Summary
In questo articolo descriviamo un protocollo per la realizzazione di un idrogel amelogenin-chitosano per la ricostruzione superficiale dello smalto. Organizzato in crescita in situ di cristalli di apatite in idrogel formata una densa interfaccia smalto-restauro, che permetterà di migliorare l'efficacia e la durata dei restauri.
Protocol
I molari umani sono stati estratti seguendo le procedure standard per l'estrazione presso la Scuola Ostrow di Odontoiatria della University of Southern California e trattati con l'approvazione del Comitato Istituzionale.
1. Preparazione del dente acidato Slice
- Selezionare un terzo molare umano, senza carie restaurati.
- Rimuovere la porzione di radice del molare, e tagliare la corona del molare longitudinalmente in fette 2 mm di spessore con un basso numero di giri disco diamantato raffreddato ad acqua. Pulire con ultrasuoni queste fette per 2 minuti e poi sciacquare con acqua deionizzata per 3 volte.
- Per simulare lesioni erosive, incidere le fette di dente con acido fosforico al 30% per 30 sec poi sciacquare immediatamente con acqua deionizzata.
- Ultrasuoni pulire le fette incise per 2 minuti e poi sciacquare con acqua deionizzata per 3 volte.
2. Preparazione di Amelogenina-chitosano Hydrogel
- Preparation di chitosano soluzione madre
- Sciogliere 1% (w / v) chitosano (peso molecolare medio, 75-85% deacetilato) in una (v / v) soluzione di acido acetico 1% seguita da agitazione a 80 ° CO / N.
- Dopo raffreddamento la soluzione a RT, filtrare la soluzione di chitosano con un filtro da 0,45 micron. Regolare il pH a 5,0 con l'aggiunta di soluzione 1 M NaOH.
- Preparazione di calcio e fosfato soluzione madre (0.1 M)
- Pesare cloruro di calcio (CaCl 2) e preparare una soluzione 0.1 M, quindi mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Regolare il pH a 11 con l'aggiunta di soluzione 1 M NaOH.
- Pesare sodio fosfato bibasico (Na 2 HPO 4) e preparare una soluzione 0.1 M, quindi mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida.
- Espressione e purificazione di amelogenin ricombinante 17-18
L'intera lunghezza amelogenin suina ricombinante (rP172) qui utilizzato ha 172 aminoacidi ed è un analogo della pienaLunghezza porcine P173 nativo, ma manca la metionina N-terminale e un gruppo fosfato sulla Ser16 18.- Aggiungere 20 g di lisogenia brodo (LB) Agar polvere in 500 ml di acqua deionizzata, la soluzione in autoclave a 121 ° C (impostazione di liquido) per 20 min. Lasciate raffreddare agar a ~ 55 ° C, aggiungere ampicillina (100 pg / ml) in soluzione di agar.
- Trasferire la soluzione di agar per piastre di Petri, lasciare che ogni piastra fredda finché è solido, quindi capovolgere per evitare la condensa sulla agar. Piastre Conservare in sacchetti di plastica a 4 ° C.
- Streak piastra di agar LB con cellule ricombinanti (E.coli-BC21) dal glicerolo magazzino (-80 ° C). Incubare le piastre O / N a 37 ° C.
- Preparare 50 ml di media NZCYM e autoclave mezzi di comunicazione a 121 ° C per 30 min. Lasciare i media a raffreddare, aggiungere 50 ml di 100 pg / ml ampicillina alle 50 ml media.
- Inoculare una singola colonia dalla piastra di agar LB in media 50ml NZCYM supplementato con ampicilltrovi Incubare le cellule O / N in un incubatore agitazione a 37 ° C.
- Preparare 1 L di supporti NZCYM autoclave e il supporto a 121 ° C per 30 min. Aggiungere 1 ml di 100 mg / ml di ampicillina a 1.000 ml media. Prendere una densità ottica di lettura (OD) come bianco, utilizzando un UV-Vis. NOTA: Non smaltire questo dopo la prima lettura.
- Inoculare 10 ml di coltura cellulare dal punto 2.3.5 in 1.000 ml supporti dal punto 2.3.6. Leggere la densità ottica a 595 nm immediatamente dopo l'inoculazione. Prendere la lettura di densità ottica per tenere traccia della crescita. NOTA: Leggere il vuoto ogni volta che l'OD è presa.
