Summary
I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att tillverka en amelogenin-chitosan hydrogel för ytlig emalj rekonstruktion. Anordnades in situ-tillväxten av apatitkristaller i hydrogelen bildas en tät emalj-restaurering gränssnitt, som kommer att förbättra effektiviteten och varaktigheten för restaurationer.
Protocol
De mänskliga molarer extraherades efter standardförfaranden för utvinning vid Ostrow Tandläkarhögskolan vid University of Southern California och hanteras med godkännande av Institutional Review Board.
1. Beredning av syra-etsat Tooth Slice
- Välj en mänsklig tredje molar utan restaurerade karies.
- Avlägsna rotdelen av den molära och skars kronan av den molära longitudinellt i skivor 2 mm tjock med användning av en vattenkyld lågvarviga diamantsåg. Rengöras med ultraljud dessa skivor i 2 minuter, och skölj dem med avjoniserat vatten 3 gånger.
- För att simulera eroderande skador, etsa tand skivor med 30% fosforsyra under 30 sek sedan omedelbart skölja dem med avjoniserat vatten.
- Ultraljud rengör etsade skivor i 2 minuter, och skölj dem med avjoniserat vatten 3 gånger.
2. Beredning av Amelogenin-chitosan Hydrogel
- FÖRBEREDELn av chitosan stamlösning
- Lös upp 1% (vikt / volym) chitosan (medelhög molekylvikt, från 75 till 85% deacetylerad) i en 1% (v / v) ättiksyra-lösning följt av omröring vid 80 ° CO / N.
- Efter kylning av lösningen till rumstemperatur, filtrera kitosanlösningen användning av ett 0,45 ^ m filter. Justera pH-värdet till 5,0 genom tillsats av 1 M NaOH-lösning.
- Framställning av kalcium-och fosfatstamlösning (0,1 M)
- Väg upp kalciumklorid (CaCl2) och framställa en 0,1 M lösning, därefter blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar. Justera pH-värdet till 11 genom tillsats av 1 M NaOH-lösning.
- Väg upp dibasiskt natriumfosfat (Na 2 HPO 4) och framställa en 0,1 M lösning, därefter blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar.
- Expression och rening av rekombinant amelogenin 17-18
Den rekombinanta fullängds porcin amelogenin (rP172) som används här har 172 aminosyror och är en analog av fulltLängd nativt porcint P173, men saknar den N-terminala metionin samt en fosfatgrupp på Ser16 18.- Tillsätt 20 g Lysogeny buljong (LB) Agar-pulver i 500 ml avjoniserat vatten, autoklavera lösningen vid 121 ° C (flytande inställning) under 20 min. Låt agar kyl till ~ 55 ° C, tillsätt ampicillin (100 pg / ml) i agar-lösning.
- Överför agar lösningen till petriskålar, låt varje platta svalna tills den är fast, sedan vända för att undvika kondens på agar. Förvara plattorna i plastpåsar vid 4 ° C.
- Utstryk med LB-agarplatta med rekombinanta celler (E. coli-BC21) från glycerollager (-80 ° C). Inkubera plattorna O / N vid 37 ° C.
- Bered 50 ml av NZCYM medier och autoklaveras media vid 121 ° C under 30 min. Tillåt mediet svalna, tillsätt 50 | il av 100 ng / ml ampicillin till de 50 ml medium.
- Inokulera en enda koloni från LB-agarplatta i 50ml NZCYM-medium kompletterat med ampicilli. Inkubera cellerna O / N i ett skakande inkubator vid 37 ° C.
- Förbered ett L i NZCYM medier och autoklaveras media vid 121 ° C under 30 min. Tillsätt 1 ml av 100 mg / ml ampicillin till 1000 ml medium. Ta en optisk densitet (OD) avläsning som nollprov med användning av en UV-Vis spektrofotometer. OBS: Kasta inte detta efter första behandlingen.
