Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor Published: July 10, 2014 doi: 10.3791/51606
Automatic Translation
1, 1
1Center for Craniofacial Molecular Biology, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

Summary

In dit artikel beschrijven we een protocol voor het vervaardigen van een amelogenin-chitosan hydrogel voor oppervlakkige glazuur wederopbouw. Georganiseerd in situ groei van apatiet kristallen in de hydrogel gevormd een dicht email restauratie-interface, die de doeltreffendheid en duurzaamheid van restauraties verbeteren.

Protocol

Het menselijk molaren werden geëxtraheerd volgens de standaardprocedures voor afzuiging aan de Ostrow School voor Tandheelkunde van de Universiteit van Zuid-Californië en behandeld met goedkeuring van de Institutional Review Board.

1. Voorbereiding van geëtst Tooth Slice

  1. Selecteer een mens derde kies zonder hersteld cariës.
  2. Verwijder het basisgedeelte van de molaire en snijd de kroon van de molaire langsrichting in plakjes 2 mm dikte met een watergekoelde lage snelheid diamantzaag. Ultrasoon reinigen van deze schijfjes gedurende 2 minuten en spoel ze met gedemineraliseerd water 3 keer.
  3. Erosieve laesies simuleren, etsen de tand plakjes met 30% fosforzuur gedurende 30 seconden dan ze onmiddellijk spoelen met gedemineraliseerd water.
  4. Ultrasoon reinigen van de geëtst plakjes gedurende 2 minuten en spoel ze met gedemineraliseerd water 3 keer.

2. Bereiding van Amelogenine-chitosan Hydrogel

  1. Preparation van chitosan stockoplossing
    1. Los 1% (w / v) chitosan (gemiddeld molecuulgewicht, 75-85% gedeacetyleerd) in 1% (v / v) azijnzuur oplossing, gevolgd door roeren bij 80 ° CO / N.
    2. Na afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur, filtreer de chitosanoplossing met een 0,45 pm filter. Stel de pH-waarde van 5,0 door toevoeging van 1 M NaOH-oplossing.
  2. Bereiding van calcium en fosfaat stockoplossing (0,1 M)
    1. Weeg calciumchloride (CaCl2) en stelt een 0,1 M oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is. Stel de pH tot 11 door toevoeging van 1 M NaOH-oplossing.
    2. Weeg dibasisch natriumfosfaat (Na 2 HPO 4) en stelt een 0,1 M oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is.
  3. Expressie en zuivering van recombinant amelogenin 17-18
    Het recombinante volledige lengte varkens amelogenin (rP172) hier gebruikt heeft 172 aminozuren en is een analoog van volledigeLengte natieve P173 varkens, maar niet de N-terminale methionine en een fosfaatgroep op Ser16 18.
    1. Voeg 20 g lysogenie bouillon (LB) agar poeder in 500 ml gedeïoniseerd water, autoclaveren de oplossing bij 121 ° C (vloeibaar instelling) gedurende 20 minuten. Laat agar afkoelen tot ~ 55 ° C, voeg ampicilline (100 ug / ml) in agaroplossing.
    2. Breng de agar oplossing voor petrischaaltjes, laat elke plaat afkoelen tot hij is solide, dan flip om condensvorming aan de agar te voorkomen. WINKEL platen in plastic zakken bij 4 ° C.
    3. Streak de LB-agar plaat met recombinante cellen (E.coli-BC21) uit de glycerol voorraad (-80 ° C). Incubeer de platen O / N bij 37 ° C.
    4. Bereid 50 ml NZCYM media en media autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Laat het materiaal afkoelen, voeg 50 ul van 100 ug / ml ampicilline aan de 50 ml media.
    5. Inoculeren een enkele kolonie van de LB-agar plaat in de 50ml NZCYM media aangevuld met ampicillIncubeer de cellen in O / N in een schudincubator bij 37 ° C.
    6. Bereid 1 liter autoclaaf NZCYM media en media bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 1 ml van 100 mg / ml ampicilline aan 1000 ml media. Neem een ​​optische dichtheid (OD) lezen als een leeg met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. OPMERKING: Gebruik dit niet weg na de eerste lezing.
    7. Inoculeren 10 ml van de celkweek uit stap 2.3.5 tot 1000 ml media uit stap 2.3.6. Lees de optische dichtheid bij 595 nm onmiddellijk na inoculatie. Neem de optische dichtheid lezen periodiek bij te houden van de groei te houden. OPMERKING: Lees de lege elke keer de OD wordt genomen.
    8. Veroorzaken met 700 pl isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1M) wanneer de bacteriële groei reikt tot ongeveer 0,75 ~ 0,8 OD bij 595 nm.
    9. Oogst de cellen wanneer de OD bereikt 1.1. Giet de inhoud van de kolf tot 6 plastic flessen. Evenwicht te brengen en wegen van de flessen voordat u de centrifuge. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 8554 xg bij 4 ° C.Houd de celpellet in het -20 ° CO / N.
    10. Haal de cel pellets en combineer ze in een 50 ml buis. Voeg 3,5 ml 4M Guanidine HCl per L van de gisting. Sonicaat 2-3 keer op het ijs, 30 seconden per keer, met 1 min. intervallen.
    11. Maak 6x verdunningen van cell volume met 0,5% mierenzuur en laat het roer in de koude kamer voor 2 uur. Centrifugeer gedurende 30 min, 8554 xg bij 4 ° C. Houd de bovenstaande vloeistof. Voeg 20% ​​verzadigd ammoniumsulfaat behulp van de verzadigde stock-oplossing en beroering in de koude kamer, O / N.
    12. Centrifugeer gedurende 30 min, 8554 xg bij 4 ° C en houd de pellet. Reconstitueer de pellets in 0,1% trifluorazijnzuur (TFA), lading op een C4-kolom (10 x 250 mm, 5 pm) en fractioneren met een lineaire gradiënt van A = 0,1% TFA en B = 60% acetonitril in TFA bij een debiet van 1,5 ml · min -1.
    13. Bevries de eiwit-oplossing op droog ijs en lyofiliseren het bevroren monster O / N.
  4. Voorbereiding van amelogenin-chitosan (CS-AMEL) HYDROGel (Figuur 1A)
    1. Voeg 200 ug rp172 in een buis met 960 ui 1% chitosan-oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is.
    2. Voeg 25 ul van 0,1 M CaCl2-oplossing, gevolgd door 15 pi van 0,1 M Na 2 HPO 4 oplossing voor het amelogenin bevattende chitosan oplossing, meng met een vortex gedurende 5 minuten.
    3. Stel de pH van de CS-AMEL oplossing 6,5 door voorzichtig toevoegen van 1 M NaOH-oplossing. CS-AMEL hydrogel zal vormen wanneer de pH-waarde bereikt 6,5.

