Summary
I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å fabrikkere en amelogenin-kitosan hydrogel for overfladisk emalje gjenoppbygging. Organisert in situ vekst av apatittkrystaller i hydrogel dannet en tett emalje-restaurering grensesnitt, noe som vil forbedre effektiviteten og holdbarhet av restaureringer.
Protocol
De menneskelige jekslene ble hentet etter standard prosedyrer for utvinning på Ostrow School of Dentistry ved University of Southern California og håndteres med godkjenning av Institutional Review Board.
En. Utarbeidelse av Acid-etset Tooth Slice
- Velg et menneske tredje molar uten restaurerte karies.
- Fjern rotpartiet av det molare, og kutte kronen på molar i lengderetningen i skiver 2 mm tykt ved hjelp av en vannkjølt lav hastighet diamantsagen. Ultralyd rense disse skivene i 2 min, og skyll dem med avionisert vann tre ganger.
- For å simulere erosive lesjoner, etse tann skiver med 30% fosforsyre for 30 sek deretter umiddelbart skylle dem med avionisert vann.
- Ultralyd rengjøre etset skiver i 2 min, og skyll dem med avionisert vann tre ganger.
2. Utarbeidelse av Amelogenin-kitosan Hydrogel
- Agingn av kitosan stamløsning
- Oppløs 1% (w / v) kitosan (middels molekylvekt, 75-85% deacetylert) i en 1% (v / v) eddiksyre, etterfulgt av omrøring ved 80 ° CO / N.
- Etter avkjøling av løsningen til RT, filtrere kitosan løsning ved hjelp av et 0,45 mikrometer filter. Juster pH-verdien til 5,0 ved tilsetning av 1 M NaOH-løsning.
- Fremstilling av kalsium-og fosfat-stamløsning (0,1 M)
- Vei ut kalsium-klorid (CaCl 2), og utarbeide en 0,1 M-løsning, og deretter blande ved hjelp av en vortex inntil oppløsningen er klar. Juster pH-verdien til 11 ved tilsetning av 1 M NaOH-løsning.
- Vei opp dibasisk natriumfosfat (Na 2 HPO 4), og utarbeide en 0,1 M oppløsning, og deretter blandes ved bruk av en hvirvel inntil oppløsningen er klar.
- Uttrykk og rensing av rekombinant amelogenin 17-18
Det rekombinante full-lengde porcine amelogenin (rP172) som brukes her har 172 aminosyrer og er en analog av fullLengde opprinnelig porcine P173, men mangler den N-terminale metionin i tillegg til en fosfatgruppe på Ser16 18..- Tilsett 20 g Lysogeny buljong (LB) agar pulver i 500 ml avionisert vann, autoklaver-oppløsning ved 121 ° C (flytende innstilling) i 20 min. Let agar avkjøles til ~ 55 ° C, tilsett ampicillin (100 ug / ml) inn i agar-løsning.
- Overfør agaroppløsningen til petriskåler, la hver plate kjølig til den er solid, deretter snu for å unngå kondens på agar. Oppbevar plater i plastposer ved 4 ° C.
- Serie på LB-agar-plate med rekombinante celler (E. coli-BC21) fra glycerol lager (-80 ° C). Inkuber platene O / N ved 37 ° C.
- Forbered 50 ml NZCYM media og autoklav media ved 121 ° C i 30 min. Tillat media til å kjøle seg ned, legge til 50 mL av 100 mikrogram / ml ampicillin til 50 ml media.
- Inokuler en enkelt koloni fra LB agarplate inn i 50 ml NZCYM media supplert med ampicilli. Inkuber cellene O / N i en risteinkubator ved 37 ° C.
- Forbered en L av NZCYM media og autoklav media ved 121 ° C i 30 min. Tilsett 1 ml 100 mg / ml ampicillin til 1000 ml media. Ta en optisk tetthet (OD) avlesning som en tom ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer. MERK: Ikke kast dette etter første lesning.
- Inokuler 10 ml av cellekulturen fra trinn 2.3.5 inn i 1000 ml media fra trinn 2.3.6. Les av optisk tetthet ved 595 nm umiddelbart etter inokulering. Ta avlesning av optisk tetthet for å holde rede på vekst. MERK: Les blank hver gang OD er tatt.