- Ympa 10 ml av cellkulturen från steg 2.3.5 i 1000 ml media från steg 2.3.6. Läs av den optiska densiteten vid 595 nm omedelbart efter inokulering. Ta den optiska densiteten behandlingen periodiskt för att hålla reda på tillväxt. OBS: Läs den tomma varje gång OD tas.
- Inducera med 700 | il av isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG, 1 M) när den bakteriella tillväxten uppgår till ca 0,75 ~ 0,8 OD vid 595 nm.
- Skörda cellerna när OD når 1.1. Häll innehållet i kolven till 6 plastflaskor. Balansera och väga flaskorna innan du använder centrifugen. Centrifugera i 20 minuter vid 8554 xg vid 4 ° C.Håll cellpelleten i -20 ° CO / N.
- Ta ut cellen pellets och kombinera dem i en 50 ml tub. Lägg till 3,5 ml av 4 M guanidin-HCl per liter fermentation. Sonikera 2-3 gånger på is, 30 sekunder varje gång, med 1 minuters intervall.
- Gör 6x spädningar av cellvolymen med 0,5% myrsyra och låta det omröras i det kalla rummet under 2 timmar. Centrifugera i 30 min, 8554 x g vid 4 ° C. Håll supematanten. Lägg 20% Mättad ammoniumsulfat med den mättade stamlösning och rör i det kalla rummet, O / N.
- Centrifugera i 30 min, 8554 x g vid 4 ° C och hålla pelleten. Rekonstituera pellets i 0,1% trifluorättiksyra (TFA), belastning på en C4-kolonn (10 x 250 mm, 5 | im), och fraktioneras med användning av en linjär gradient med A = 0,1% TFA och B = 60% acetonitril i TFA, vid en flödeshastighet av 1,5 ml • min -1.
- Frys proteinlösningen på torris och lyofilisera det frysta provet O / N.
- Beredning av amelogenin-chitosan (CS-AMEL) Hydrogel (Figur 1A)
- Addera 200 ^ g av rp172 i ett rör innehållande 960 | il av 1% kitosan-lösning, blanda sedan genom att använda en vortexblandare till dess att lösningen är klar.
- Tillsätt 25 | il av 0,1 M CaCl2-lösning, följt av 15 pl av 0,1 M Na 2 HPO 4 lösning på amelogenin-innehållande kitosan-lösning, blanda sedan genom att använda en vortex i 5 minuter.
- Justera pH i CS-AMEL lösning på 6,5 genom försiktig tillsats av 1 M NaOH-lösning. CS-AMEL hydrogel bildas när pH-värdet når 6,5.
3. Emalj Återväxt i Amelogenin-chitosan Hydrogel
- Beredning av konstgjord salivlösning
- Lös upp en viss mängd av magnesiumklorid (MgCl2, 0,2 mM), kalciumklorid (CaCl2, 1 mM), kaliumdivätefosfat (KH 2 PO 4, 4 mM), kaliumklorid (KCl, 16 mM) och ammoniumklorid ( NH4CI, 4,5 mM) i 20 mM HEPES(4 - (2-hydroxietyl) piperazin-1-etan-sulfonsyra) buffert 12.
- Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH och lagra den artificiella saliven lösningen vid 4 ° C.
- Innan du använder lösningen, tillsätt natriumfluorid (NaF, 300 ppm).
- Tillämpning av CS-AMEL hydrogel
- Applicera ca 20 pl CS-AMEL hydrogel till den etsade tand segment med hjälp av en spruta (Figur 1B).
- Torka den hydrogel-omfattas tand skiva i en exsickator vid rumstemperatur under 2 timmar.
- Överför tandskiva till en bägare som innehåller 30 ml av konstgjord salivlösning. Täck bägaren med aluminiumfolie, och sedan hålla bägaren i en ugn vid 37 ° C under 7 dagar.
- Avlägsna tand skiva och torka den i en exsickator vid rumstemperatur.
4. Karakterisering av gränssnitt mellan Nyligen Grown Layer och emalj
Mikrostrukturen hos gränssnittet mellan det nyligen odlat skikt och emalj var observaved genom svepelektronmikroskopi (SEM) och hög revolution transmissionselektronmikroskopi (HR-TEM). TEM-prov framställdes med hjälp av en fokuserad jonstråle (FIB) teknik, stegen för som är följande.