- Indurre con 700 ml di isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 M) quando la crescita batterica raggiunge a circa 0,75 ~ 0,8 OD a 595 nm.
- Raccogliere le cellule quando il diametro raggiunge 1.1. Versare il contenuto del matraccio in 6 bottiglie di plastica. Equilibrio e pesare le bottiglie prima di utilizzare la centrifuga. Centrifugare per 20 min a 8554 xg a 4 ° C.Mantenere il pellet di cellule nel -20 ° CO / N.
- Estrarre i pellet cellulari e combinarli in un tubo da 50 ml. Aggiungere 3,5 ml di HCl 4M Guanidina per L di fermentazione. Tempi ultrasuoni 2-3 su ghiaccio, 30 sec ogni volta, con intervalli di 1 min.
- Effettuare diluizioni 6x di volume delle cellule con 0,5% di acido formico e lasciare mescolare nella stanza fredda per 2 ore. Centrifugare per 30 min, 8554 xga 4 ° C. Conservare il surnatante. Aggiungi il 20% di solfato di ammonio satura utilizzando la soluzione magazzino saturi e scalpore nella stanza fredda, O / N.
- Centrifugare per 30 min, 8.554 xg a 4 ° C e mantenere il pellet. Ricostituire il pellet in 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA), carico su una colonna C4 (10 x 250 mm, 5 micron), e frazionare usando un gradiente lineare di A = 0,1% TFA e B = 60% acetonitrile in TFA, in un portata di 1,5 ml · min -1.
- Congelare la soluzione proteica in ghiaccio secco e liofilizzare il campione congelato O / N.
- Preparazione di amelogenina-chitosano (CS-AMEL) HYDROGel (Figura 1A)
- Aggiungere 200 mg di rp172 in una provetta contenente 960 ml di soluzione di chitosano 1%, quindi mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida.
- Aggiungere 25 ml di 0,1 M CaCl 2 soluzione seguiti da 15 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 soluzione alla soluzione di chitosano-amelogenina contenente, poi miscelare con un vortex per 5 min.
- Aggiustare il pH della soluzione di CS-AMEL a 6,5 aggiungendo con precauzione soluzione 1 M NaOH. CS-AMEL idrogel si forma quando il pH raggiunge 6,5.
3. Smalto ricrescita in Amelogenina-chitosano Hydrogel
- Preparazione della soluzione di saliva artificiale
- Sciogliere una certa quantità di cloruro di magnesio (MgCl2, 0,2 mM), cloruro di calcio (CaCl 2, 1 mM), potassio diidrogeno fosfato (KH 2 PO 4, 4 mM), cloruro di potassio (KCl, 16 mM) e cloruro di ammonio ( NH 4 Cl, 4,5 mm) in 20 mM HEPES(4 - (2-idrossietil) piperazina-1-etano-solfonico) tampone 12.
- Aggiustare il pH a 7,0 con 1 M NaOH e conservare la soluzione di saliva artificiale a 4 ° C.
- Prima di utilizzare la soluzione, aggiungere fluoruro di sodio (NaF, 300 ppm).
- Applicazione del CS-AMEL idrogel
- Applicare circa 20 microlitri CS-AMEL idrogel alla fetta dente incise usando una siringa (Figura 1B).
- Asciugare la fetta dente idrogel coperto in un essiccatore a temperatura ambiente per 2 ore.
- Trasferire la fetta dente in un becher contenente 30 ml di soluzione di saliva artificiale. Coprire il becher con foglio di alluminio, e quindi mantenere il becher in stufa a 37 ° C per 7 giorni.
- Rimuovere la fetta dente e asciugarlo in un essiccatore a temperatura ambiente.
4. Caratterizzazione di interfaccia tra il livello di nuova produzione e smalto
La microstruttura dell'interfaccia tra lo strato appena cresciuti e smalto era osserato il microscopio elettronico a scansione (SEM) e alta rivoluzione microscopia elettronica a trasmissione (HR-TEM). Il campione TEM è stato preparato usando un fascio ionico focalizzato (FIB) tecnica, i passaggi per i quali sono come segue.