- Fremkall med 700 mL av Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 M) når bakteriell vekst strekker seg til omtrent 0,75 ~ 0,8 OD ved 595 nm.
- Høste cellene når OD når 1,1. Hell innholdet av kolben inn i 6 plastflasker. Balanse og veie flaskene før du bruker sentrifugen. Sentrifuger for 20 min ved 8554 xg ved 4 ° C.Hold cellepelleten i -20 ° CO / N.
- Ta ut cellen pellets og kombinere dem i en 50 ml tube. Legg 3,5 ml 4M Guanidine HCl pr L av gjæring. Sonicate 2-3 ganger på is, 30 sek hver gang, med en min intervaller.
- Lag 6x fortynninger av cellevolum med 0,5% maursyre og la det rør inn i kjølerommet i 2 timer. Sentrifuger i 30 min, 8554 xg ved 4 ° C. Hold supernatanten. Legg 20% mettet ammoniumsulfat ved hjelp av mettet stamløsning og rør i kjølerommet, O / N.
- Sentrifuger i 30 min, 8554 xg ved 4 ° C og holde pelleten. Rekonstituer pellets i 0,1% trifluoreddiksyre (TFA), belastningen på en C4-kolonne (10 x 250 mm, 5 um), og fraksjonerer anvendelse av en lineær gradient på A = 0,1% TFA og B = 60% acetonitril i TFA, ved en strømnings-hastighet på 1,5 ml • min -1.
- Fryse proteinoppløsningen på tørris og Lyofiliser den frosne prøven O / N.
- Utarbeidelse av amelogenin-kitosan (CS-AMEL) hydrogel (figur 1A)
- Tilsett 200 ug rp172 i et rør inneholdende 960 ul av 1% kitosan løsning, og bland ved hjelp av en vortex inntil oppløsningen er klar.
- Tilsett 25 pl av 0,1 M CaCl 2-løsning, etterfulgt av 15 pl 0,1 M Na HPO 2 4. løsning på amelogenin holdige kitosan løsning, og deretter blandes ved bruk av en hvirvel i 5 min.
- Juster pH til CS-AMEL løsningen til 6,5 ved forsiktig tilsetning av 1 M NaOH-løsning. CS-AMEL hydrogel vil dannes når pH-verdien har nådd 6,5.
Tre. Emalje Gjengroing i Amelogenin-kitosan Hydrogel
- Utarbeidelse av kunstig spytt løsning
- Løs opp en viss mengde av magnesiumklorid (MgCl 2, 0.2 mM), kalsiumklorid (CaCl 2, 1 mM), kaliumdihydrogenfosfat (KH PO 2 4, 4 mM), kaliumklorid (KCl, 16 mM) og ammoniumklorid ( NH4Cl, 4,5 mM) i 20 mM HEPES(4 - (2-hydroksyetyl) piperazin-1-etan-sulfonsyre) buffer 12.
- Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH og lagre kunstig saliva-løsning ved 4 ° C.
- Før du bruker løsningen, legge natriumfluorid (NaF, 300 ppm).
- Anvendelse av CS-AMEL hydrogel
- Påfør ca 20 mL CS-AMEL hydrogel til etset tann stykke ved hjelp av en sprøyte (Figur 1B).
- Tørk hydrogel-dekket tann skive i en eksikator ved romtemperatur i 2 timer.
- Overfør tannen skive til et begerglass inneholdende 30 ml av kunstig saliva-løsning. Dekk til begerglasset med aluminiumsfolie, og deretter holde begeret i en ovn ved 37 ° C i 7 dager.
- Fjern tannen skive og tørke den i en eksikator ved romtemperatur.
4. Karakterisering av grensesnitt mellom nylig vokst Layer og emalje
Mikrostrukturen av grensesnittet mellom det nylig blitt laget og emalje var observasjonerVED ved scanning elektronmikroskopi (SEM) og høy revolusjon transmisjonselektronmikroskopi (HR-TEM). Den TEM prøve ble fremstilt ved anvendelse av en fokusert stråle ion (FIB) teknikk, er fremgangsmåten for som er som følger.
