üzerinde oluşturulmuştur. Yeni büyüyen tabaka (Şekil 3A'da oklar) yüzeyine dik olan, Cı-ekseni boyunca, tercihen artan, ~ 50 nm arasında bir çapa sahip kristallerin yüksek sıralı diziler yapıldı. Bu iğne benzeri kristaller doğal emaye (Şekil 3B) temel birim benzer demetler halinde organize olduğu dikkat çekicidir. Tamir tabakanın SAED sonucu, [002] yönünde (Şekil 3C) boyunca yeni çıkan kristaller hiyerarşik bir uyum ortaya yay şeklinde bir desen sergiledi. XRD analizi, yeni büyüyen tabaka apatit oluşmaktadır doğruladıSEM ve SEAD gözlemler (Şekil 3D) 'ye uygun olarak, c-kristalografik eksen boyunca hizalanmış olan kristaller.
Şekil 4, yeni büyüyen tabaka ve doğal emay arası bir mikro-yapısını göstermektedir. Kristalleri orijinal emaye kristalitleriyle olarak aynı yönde büyümeye vermedi unutmayın. Bu protein aracılı büyüme doğal apatit emaye kristaller (Şekil 4A) göre yeni yetiştirilen kristaller dik bir yönde neden olduğu görülebilir. Ca-P kümeleri stabilizasyonu ve Amelogenin tarafından bunların daha sonraki düzenlediği kristalleşme dahil önerilen onarım mekanizmaları önceki çalışmamızda 16 sunulmuştur. Yeni şekillendirilmiş ve özgün kristaller arasındaki ayrım emaye ve erimiş tamir tabakasında kristaller ile büyüdüğünü belirten farklı desenler gösterdi (FFT) analizi dönüşümü hızlı Fourier tarafından ortaya çıkmıştırfarklı oryantasyon 16. Bundan başka, tamir tabakası ve emaye alt-tabaka arasındaki ara yüzeyde hiçbir belirgin fark yoktur. Nano de, emaye ve yeniden çıkan kristalleri (Şekil 4B'de Siyah oklar) sorunsuz bir arayüz oluşturacak şekilde birbirlerine bağlanabilirler.
Tamir ve doğal emaye tabakası arasındaki yapışma gücü ultrasonik muamele 16 ile değerlendirildi. 10 dakika boyunca, sonikasyon sonra, CS-AMEL hidrojel içinde oluşan yeni çıkan tabaka yine sıkı bir emaye yüzey (Şekil 5A) bağlanmıştır ve organize yapısı (Şekil 5B) korundu. Amelogenin olmayan çitosan hidrojel ile muamele edilmiş numune, ancak, mine ve bir tamir tabaka arasında büyük bir boşluk ultrasonik muameleden sonra (Şekil 5C) takiben gözlendi.
Açıkça yeni büyüyen tabaka ve doğal emaye, yeni olarak Amelogenin birbirinden ayırt etmek içinly-yetiştirilen tabaka İmmünofloresan etiketli oldu. Amelogenin mevcudiyeti yeni çıkan tabaka yeşil bağışıklık (Şekil 6) ile gösterilmiştir.
Bu sertlik ve yeni çıkan tabakanın elastik modülü gibi mekanik özellikler nanoindentation testi 16 ile analiz edilmiştir. Asit emaye yüzeyin sertliği ve modülü, sırasıyla yaklaşık% 98 ve% 88 azalmıştır gravür sonra, Şekil 7'de gösterildiği gibi,. Amelogenin olmadan çitosan hidrojel ile tedavi, kontrol grubu ve sertlik modülü hem de sınırlı bir gelişme gösterdi. Bunun aksine, CS-AMEL hidrojel mineralizasyon sonra biz bir modül içinde yaklaşık 4 kat artış ve sertlik 9 kez gözlenmiştir.
Şekil 1. Amelogenin kitosan (CS-AMEL) h Fotoğrafları ydrogel tipik bir CS-AMEL hidrojel. (A) görüntü. (B) bir asit-kazınmış diş dilim üzerindeki CS-AMEL Hidrojel Uygulaması.