- Caricare il campione in uno strumento FIB-SEM e finire tutti gli allineamenti secondo le istruzioni per l'uso. NOTA: La regolazione fine Z dovrebbe essere effettuata almeno 2 volte.
- Depositare uno strato di carbonio (15 × 3 micron) sul campione per proteggere la struttura sottostante (Figura 2A).
- Mill il campione attentamente i lati superiore, inferiore e destro strato di carbone per preparare un sottile pezzo di campione, e poi tagliare il lato inferiore di questo pezzo sottile. NOTA: Controllare l'allineamento del fascio Ion prima di ogni passo di fresatura (Figura 2B).
- Saldare una punta Pt sul pezzo sottile e tagliare il lato sinistro per separare il pezzo campione (Figura 3C). NOTA: Controllare l'allineamento fascio di ioni prima della fase di saldatura.
- Sollevare tegli pt punta con il campione lentamente, e montare il campione lamellare su una griglia TEM lift-out.
- Staccare la punta dal campione, e sottile il campione fino a quando il suo spessore è inferiore a 100 nm (Figura 3D). Togliere il campione dal strumento per eseguire l'osservazione TEM. NOTA: Controllare l'allineamento del fascio Ion prima di ogni processo di assottigliamento.
5. Valutazione delle proprietà di legame e meccaniche del livello di nuova produzione
- La forza di legame è valutata mediante trattamento ultrasonico. Mantenere la fetta dente riparato in ultrasuoni (42 kHz, 100 W) per 10 minuti, e poi osservare l'interfaccia tra lo strato riparato e smalto naturale con elettroni retrodiffusi analisi SEM.
- Misurare la durezza e il modulo elastico a 20 punti di prova di ciascun superficie dello smalto riparato (n = 3) da un nano-penetratore con una punta Berkovich.
6. Immunofluorescenza
- Lavare la fetta dente con Tris buffer salino (TBS) per 15 min.
- Bloccare con 1% di siero albumina bovina (BSA) in TBS per 15 min.
- Rimuovere il liquido e incubare il campione O / N con 1 ° Ab (1:500 pollo Anti-Amelogenina) diluiti in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Lavare il campione con TBS per 30 min e incubare O / N con 2 ° Ab (1:100 FITC anti-pollo) diluiti in TBS.
- Lavare il campione con TBS per 30 minuti e lasciare asciugare per altri 30 min.
- Osservate al microscopio a fluorescenza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'efficacia del protocollo qui descritto è dimostrato dalla microscopia elettronica a scansione (SEM), regione selezionata diffrazione elettronica (SAED) e diffrazione di raggi X (XRD) analisi. Dopo la riparazione da amelogenin-chitosano (CS-AMEL) idrogel per 7 giorni, uno strato simile allo smalto con uno spessore di 15 um era formato sulla superficie dello smalto incisa. Lo strato appena cresciuto era fatto di matrici altamente ordinato di cristalli con un diametro di circa 50 nm, cresce preferenzialmente lungo l'asse c, perpendicolare alla superficie (frecce nella Figura 3A). È interessante notare che questi cristalli aghiformi sono state organizzate in fasci, che sono simili alle unità fondamentali di smalto naturale (Figura 3B). Il risultato SAED di strato riparato esposto un modello arcuata rivelando un allineamento gerarchica dei cristalli di nuova produzione lungo la [002] direzione (Figura 3C). Analisi XRD confermato che il livello appena cresciuto era composta apatitecristalli, che sono stati allineati lungo l'asse c cristallografica, secondo le SEM e SEAD osservazioni (Figura 3D).