- Laste prøven inn i en FIB-SEM instrument og fullføre alle justeringer i henhold til bruksanvisningen. MERK: Fine Z justering bør utføres minst to ganger.
- Avsette et lag av kull (15 x 3 mm) på prøven for å beskytte den underliggende strukturen (figur 2A).
- Mill prøven nøye på de øvre, nedre og høyre side av karbon-laget for å forberede et tynt stykke av prøven, og deretter kutte den nederste side av denne tynne stykke. MERK: Kontroller Ion strålejustering før hvert male trinn (figur 2B).
- Weld en Pt tips på tynt stykke og kutt på venstre side for å skille prøvestykket (Figur 3C). MERK: Kontroller Ion strålejustering før sveise trinnet.
- Løft ut than pt spissen med prøven sakte, og montere lamell prøven på en lift-out TEM rutenett.
- Ta tuppen fra prøven, og tynne prøven før dens tykkelse er mindre enn 100 nm (figur 3D). Fjern prøven fra apparatet for å utføre den TEM observasjon. MERK: Kontroller Ion strålejustering før hvert tynning prosess.
5. Vurdering av Bindende og mekaniske egenskaper nylig vokst Layer
- Bindestyrken vurdert ved ultralydbehandling. Hold den reparerte tannen skive i en ultralydrenseren (42 kHz, 100 W) i 10 minutter, og deretter observere grenseflaten mellom den reparerte sjikt og natur emalje med en tilbakespredt elektron-SEM-analyse.
- Mål hardhet og elastisitetsmodul på 20 testpunkter på hver reparert emaljeoverflaten (n = 3) av en nano-indenter med en Berkovich spiss.
6. Immunfluorescens Farging
- Vask tann skive med Tris buffer saltvann (TBS) i 15 min.
- Blokker med 1% bovint serum albumin (BSA) i TBS i 15 minutter.
- Fjern væsken og inkuberes prøven O / N i 1 ° Ab (1:500 Kylling anti-Amelogenin) fortynnet i TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Vask prøven med TBS i 30 minutter og inkuberes O / N med 2 ° Ab (1:100 anti-kylling FITC) fortynnet i TBS.
- Vask prøven med TBS i 30 minutter, og la det tørke i ytterligere 30 min.
- Observere ved fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av den protokoll som er beskrevet her er demonstrert ved scanning elektronmikroskopi (SEM), utvalgt område elektrondiffraksjon (SAED) og røntgendiffraksjon (XRD)-analyser. Etter reparasjon av amelogenin-kitosan (CS-AMEL) hydrogel for 7 dager, ble en emalje-lignende lag med en tykkelse på 15 mikrometer dannet på etset emalje overflaten. Den nylig dyrket lag ble fremstilt av svært bestilt matriser av krystaller med en diameter på ~ 50 nm, fortrinnsvis vokser langs c-aksen, vinkelrett på overflaten (pilene i figur 3A). Det er bemerkelsesverdig at disse nållignende krystaller ble organisert i bunter, som er lik den grunnleggende enheter av naturlig emalje (figur 3B). Den SAED resultat av reparert sjikt oppviste en bue-formet mønster avslører en hierarkisk innretting av de nylig dyrkede krystaller langs [002] retningen (figur 3C). XRD-analyse bekreftet at det nylig blitt laget ble sammensatt av apatittkrystaller, som ble innrettet langs krystallografisk c-akse, i overensstemmelse med SEM og Sead observasjoner (figur 3D).