- Ladda provet i en FIB-SEM instrument och avsluta alla anpassningar i enlighet med bruksanvisningen. OBS: Fin Z justering bör utföras minst två gånger.
- Avsätta ett skikt kol (15 x 3 | im) på provet för att skydda den underliggande strukturen (Figur 2A).
- Mill provet noga på de övre, nedre och högra sidan av koldioxidlager för att förbereda en tunn bit av provet, och sedan skär undersidan av det tunt. OBS: Kontrollera Ion ljushöjden före varje malningssteg (Figur 2B).
- Weld en Pt spets på tunt och skär den vänstra sidan för att separera provstycket (fig 3C). OBS: Kontrollera Ion ljushöjden före svetsningssteget.
- Lyft ut than pt tippa med provet långsamt, och montera den lamellära provet på en hiss-out TEM rutnät.
- Lossa spetsen från provet, och tunn provet tills dess tjocklek är mindre än 100 nm (Figur 3D). Avlägsna provet från instrumentet för att utföra den TEM observation. OBS: Kontrollera Ion ljushöjden före varje gallringsprocess.
5. Bedömning av bindning och mekaniska egenskaper nyligen vuxit Layer
- Bindningsstyrkan fastställdes genom ultraljudsbehandling. Håll reparerade tand skiva med ultraljud (42 kHz, 100 W) i 10 min, och sedan observera gränssnittet mellan den reparerade lagret och naturlig emalj med en bakåtspridda elektron SEM-analys.
- Mät hårdhet och elasticitetsmodulen vid 20 provpunkter på varje reparerade emaljytan (n = 3) av en nano-indenter med en Berkovich spets.
6. Immunofluorescensfärgning
- Tvätta tandskiva med Tris buffer saltlösning (TBS) under 15 min.
- Block med 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBS under 15 min.
- Avlägsna vätskan och inkubera provet O / N med 1 ° Ab (1:500 Chicken anti Amelogenin) utspädd i TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Tvätta provet med TBS under 30 min och inkubera O / N med 2 ° Ab (1:100 anti-kyckling FITC) utspätt i TBS.
- Tvätta provet med TBS under 30 minuter och låt torka under ytterligare 30 minuter.
- Beakta av fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av det protokoll som beskrivs här kan påvisas genom svepelektronmikroskopi (SEM), valt område elektrondiffraktion (SAED) och röntgendiffraktion (XRD)-analyser. Efter reparation av amelogenin-kitosan (CS-AMEL) hydrogel till 7 dagar, en emalj-liknande skikt med en tjocklek av 15 ^ m bildad på den etsade emalj ytan. Den nyligen odlade skiktet gjordes av höggradigt ordnade arrangemang av kristaller med en diameter på ~ 50 nm, växa preferentiellt längs c-axeln, vinkelrätt mot ytan (pilar i figur 3A). Det är anmärkningsvärt att dessa nålliknande kristaller anordnades i buntar, vilka liknar de fundamentala enheter av naturlig emalj (figur 3B). Den SAED resultat av reparerade skiktet uppvisade ett bågformat mönster avslöjar en hierarkisk uppriktning av de nyligen odlade kristaller längs [002]-riktningen (figur 3C). XRD-analys bekräftade att den nyligen vuxit lagret bestod av apatitkristaller, vilka är inriktade längs den kristallografiska c-axeln, i enlighet med SEM och SEAD observationer (Figur 3D).