La Figura 4 mostra la microstruttura dell'interfaccia tra lo strato appena cresciuto e smalto naturale. Si noti che i cristalli non crescevano nelle stesse direzioni come cristalliti originale smalto. Si può notare che la crescita apatite proteina mediata determinato un orientamento perpendicolare di cristalli appena cresciuti relativi ai cristalli di smalto naturali (Figura 4A). I meccanismi di riparazione proposte, tra cui la stabilizzazione di Ca-P grappoli e la loro successiva cristallizzazione organizzato da amelogenin sono stati presentati nel nostro studio precedente 16. La distinzione tra i cristalli neoformato e originali è stato rivelato dalla trasformata veloce di Fourier (FFT) che ha mostrato diversi modelli indicanti che i cristalli dello smalto e nello strato riparato fuso cresciuti condiverso orientamento 16. Inoltre, non vi sia spazio apparente all'interfaccia tra lo strato riparato e il substrato smalto. Su scala nanometrica, lo smalto e cristalli ricresciuti fusi insieme per formare un interfaccia senza soluzione di continuità (frecce nere in Figura 4B).
La forza di adesione tra lo strato riparato e smalto naturale è stata valutata mediante trattamento ultrasonico 16. Dopo sonicazione per 10 minuti, lo strato appena cresciuti formata nella idrogel CS-AMEL era ancora strettamente legata alla superficie dello smalto (Figura 5A), e la struttura organizzata è stata conservata (Figura 5B). Per il campione trattato con idrogel di chitosano senza amelogenina, tuttavia, un grande divario tra lo smalto e uno strato riparato è stata osservata dopo il trattamento con ultrasuoni (Figura 5C).
Per distinguere chiaramente tra il livello appena cresciuto e lo smalto naturale, il amelogenin nel nuovostrato ly-grown stato etichettato immunofluorescenza. La presenza di amelogenin è stato dimostrato dal immunofluorescenza verde nello strato appena cresciuti (Figura 6).
Proprietà meccaniche come durezza e modulo elastico dello strato appena cresciuti sono stati analizzati con il test nanoindentazione 16. Come mostrato in figura 7, a seguito di incisione chimica la durezza e modulo di superficie dello smalto diminuito quasi il 98% e 88%, rispettivamente. Il gruppo di controllo trattato con idrogel di chitosano senza amelogenin ha mostrato soltanto un miglioramento limitato sia nella durezza e modulo. Al contrario, dopo mineralizzazione nel idrogel CS-AMEL, abbiamo osservato un aumento di circa 4 volte in modulo e 9 volte in durezza.
Figura 1. Fotografie di amelogenin-chitosano (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Immagine di un tipico idrogel CS-AMEL. (B) Utilizzazione della idrogel CS-AMEL su una fetta di dente acidato.
Figura 2. Tipico processo mirato-ion-beam per la preparazione del campione TEM. (A) Deposizione di uno strato di carbonio sulla superficie dello smalto riparato. (B) fresatura attentamente il campione intorno uno strato di carbonio per preparare un pezzo sottile di campione. (C) saldatura la punta Pt sul pezzo sottile. (D) Diluizione campione fino a quando il suo spessore è inferiore a 100 nm. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figura 3. Caratterizzazione dello strato appena cresciuta dopo mineralizzazione in amelogenin-chitosano idrogel per 7 giorni. (A) Dopo 7 giorni di mineralizzazione con amelogenin-chitosano idrogel, uno strato di smalto-come formato sulla superficie dello smalto inciso. Inserto mostra spessore dello strato appena cresciuta; rettangolo mostra l'area corrispondente a A. Frecce bianche indicano gli orientamenti apatite nello strato appena cresciuta. (B) I pacchi di cristalli organizzati sono stati trovati all'interno dello strato riparato. Le frecce indicano un fascio tipico di cristalli paralleli all'interno dello strato appena cresciuta. Inserto mostra la superficie omogenea dello strato riparato. Immagine (C) Area selezionata diffrazione elettronica (SAED) dello strato appena cresciuta. Inserto mostra TEM immagine del livello riparato preparato da fascio ionico focalizzato (FIB) fresatura. (D) XRD spettri dello strato appena cresciuta dopomineralizzazione in un idrogel amelogenin-chitosano per 7 giorni. Riprodotto con il permesso di riferimento 16. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Microstruttura di interfaccia tra lo strato appena cresciuto e smalto naturale. (A) Sezione SEM immagine di strato riparato dopo rimineralizzazione in gel amelogenin-chitosano per 3 giorni, mostra strato appena cresciuta fusa alla superficie dello smalto naturale. Le frecce bianche e nere indicano le orientazioni cristallografiche dei cristalli nello strato appena cresciuto e smalto naturale, rispettivamente. La linea tratteggiata mostra il confine dello smalto naturale e lo strato appena cresciuti. (B) immagine HRTEM delle interrelazionifaccia tra lo smalto e cristallo ricresciuti, mostrando una crescita continua di cristallo riparato sullo smalto. Le frecce nere indicano l'interfaccia tra cristalli ricresciuti e smalto. Riprodotto con il permesso di riferimento 16.