Fig. 4 viser mikrostrukturen av grenseflaten mellom den nylig dyrket sjikt og natur emalje. Merk at krystallene ikke vokser i samme retning som original emalje krystallitter. Det kan sees at den protein-medierte apatitt vekst resulterte i en perpendikulær orientering av nylig dyrkede krystaller i forhold til de naturlige emalje krystaller (figur 4A). De foreslåtte reparasjonsmekanismene inkludert stabilisering av Ca-P klynger og deres påfølgende organisert krystallisering av amelogenin har blitt presentert i vår forrige undersøkelse 16. Skillet mellom nyetablert og originale krystaller har blitt avslørt av Fast Fourier Transform (FFT) analyse som viste forskjellige mønstre indikerer at krystallene i emaljen og i den smeltet reparert lag vokste medannen retning 16. Videre er det ingen åpenbare åpning ved grenseflaten mellom laget og den reparerte emaljen substrat. Ved nanoskala, emalje og de vokser til krystallene smeltet sammen for å danne et sømløst grensesnitt (Black piler i figur 4B).
Den heftstyrke mellom den reparerte sjikt og natur emalje ble evaluert ved ultralydbehandling 16. Etter sonikering i 10 min, ble den nylig dyrket laget dannet i CS-AMEL hydrogel fremdeles tett bundet til den emaljerte overflate (figur 5A), og organisert struktur var konserverte (fig. 5B). Til prøven som ble behandlet med kitosan hydrogel uten amelogenin ble imidlertid observert en stor avstand mellom emaljen og en reparert sjikt etter ultralydbehandling (figur 5C).
For å skille klart mellom den nylig blitt laget og den naturlige emalje, den amelogenin i den nyely-vokst lag ble Immunfluorescens merket. Tilstedeværelsen av amelogenin ble demonstrert ved det grønne immunfluorescens i den nylig blitt laget (figur 6).
Mekaniske egenskaper som hardhet og elastisitetsmodul av den nylig dyrket sjikt ble analysert ved nanoindentation test 16.. Som vist i figur 7, etter syreetsing hardhet og modulus av emaljeoverflaten avtok nesten 98% og 88%, respektivt. Kontrollgruppen behandles med kitosan hydrogel uten amelogenin bare viste liten forbedring i både hardhet og modulus. I kontrast, etter mineraliseringer i CS-AMEL hydrogel, observerte vi en økning på nesten fire ganger i modulus og ni ganger i hardhet.
Figur 1. Fotografier av amelogenin-kitosan (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Bilde av en typisk CS-AMEL hydrogel. (B) Bruk av CS-AMEL hydrogel på en syre-etset tann skive.
Figur 2. Typisk prosess fokusert-ion-stråle for TEM prøveopparbeidelse. (A) Påføring av et lag av kull på reparert emaljeoverflaten. (B) Fresing prøven forsiktig rundt et karbonsjikt for å forberede et tynt stykke av prøven. (C) sveising av Pt spissen på det tynne stykke. (D) Tynning prøven til sin tykkelse er mindre enn 100 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3.. Karakterisering av nylig vokst lag etter mineralisering i amelogenin-kitosan hydrogel for syv dager. (B) Etter 7 dager etter mineralisering med amelogenin-chitosan hydrogel, en emalje-lignende lag som dannes på overflaten av den etsede emalje. Inset viser tykkelsen av nylig vokst lag; rektangel viser området svarende til A. Hvite piler indikerer apatitt orienteringer i den nylig vokst lag. (B) Bundles av organiserte krystaller ble funnet inne i reparert lag. Pilene peker på en vanlig bunt av parallelle krystaller i den nylig dyrket lag. Inset viser homogen overflate av reparert lag. (C) Valgt område elektrondiffraksjon (SAED) bilde av den nylig vokst lag. Inset viser TEM bilde av reparert lag utarbeidet av fokusert ion stråle (FIB) fresing. (D) XRD spektra av nylig vokst lag ettermineralisering i en amelogenin-kitosan hydrogel for syv dager. Gjengitt med tillatelse fra referanse 16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Microstructure av grensesnittet mellom nylig dyrket laget og naturlig emalje. (A) Tverrsnitt SEM bilde av reparert lag på remineralisering i amelogenin-chitosan gel i 3 dager, og viser nylig dyrket sjikt smeltet til overflaten av det naturlige emalje. De hvite og sorte piler indikerer krystallografisk orientering av krystaller i den nylig vokst laget og naturlig emalje, henholdsvis. Den stiplede linje viser grensen for naturlig emalje og det nylig blitt laget. (B) HRTEM bilde av interansikt mellom emaljen og vokser til krystall, som viser sømløs vekst av reparert krystall på emaljen. De svarte pilene viser grensesnittet mellom regrown og emalje krystaller. Gjengitt med tillatelse fra referanse 16.