Figur 4 visar mikrostrukturen hos gränsytan mellan den nyligen odlat skikt och naturlig emalj. Observera att kristallerna inte växte i samma riktning som original emalj kristal. Det kan ses att det protein-medierad apatit tillväxt resulterade i en vinkelrät orientering av nyligen odlade kristaller i förhållande till de naturliga emalj kristaller (Figur 4A). De föreslagna reparationsmekanismer inklusive stabilisering av Ca-P-kluster och deras senare organiserade kristallisering av amelogenin har presenterats i vår tidigare studie 16. Distinktionen mellan nybildade och originella kristaller har avslöjats av den snabba Fouriertransformen (FFT)-analys som visade olika mönster som tyder på att kristallerna i emaljen och i smält reparerade lagret växte medolika orientering 16. Dessutom finns det inget uppenbart gap vid gränsytan mellan den reparerade skiktet och emalj substratet. På nanonivå, emalj och de regrown kristallerna smälts samman för att bilda en sömlös gränssnitt (svart pilarna i figur 4B).
Bindningsstyrkan mellan den reparerade skiktet och naturlig emalj utvärderades genom ultraljudsbehandling 16. Efter sonikering under 10 minuter, tillsattes den nyligen odlat skikt bildat i CS-AMEL hydrogel fortfarande hårt bundna till emaljytan (figur 5A) och den organiserade strukturen bevarades (Figur 5B). För provet behandlas med chitosan hydrogel utan amelogenin var dock ett stort gap mellan emaljen och en reparerad skikt observerades efter ultraljudsbehandling (figur 5C).
För att tydligt skilja mellan den nyligen vuxit lagret och den naturliga emalj, den amelogenin i den nyaly-odlade skikt Immunfluorescens märkt. Förekomsten av amelogenin demonstrerades av den gröna immunofluorescens i den nyligen vuxit lagret (Figur 6).
Mekaniska egenskaper, såsom hårdhet och elasticitetsmodul för den nyligen odlat skikt analyserades med nanoindentation testet 16. Såsom visas i fig. 7, efter syraetsning av hårdhet och modul av emaljytan minskade nästan 98% och 88%, respektive. Kontrollgruppen behandlas av chitosan hydrogel utan amelogenin visade endast begränsad förbättring i både hårdhet och modul. Däremot efter mineralisering i CS-AMEL hydrogel, observerade vi en ökning med nästan fyra gånger i modul och 9 gånger i hårdhet.
Figur 1. Fotografier amelogenin-chitosan (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Bild av en typisk CS-AMEL hydrogel. (B) Tillämpning av CS-AMEL hydrogel på en syra-etsat tandskiva.
Figur 2. Typisk fokuserad-jon-stråle process för TEM provberedning. (A) avsättning av ett kolskikt på reparerade emaljytan. (B) Fräsning provet försiktigt runt ett skikt av kol för att framställa en tunn bit av provet. (C) Svets Pt spets på tunt stycke. (D) Gallring provet tills dess tjocklek är mindre än 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Karakterisering av nyligen vuxen lager efter mineralisering i amelogenin-chitosan hydrogel i 7 dagar. (A) Efter 7 dagar av mineralisering med amelogenin-chitosan hydrogel, en emalj-liknande skikt som bildats på ytan av det etsade emaljen. Infällda bilden visar tjockleken av nyligen odlade skikt; rektangel visar det område som motsvarar A. Vita pilar indikerar apatit inriktningar i den nyligen vuxen lager. (B) Buntar av organiserade kristaller finns inuti reparerade lagret. Pilarna pekar på en typisk bunt av parallella kristaller inuti den nyligen odlat skikt. Infällda bilden visar den homogena ytan på den reparerade lagret. (C) Valt område elektron diffraktion (SAED) bild av den nyligen vuxit lager. Infällda bilden visar TEM bild av den reparerade lagret utarbetats av fokuserad jonstråle (FIB) fräsning. (D) XRD spektra av nyligen vuxen lager eftermineralisering i en amelogenin-chitosan hydrogel i 7 dagar. Reproducerad med tillstånd från referens 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mikrostruktur hos gränssnittet mellan det nyligen odlat skikt och naturlig emalj. (A) Tvärsnitt SEM-bild av reparerade lager efter återmineralisering i amelogenin-kitosangel i 3 dagar, visar nyligen vuxit skikt smält på ytan av den naturliga emalj. De vita och svarta pilar anger de kristallografiska orienteringar av kristallerna i det nyligen odlat skikt och naturlig emalj, respektive. Den streckade linjen visar gränsen för den naturliga emalj och den nyligen vuxit lagret. (B) HRTEM bild av interansikte mellan emaljen och regrown kristall, visar sömlös tillväxt repar kristall på emaljen. De svarta pilarna visar gränssnittet mellan regrown och emaljkristaller. Reproducerad med tillstånd från referens 16.