Figura 5. Legatura forza tra lo strato appena cresciuta e superficie dello smalto. (A) immagine elettroni retrodiffusi della sezione trasversale, e (B) secondo elettronica dell'immagine della superficie di uno strato di nuova cresciuto ultrasuoni trattati ottenuto con chitosano-amelogenin idrogel. Inserto mostra la tipica morfologia della superficie con un ingrandimento maggiore. (C) immagine elettroni retrodiffusi della sezione trasversale di uno strato di nuova cresciuto ultrasuoni trattati ottenuto con idrogel di chitosano senza amelogenin. Riprodotto con il permesso di riferimento 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Immagini di fluorescenza della sezione trasversale dello strato appena cresciuta. Rettangolo in A rappresenta la regione selezionata corrispondente a B. Le frecce in B indicano il livello appena cresciuti sulla superficie dello smalto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Durezza e elamodulo tic di smalto sano, smalto mordenzato, e smalto ricostruita riparato da idrogel di chitosano con e senza amelogenin. L'area trattino era simile a quello che è stato riportato in precedenza 19. Riprodotto con il permesso di riferimento 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mentre il contenuto minerale di smalto è elevato rendendo più difficile il tessuto mineralizzato nel corpo umano, questa bioceramica è suscettibile di processi di demineralizzazione, che spesso si verificano come carie o erosione. Mutazioni genetiche possono anche causare lo smalto sottili o morbidi che portano a una serie di malattie ereditarie di smalto malformazione chiamata Amelogenesi Imperfetta 20. Prodotti per la salute orale contenenti fluoruro o CPP-ACP sono stati sul mercato per diversi anni (cioè, lacche, dentifrici e collutori) per promuovere la rimineralizzazione di lesioni dello smalto iniziale. Tuttavia, nessuno di questi prodotti disponibili in commercio hanno il potenziale per promuovere la formazione di cristalli di apatite organizzati. I trattamenti convenzionali per smalto cavità profonde coinvolgono foratura meccanica e successivo riempimento con materiali artificiali come amalgama, ceramica o resine composite. Tale approccio non è l'ideale per i primi lesioni e casi in cui grandi areas di erosione si verificano su smalto. Questo perché una quantità sproporzionata di smalto sano deve essere rimosso portare più danni al dente. Resine amalgama e composito solo temporanea 'riparare' il dente e tali otturazioni in genere non si fermano decadimento del dente. Adesione robusto tra superficie del dente originale e quella dei materiali di riempimento è una sfida a causa del ritiro del materiale e differenze di composizione chimica e microstruttura.
Vantaggi del CS-AMEL Hydrogel
Una strategia alternativa per superare i problemi di cui sopra è di ricrescere uno strato simile allo smalto direttamente sulla superficie dello smalto originale quando stretto contatto chimico al substrato naturale può essere formato. In questo articolo il video, vi presentiamo una strategia di ricostruzione smalto romanzo che utilizza un amelogenina-chitosano (CS-AMEL) idrogel a crescere cristalli organizzate in vitro su una superficie dello smalto. Rispetto ad altri Cure biomimeticaNTS, CS-AMEL idrogel è più facile preparare per uso clinico. Oltre alla biocompatibilità e biodegradabilità, ha uniche proprietà antimicrobiche e di adesione che sono importanti per applicazioni dentali 16. Un altro vantaggio è che la robusta interfaccia tra il sintetico e cristalli di smalto naturali promuove forte legame tra lo strato appena cresciuti e la superficie del dente. In odontoiatria clinica legame debole è una delle ragioni principali del fallimento restauro dei materiali attualmente disponibili. Scarsa aderenza di solito si traduce in spazi all'interfaccia smalto-restauro, che aumentano il rischio di perdite batterica e carie secondarie. Pertanto, il robusto attacco dello strato appena cresciuti formata nella idrogel CS-AMEL ha il potenziale per evitare la formazione di nuove carie al margine della ristorazione e migliorare la durata dei restauri.