Figur 5. Binding styrke mellom nylig dyrket lag og emalje overflaten. (A) tilbakespredt elektronbilde av tverrsnittet, og (B) andre elektronbilde av overflaten av en ultralydbehandlet nylig dyrket sjikt oppnådd med kitosan-amelogenin hydrogel. Innsatt viser den typiske morfologien av overflaten på et høyere forstørrelse. (C) tilbakespredte elektronbilde av tverrsnitt av et ultralydbehandlet nylig dyrket sjikt oppnådd med kitosan hydrogel uten amelogenin. Gjengitt med tillatelse fra referanse 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Fluorescens bilder av tverrsnitt av den nylig blitt laget. Rektangulære i A representerer det valgte område svarende til B. Pilene i B viser den nylig vokst lag på emaljen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Hardhet og elatic modulus av sunn emalje, etset emalje, og rekonstruerte emalje reparert av kitosan hydrogel med og uten amelogenin. Strekpunktet området var lik det som har vært tidligere rapportert 19. Gjengitt med tillatelse fra referanse 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens mineralinnholdet i emalje er høyt slik at det er den vanskeligste mineralisert vev i det menneskelige legeme, er dette Bioceramic utsatt for demineralisering prosesser, noe som ofte forekommer som karies eller erosjon. Genmutasjoner kan også føre til tynne eller myke emalje fører til en rekke arvelige sykdommer i emalje misdannelse kalt Amelogenesis Imperfecta 20. Oral helse-pleie produkter som inneholder fluor eller CPP-ACP har vært på markedet i flere år (dvs. lakk, tannpasta og munnvann) for å fremme remineralization av innledende emalje lesjoner. Imidlertid er ingen av disse kommersielt tilgjengelige produkter har potensial til å fremme dannelsen av organiserte apatittkrystaller. Den konvensjonelle behandlinger for dype emalje hulrom involvere mekanisk boring og etterfylling med kunstige materialer som amalgam, keramikk eller kompositt harpiks. En slik tilnærming er ikke ideelt for tidlige lesjoner og tilfeller der store arEAS av erosjon oppstå på emaljen. Dette skyldes at en uforholdsmessig stor mengde av friskt emaljen må fjernes bringe mer skade på tann. Amalgam og kompositt harpiks bare midlertidig "reparere" tannen og slike fyllinger vanligvis ikke stoppe tannen råte. Robust adhesjon mellom opprinnelige tannoverflaten, og at av fyllingsmaterialer er en utfordring på grunn av vesentlig krymping og forskjeller i kjemisk sammensetning og mikrostruktur.
Fordeler med CS-AMEL Hydrogel
En alternativ strategi for å overvinne de ovenstående utfordringer er å vokse en emalje-lignende lag direkte på det opprinnelige emaljeoverflaten når stram kjemisk kontakt til det naturlige substratet kan dannes. I denne videoen artikkelen presenterer vi en ny emalje rekonstruksjon strategi som bruker en amelogenin-kitosan (CS-AMEL) hydrogel å vokse organiserte krystaller in vitro på en emaljert overflate. Sammenlignet med andre biomimetisk treatments, er CS-AMEL hydrogel enklere å tilberede for klinisk bruk. Foruten avlastning og nedbrytbarhet, har det unike antimikrobielle og heft egenskaper som er viktige for dentale applikasjoner 16. En annen fordel er at den robuste grensesnittet mellom den syntetiske og naturlige emalje krystaller fremmer sterk binding mellom det nylig blitt laget og tannoverflaten. I klinisk odontologi svak binding er en hovedårsak for restaurering svikt av de tilgjengelige materialer. Dårlig adhesjon resulterer vanligvis i hullene på emalje-restaurering grensesnitt, noe som øker risikoen for bakterielekkasje og sekundær karies. Derfor har robust feste en nylig dyrket laget dannet i CS-AMEL hydrogel potensial for å unngå dannelsen av ny karies ved margin på restaurering og forbedre holdbarheten av de restaureringer.