Şekil 2.. TEM numune hazırlama için tipik odaklanmış iyon-ışın süreci. Tamir emaye yüzeyi üzerinde bir karbon tabakası (A) Biriktirme. (B) numunenin ince bir parçası hazırlamak için, bir karbon tabakası etrafında dikkatli bir şekilde örnek Freze. (C) ince parça üzerinde Pt ucu Kaynak. (D) örnek inceltme kalınlığı az 100 nm olana kadar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
7 gün boyunca amelogenin kitosan hidrojel mineralizasyon sonra yeni yetiştirilen tabakanın Şekil 3.. Karakterizasyonu. (A) amelogenin kitosan hidrojel, kazınmış minesinin yüzeyinde oluşan sırlı bir benzeri tabaka ile mineralizasyon 7 gün sonra. Ankastre yeni yetiştirilen tabakasının kalınlığını göstermektedir; dikdörtgen A karşılık alanını gösterir. Beyaz oklar yeni yetiştirilen tabakadaki apatit yönelimleri göstermektedir. Organize kristaller (B) Paketler tamir katman içinde bulunmuştur. Oklar, yeni büyüyen tabaka içindeki paralel kristallerinin tipik bir paket işaret etmektedir. Ankastre tamir tabakanın homojen yüzeyini göstermektedir. Yeni yetiştirilen tabakasının (C) seçilen bölge elektron difraksiyonu (SAED) görüntüsü. Ankastre odaklanmış iyon demeti (FİB) freze ile hazırlanabilir tamir tabakanın TEM görüntüsünü gösterir. Yeni yetiştirilen tabakanın (D) XRD spektrumu, sonra7 gün boyunca amelogenin kitosan hidrojel cevherleşmesi. Referans 16 izniyle yayınlanmıştır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Yeni büyüyen tabaka ve doğal mine arasındaki arayüzün Şekil 4.. Mikroyapı. Doğal emaye yüzeyine bağlı yeni büyüyen tabaka gösteren 3 gün boyunca amelogenin kitosan jel remineralizasyon sonra tamir tabakasının (A) kesit SEM görüntüsü. Beyaz ve siyah oklar yeni büyüyen tabaka ve doğal emaye kristallerin kristalografik yönelimleri gösterir, sırasıyla. Inter kesikli çizgi doğal mine ve yeni çıkan tabakanın sınır göstermektedir. (B) HRTEM imagemine üzerinde tamir kristal kesintisiz büyüme gösteren, mine ve regrown kristal arasındaki yüz. Siyah oklar regrown ve mine kristalleri arasındaki arayüz gösterir. Referans 16 izniyle yayınlanmıştır.
Şekil 5,. Yeni büyüyen tabaka ve emaye yüzeyi arasında gücü bağlama. Kesiti ve (B) chitosan-amelogenin hidrojeli ile elde edilen bir ultrasonik muamele edilmiş yeni yetiştirilen tabakanın yüzeyinin ikinci elektron görüntüsü (A) Geri-saçılmalı elektron görüntüsü. Ankastre daha yüksek bir büyütmede yüzeyin tipik morfolojisi gösterir. (C) Amelogenin olmayan chitosan hidrojeli ile elde edilen bir ultrasonik muamele edilmiş yeni yetiştirilen tabakanın enine kesitinin Geri-saçılmalı elektron görüntüsü. Referans 16 izniyle yayınlanmıştır. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Yeni yetiştirilen tabakanın kesitinin Şekil 6,. Floresans ve görüntüler. A'da Dikdörtgen B'ye karşılık gelen seçilmiş alanını temsil eder. B oklar mine yüzeyinde yeni yetişen katmanını gösterir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 7. Sertlik ve elasSağlıklı emaye, kazınmış emaye ve ve Amelogenin olmadan kitosan hidrojel tarafından onarılan yeniden minesinin tik modülü. girinti alan daha önce 19. referans 16. izniyle yayınlanmıştır bildirilmiştir ne benzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Emaye mineral içeriği yüksek o insan vücudunda