Sfide e Progetti per il futuro
Dopo la riparazione da parte di amidrogel elogenin-chitosano, le proprietà meccaniche della superficie dello smalto mordenzato erano notevolmente migliorata. Lo smalto idrogel-riparato CS-AMEL mostrato significativamente maggiore durezza e modulo elastico di campioni di controllo a causa dei fasci organizzate di cristalli di apatite simili alla struttura dello smalto 21. La tecnica ha però le seguenti limitazioni: (i) la durezza e il modulo ancora non soddisfano il livello di smalto naturale sano per la presenza di materiale organico e la mancanza di heirarchial struttura prismatica-interprismatico; (Ii) l'importo esteso di tempo (3-7 giorni) necessario per l'essiccazione l'idrogel e la mineralizzazione per completare.
Ulteriori studi sono necessari per superare le limitazioni di cui sopra. Una possibile strategia per migliorare le proprietà meccaniche sarà l'applicazione ripetuta di CS-AMEL idrogel come un modo efficace per ottenere uno strato più spesso riparato. Digestione del materiale organico durante il processo di mineralizzazione è un'altra straTEGIA per migliorare le proprietà meccaniche. Esperimenti sono in corso per abbreviare il tempo di asciugatura del idrogel nonché i progressi mineralizzazione 22. Inoltre, è necessario sviluppare un sistema modello carie che rappresentano gli effetti delle proteine salivari sulla crescita dei cristalli.
Fasi critiche e dei Fattori
Nel preparare l'idrogel CS-AMEL per la ricostruzione smalto, una delle fasi più critiche per raggiungere un livello simile allo smalto con un'interfaccia densa è la regolazione del valore pH di idrogel dovuto all'interazione pH-dipendente tra chitosano e amelogenin 16. Il chitosano è un polisaccaride a catena lineare comprendente glucosammina e residui glucosamina N-acetil unite da legami β-1 ,4-glicosidici. A causa dei suoi gruppi amminici, le proprietà chimiche e fisiche del chitosano possono essere sintonizzati variando i valori di pH dei media. Ad esempio, in un sistema CS-AMEL, a valori di pH inferiori, chitosan interagito con amelogenin attraverso l'interazione elettrostatica, tuttavia a pH superiore a 5,5, l'interazione chitosano era debole a causa della sua bassa solubilità e deprotonazione 16. Questa caratteristica pH-reattività rende idrogel chitosano non solo un vettore amelogenina ideale, ma anche un efficace strato protegge lo smalto dall'erosione. In un ambiente orale acido, il gruppo amminico del chitosano potrebbe catturare gli ioni idrogeno, formando una barriera positivo per prevenire la diffusione di ioni idrogeno alla superficie dello smalto, così come interagire con amelogenin di evitarne la perdita nella saliva. Quando il pH normale viene ripristinata la saliva amelogenin viene rilasciato dal CS-AMEL idrogel per controllare la ricrescita di smalto.
Durante la ricrescita dello smalto, presenza amelogenin è un fattore critico nel controllo della crescita orientata e allungata dei cristalli di apatite. In un idrogel CS-AMEL, i pre-nucleazione Ca-P cluster stabilizzati con amelogenina, aggregati per formare lincatene orecchio che ha ulteriormente fusibile con cristalli di smalto e, infine, trasforma per smalto-come cristalli di apatite 16,23-24. La continua crescita di cristalli di forma un denso interfaccia, che promuove un eccellente legame tra lo strato appena cresciuti e lo smalto.
In sintesi, si introduce una amelogenin-chitosano (CS-AMEL) idrogel promettente per la ricostruzione superficiale dello smalto. La microstruttura simile allo smalto organizzata formata nella idrogel può migliorare significativamente le proprietà meccaniche di smalto mordenzato; Nel frattempo, il robusto attacco dello strato riparato può evitare la formazione di nuove carie al margine della ristorazione e potenzialmente migliorare la durata della protesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