Utfordringer og fremtidsplaner
Etter reparasjon av amelogenin-chitosan hydrogel, de mekaniske egenskapene til den etsede emaljeoverflaten var bemerkelsesverdig forbedret. CS-AMEL hydrogel-reparert emalje viste betydelig større hardhet og elastisitetsmodul enn kontrollprøvene på grunn av den organiserte bunter av apatittkrystaller ligner emalje konstruksjon 21. Teknikken har imidlertid de følgende begrensninger: (i) den hardhet og modulus fremdeles ikke tilfreds nivået av naturlig sunn emalje på grunn av tilstedeværelsen av organisk materiale og mangel på heirarchial prismatisk-interprismatic struktur; (Ii) det lengre tid (3-7 dager) som trengs for tørking hydrogel og mineralisering for å fullføre.
Videre studier er nødvendig for å overvinne de ovennevnte begrensninger. En mulig strategi for å forbedre mekaniske egenskaper vil bli gjentatt anvendelse av CS-AMEL hydrogel som en effektiv måte for å oppnå et tykkere sjikt reparert. Fordøyelse av det organiske materiale under mineraliseringsprosessen er en annen strategy for å bedre mekaniske egenskaper. Forsøk er i gang for å redusere tørketiden av hydrogel samt mineral fremdrift 22.. I tillegg er det nødvendig å utvikle en kariesmodellsystem som står for virkningene av spyttproteiner på krystallvekst.
Kritiske trinn og faktorer
Ved fremstilling av den CS-AMEL hydrogel for emalje rekonstruksjon, er en av de mest kritiske trinn for å oppnå en emalje-lignende sjikt med en tett-grensesnittet justering av pH-verdien av hydrogelen på grunn av pH-avhengig interaksjon mellom kitosan og amelogenin 16.. Kitosan er et lineært polysakkarid bestående av kjede glukosamin og N-acetyl-glukosaminrester bundet sammen av β-1 ,4-glykosidiske bindinger. På grunn av sine amino-grupper, kan de kjemiske og fysiske egenskaper av kitosan bli innstilt ved å variere pH i mediet. For eksempel, i en CS-AMEL system, ved lavere pH-verdier, chitosan samhandlet med amelogenin gjennom elektrostatisk interaksjon, men ved pH høyere enn 5,5, kitosan samspillet var svak på grunn av sin lave løselighet og deprotonering 16. Denne pH-respons funksjonen gjør kitosan hydrogel ikke bare et ideelt amelogenin bærer, men også en effektiv lag beskytter emaljen mot erosjon. I et surt miljø oral, kan aminogruppen av kitosan fange hydrogenioner, som danner en positiv hindring for å forhindre diffusjon av hydrogenioner til emaljeoverflaten, så vel som i samspill med amelogenin for å unngå dens tap inn i spytt. Når den normale pH er restaurert av spytt den amelogenin frigjøres fra CS-AMEL hydrogel å kontrollere gjenvekst av emalje.
Under emaljen gjenvekst, er amelogenin nærvær en kritisk faktor i å kontrollere orientert og langstrakt vekst av apatittkrystaller. I en CS-AMEL hydrogel, til de pre-nukleasjon Ca-P klynger, stabilisert av amelogenin, samlet form linøret kjeder som ytterligere sikring med emalje krystaller og til slutt forvandler inn til emalje lignende apatittkrystaller 16,23-24. Den kontinuerlige vekst av krystaller danner et tett grensesnitt, noe som fremmer en god binding mellom den nylig blitt laget og emalje.
I sammendraget, introduserer vi en lovende amelogenin-kitosan (CS-AMEL) hydrogel for overfladisk emalje gjenoppbygging. Den organiserte emalje-lignende mikro dannet i hydrogel kan forbedre de mekaniske egenskapene til etset emalje; i mellomtiden, kan den robuste feste den reparert lag unngå dannelse av nye karies på marginen av restaureringen og potensielt forbedre holdbarheten av restaureringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