Figur 5. Bindande styrka mellan nyligen vuxit lager och emaljytan. (A) bakåtspridda elektron bild av tvärsnittet, och (B) andra elektron bild av ytan av ett ultraljudsbehandlade nyligen vuxit skikt erhålls med chitosan-amelogenin hydrogel. Infällda bilden visar den typiska morfologi av ytan vid en högre förstoring. (C) bakåtspridda elektron bild av tvärsnittet av ett ultraljudsbehandlade nyligen vuxit skikt erhålls med chitosan hydrogel utan amelogenin. Reproducerad med tillstånd från referens 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Fluorescens bilder av tvärsnittet av den nyligen odlat skikt. Rektangel i A representerar det valda området som motsvarar B. Pilarna i B anger den nyligen vuxit lagret på emaljytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Hårdhet och elastic modul av friska emalj, etsad emalj, och rekonstruerad emalj repareras av chitosan hydrogel med och utan amelogenin. Det strecksatsen området var liknande vad som tidigare rapporterats 19. Reproducerad med tillstånd från referens 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan innehållet i emalj mineral hög vilket gör det hårdast mineraliserad vävnad i den mänskliga kroppen, är detta biokeramiskt mottagliga för demineralisering processer, som ofta förekommer som karies eller erosion. Genmutationer kan också orsaka tunna eller mjuka emalj leder till en serie av ärftliga sjukdomar av emalj missbildning kallad Amelogenesis Imperfecta 20. Oral hälso-och sjukvårdsprodukter som innehåller fluor eller CPP-ACP har funnits på marknaden i flera år (dvs, lacker, tandkrämer och munvatten) för att främja återmineralisering av initiala emaljskador. Men ingen av dessa kommersiellt tillgängliga produkter som har potential att främja bildandet av organiserade apatitkristaller. De konventionella behandlingar för djupa emalj hålrum innebär mekanisk borrning och efterföljande fyllning med konstgjorda material som amalgam, keramik eller komposit hartser. Ett sådant tillvägagångssätt är inte idealisk för tidiga skador och fall när stora arEAS av erosion uppstå på emalj. Detta beror på att en oproportionerligt stor del av friska emalj måste avlägsnas föra mer skador på tanden. Amalgam och komposithartser endast tillfällig "reparation" tanden och dessa fyllningar normalt inte stoppa tandens förfall. Robust vidhäftning mellan originaltandytan och av fyllnadsmaterial är en utmaning på grund av materialkrympning och skillnader i kemisk sammansättning och mikrostruktur.
Fördelar med CS-AMEL Hydrogel
En alternativ strategi för att övervinna dessa utmaningar är att regrow en emalj-liknande skikt direkt på den ursprungliga emaljytan när tät kemisk kontakt med det naturliga substratet kan bildas. I denna video artikeln presenterar vi en ny emalj rekonstruktion strategi som använder en amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel att växa organiserade kristaller in vitro på en emaljerad yta. Jämfört med andra biomimetiska treatments, är CS-AMEL hydrogel lättare att förbereda sig för klinisk användning. Förutom biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet, har den unika antimikrobiella och vidhäftningsegenskaper som är viktiga för dentala applikationer 16. En annan fördel är att den robusta gränssnittet mellan syntetiska och naturliga emaljkristaller främjar stark bindning mellan den nyligen odlat skikt och tandytan. I klinisk tandvård svag bindning är en främsta orsaken till restaurering fel på de för närvarande tillgängliga material. Dålig vidhäftning resulterar vanligen i luckor i emalj-restaurering gränssnitt, vilket ökar risken för bakterieläckage och sekundärkaries. Därför har den robusta fastsättning av den nyligen vuxit lagret bildas i CS-AMEL hydrogel potential att undvika bildandet av nya karies vid kanten av restaurering och förbättra hållbarheten av restaureringen.