zor mineralize doku yapıyor olsa da, bu biyoseramik sık diş çürüğü ya da erozyon gibi ortaya demineralizasyon süreçleri, açıktır. Gen mutasyonları da Amelogenesis imperfekta 20 denilen emaye malformasyon kalıtsal hastalıkların bir dizi önde gelen ince veya yumuşak minesini neden olabilir. Florür veya CPP-ACP içeren ağız sağlık-bakım ürünleri birkaç yıl ilk mine lezyonlarının reminerilizasyonunu teşvik etmek (yani, cilalar, diş macunları ve ağız gargaraları) için piyasada olmuştur. Ancak, bu ticari olarak temin edilebilen ürünlerin hiçbiri düzenlenmiş apatit kristallerinin oluşmasını teşvik etmek için bir potansiyele sahiptir. Derin emaye boşlukları için geleneksel tedaviler, mekanik sondaj ve böyle amalgam, seramik veya kompozit reçine gibi yapay malzemelerle sonraki dolgu içerir. Böyle bir yaklaşım, erken lezyonlar ve durumlar için ideal değil zaman büyük arErozyonun EAS emaye oluşur. Sağlıklı emaye orantısız bir miktar dişe daha fazla zarar getiren kaldırılması gerekir çünkü bu. Amalgam ve kompozit reçineleri sadece geçici 'onarım' diş ve diş gibi dolgular, genellikle dişin çürümesini bitmiyor. Orijinal diş yüzeyi ve dolgu malzemelerinin arasındaki sağlam yapışma çünkü malzeme çekmesi ve kimyasal bileşimi ve mikro farklılıklar bir sorundur.
CS-AMEL hidrojelin avantajları
Yukarıdaki zorlukların üstesinden gelmek için, alternatif bir strateji, doğrudan doğal alt-tabakaya geçirmez kimyasal temas oluşturulabilir orijinal emaye yüzeyin üzerine bir emaye benzeri tabaka regrow etmektir. Bu video makalede, biz bir emaye yüzey in vitro organize kristaller büyümeye amelogenin kitosan (CS-AMEL) hidrojel kullanan yeni bir emaye yeniden yapılanma stratejisi tartışılmaktadır. Diğer biomimetic yüzey işlenme ile karşılaştırıldığındants, CS-AMEL hidrojel, klinik kullanım için hazırlanması daha kolaydır. Biyouyumluluk ve biyolojik olarak bozunabilmeleri Bunun yanı sıra, bu uygulama diş 16 için önemli olan tek antimikrobiyal ve yapışma özellikleri vardır. Bir başka avantaj ise, sentetik ve doğal emaye kristalleri arasında sağlam arayüz yeni çıkan tabaka ile diş yüzeyi arasında güçlü bir bağ teşvik olmasıdır. Klinik Diş hekimliğinde zayıf bağ mevcut malzemelerin restorasyon başarısızlığın ana nedenidir. Kötü yapışma genellikle bakteriyel sızıntı ve ikincil çürük riskini artırır ki, emaye-restorasyon arayüzü boşluklar sonuçlanır. Bu nedenle, CS-AMEL hidrojel oluşan yeni yetişen tabakasının sağlam eki restorasyon marjı yeni çürük oluşumunu önlemek ve restorasyonların dayanıklılığını artırmak için potansiyele sahiptir.
Zorluklar ve Gelecek Planları
Am onarıldıktan sonraelogenin-kitosan hidrojel, kazınmış emaye yüzeyin mekanik özellikleri önemli ölçüde iyileştirilmiştir. CS-AMEL hidrojel tamir emaye için Emaye yapısına 21 benzer bir apatit kristallerin düzenli demetleri önemli ölçüde daha fazla sertlik ve kontrol örneklerinden daha elastik modüle gösterdi. Bu teknik, bununla birlikte, aşağıdaki sınırlamalara sahiptir: (i) sertlik modülü ve yine bağlı olarak organik madde ve heirarchial prizmatik-interprismatic yapısının eksikliği varlığı doğal sağlıklı bir emaye seviyesini uygun değildir; (Ii) süresi uzatılmış miktarı (3-7 gün) tamamlamak için hidrojel ve mineralizasyonu kurutma için gerekli.