Utmaningar och planer
Efter reparation av amelogenin-chitosan hydrogel, de mekaniska egenskaperna hos den etsade emalj ytan var anmärkningsvärt förbättras. CS-AMEL hydrogel-reparerade emalj uppvisade signifikant större hårdhet och elasticitetsmodul än kontrollprover på grund av de organiserade buntar av apatitkristaller liknar emalj struktur 21. Tekniken har dock följande begränsningar: (i) den hårdhet och modul fortfarande inte uppfyller nivån av naturliga friska emalj på grund av närvaron av organiskt material och brist på heirarchial prismatisk-interprismatic struktur; (Ii) den förlängda tidsperiod (3-7 dagar) som krävs för torkning av hydrogelen och mineralisering att slutföra.
Ytterligare studier behövs för att övervinna ovanstående begränsningar. En möjlig strategi för att förbättra mekaniska egenskaper kommer att vara upprepade mätningar CS-AMEL hydrogel som ett effektivt sätt att få en tjockare reparerad lager. Nedbrytning av det organiska materialet under mineraliseringsprocessen är en annan strategi för förbättring av mekaniska egenskaper. Experiment pågår för att förkorta torktiden för hydrogel samt mineralisering framsteg 22. Dessutom är det nödvändigt att utveckla en kariesmodellsystem som svarar för effekterna av salivproteiner på kristalltillväxt.
Kritiska moment och faktorer
Vid upprättandet av CS-AMEL hydrogel för emalj rekonstruktion, en av de mest kritiska stegen för att uppnå en emaljliknande skikt med en tät gränssnitt justering av pH-värdet av hydrogel på grund av pH-beroende växelverkan mellan chitosan och amelogenin 16. Kitosan är en linjär kedja polysackariden innefattar glukosamin och N-acetylglukosamin-rester som förenats med β-1 ,4-glykosidbindningar. På grund av dess aminogrupper, kan de kemiska och fysikaliska egenskaperna hos chitosan avstämmas genom att variera pH-värden av medierna. Till exempel, i en CS-AMEL system vid lägre pH-värden, chitosan interagerade med amelogenin genom elektrostatisk interaktion, men vid pH högre än 5,5, chitosan samverkan var svag på grund av dess låga löslighet och deprotonation 16. Denna pH-respons funktion gör chitosan hydrogel inte bara ett ideal amelogenin bärare, utan också ett effektivt skikt som skyddar emaljen från erosion. I en sur oral miljö, kan aminogruppen i kitosan fånga vätejoner och bildar en positiv barriär för att förhindra diffusion av vätejoner till emaljytan, såväl som interagera med amelogenin att förhindra dess förlust i saliven. När den normala pH återställs genom saliv på amelogenin frigörs från CS-AMEL hydrogel att styra återväxt av emalj.
Under emaljen återväxt, är amelogenin närvaro en kritisk faktor i att kontrollera orienterade och avlånga tillväxt apatitkristaller. I en CS-AMEL hydrogel, att de före kärn Ca-P-kluster, stabiliserade av amelogenin, sammanställning linöron kedjor som ytterligare säkring med emaljkristaller och slutligen förvandlar in till emaljliknande apatitkristaller 16,23-24. Den kontinuerliga tillväxten av kristaller bildar en tät gränssnitt, vilket främjar en utmärkt bindning mellan den nyligen vuxit lagret och emaljen.
Sammanfattningsvis presenterar vi en lovande amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel för ytlig emalj rekonstruktion. Den organiserade emalj-liknande mikrostruktur bildas i hydrogelen kan avsevärt förbättra de mekaniska egenskaperna hos etsad emalj; Samtidigt kan den robusta fastsättning av den reparerade lagret undvika bildandet av nya karies vid kanten av restaurering och potentiellt förbättra hållbarheten av restaureringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