Daha ileri çalışmalar, yukarıda sınırlamalarını aşmak için gereklidir. Mekanik özellikleri geliştirmek için olası bir strateji daha kalın bir tabakanın elde edilmesi için tamir etkili bir yol olarak CS-AMEL hidrojelin tekrarlanan uygulama olacaktır. Mineralizasyon işlemi sırasında organik maddenin sindirim bir stra olduğumekanik özelliklerini geliştirmek için Tegy. Deneyler göstermiştir ki, hidrojelin kurutma süresini hem de ilerleme mineralizasyon 22 kısaltmak için devam etmektedir. Buna ek olarak, bu kristal büyümesi üzerinde tükürük proteinlerin etkileri için de bir çürük model sistemi geliştirmek için gereklidir.
Kritik Adımlar ve Faktörler
Emaye yeniden yoğun bir arayüzü ile bir emaye gibi bir tabaka elde etmek için en önemli adımlardan biri için CS-AMEL hidrojel hazırlanmasında nedeniyle kitosan ve Amelogenin 16 arasında pH değerine bağımlı etkileşimi hidrojelin pH değerinin ayarlanması edilir. Chitosan β-1 ,4-glikosidik bağları ile bir araya glukozamin ve N-asetil glukosamin tortusu ihtiva eden lineer zincirli bir polisakkarittir. Çünkü, amino grupları, kitosan, kimyasal ve fiziksel özellikleri, ortamın pH değeri değiştirilerek ayarlanabilir. Örneğin, CS-AMEL sisteminde, daha düşük pH değerlerinde, chitosan ancak 5.5 'den daha yüksek bir pH değerinde, elektrostatik etkileşimi yoluyla Amelogenin ile etkileşim, çitosan etkileşim nedeniyle düşük çözünürlüğünde ve deprotone 16 zayıftı. Bu pH-yanıt özelliği kitosan hidrojel, sadece bir tanesi amelogenin bir taşıyıcı, aynı zamanda erozyondan minesi koruyucu etkili bir katman sağlar. Asidik bir ağız ortamında, kitosan amino grubu pozitif emaye yüzeyine hidrojen iyonlarının difüzyonunu önlemek için bir engel, hem de tükürük içine kaybedilmesini önlemek için Amelogenin ile etkileşim oluşturan, hidrojen iyonu yakalamak olabilir. Normal tükürük pH geri yüklendiği zaman amelogenin emaye büyümesini kontrol etmek için CS-AMEL hidrojel salınır.
Emaye büyütme sırasında amelogenin varlığı apatit kristaller odaklı ve uzatılmış büyüme kontrolünde önemli bir faktördür. CS-AMEL hidrojel, amelogenin, agrega stabilize öncesi çekirdeklenme Ca-P kümeleri, lin oluşturmak içinsonuçta daha emaye kristalleri ile sigorta ve emaye gibi apatit kristalleri 16,23-24 için dönüştürür kulak zincirleri. Kristallerinin sürekli büyüme yeni çıkan tabaka ile mine arasında mükemmel bir bağ teşvik eden bir yoğun bir arayüz oluşturur.
Özetle, biz yüzeysel emaye yeniden inşası için umut verici bir amelogenin kitosan (CS-AMEL) hidrojel tanıtmak. Hidrojel oluşan organize emaye gibi mikro önemli kazınmış emaye mekanik özelliklerini artırabilir; Bu arada, tamir tabakasının sağlam eki restorasyon marjı yeni çürük oluşumunu engellemek ve potansiyel restorasyonların dayanıklılığını artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