3. Emaille hergroei in Amelogenine-chitosan Hydrogel

  1. Voorbereiding van kunstspeeksel oplossing
    1. Los een bepaalde hoeveelheid magnesiumchloride (MgCl2, 0,2 mM), calciumchloride (CaCl2, 1 mM), kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2PO 4, 4 mM), kaliumchloride (KCl, 16 mM) en ammoniumchloride ( NH4Cl, 4,5 mM) in 20 mM HEPES(4 - (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur) buffer 12.
    2. Breng de pH op 7,0 met 1 M NaOH en bewaar de kunstmatige speeksel oplossing bij 4 ° C.
    3. Voordat u de oplossing, voeg natriumfluoride (NaF, 300 ppm).
  2. Toepassing van CS-AMEL hydrogel
    1. Solliciteer ongeveer 20 ul CS-AMEL hydrogel op de geëtste tand slice met een spuit (Figuur 1B).
    2. Droog het hydrogel bedekte tanden schijfje in een exsiccator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    3. Breng de tand segment een bekerglas met 30 ml kunstmatig speeksel oplossing. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie, en houd de beker in een oven bij 37 ° C gedurende 7 dagen.
    4. Verwijder de tand plak en drogen in een exsiccator bij kamertemperatuur.

4. Karakterisering van Interface tussen pas gegroeide Layer en Enamel

De microstructuur van de interface tussen de pas gegroeide laag en glazuur was opmerved door scanning elektronenmicroscopie (SEM) en hoge revolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HR-TEM). De TEM monster werd bereid met behulp van een gefocusseerde ionenbundel (FIB), de stappen die zijn als volgt.

  1. Plaats het monster in een FIB-SEM instrument en afwerking van alle groeperingen volgens de gebruiksaanwijzing. OPMERKING: Fijn Z aanpassing moet minstens 2 keer worden uitgevoerd.
  2. Deponeer een koolstoflaag (15 x 3 urn) op het monster om de onderliggende structuur (Figuur 2A) beschermen.
  3. Molen het monster goed naar de boven-, onder-en rechterkant van koolstof laag op een dun stukje van het monster te bereiden, en snijd de onderkant van deze dunne stuk. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voor elke maalstap (Figuur 2B).
  4. Las een Pt tip over het dunne stuk en snijd de linker kant naar de proefstuk (Figuur 3C) te scheiden. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voordat het lassen stap.
  5. Til thij Pt tip met het monster langzaam, en monteer de gelamelleerde monster op een lift-out TEM rooster.
  6. Maak de tip van het monster, en dun het monster totdat de dikte minder dan 100 nm (Figuur 3D). Verwijder het monster van het instrument naar de TEM observatie uitvoeren. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voor elke dunner proces.

Beoordeling van Binding en mechanische eigenschappen van recent Grown Layer 5.

  1. De bindingssterkte wordt beoordeeld door ultrasone behandeling. Houd het gerepareerde tand slice in een ultrasone reiniger (42 kHz, 100 W) gedurende 10 minuten, en vervolgens observeren de interface tussen de herstelde laag en natuurlijke glazuur met een teruggekaatste elektron SEM-analyse.
  2. Meet de hardheid en de elasticiteitsmodulus bij 20 meetpunten op elk gerepareerd glazuuroppervlak (n = 3) door een nano-indenter met een Berkovich tip.

6. Immunofluorescentiekleuring

  1. Was de tand slice met Tris buffer zoutoplossing (TBS) gedurende 15 minuten.
  2. Blok met 1% runderserumalbumine (BSA) in TBS gedurende 15 minuten.
  3. Verwijder de vloeistof en incubeer het monster O / N met 1 ° Ab (1:500 kip anti-Amelogenine) verdund in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
  4. Was het monster met TBS gedurende 30 minuten en incubeer O / N met 2 ° Ab (1:100 Anti-kip FITC) verdund in TBS.
  5. Was het monster met TBS gedurende 30 minuten en laat het drogen nog 30 minuten.
  6. Observeren door fluorescentiemicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De doeltreffendheid van de hier beschreven protocol wordt aangetoond door scanning elektronenmicroscopie (SEM), opgegeven elektronendiffractie (SAED) en röntgendiffractie (XRD) analyse. Na reparatie door amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel voor 7 dagen, werd een emaille-achtige laag met een dikte van 15 micrometer gevormd op het geëtste glazuur oppervlak. De nieuw gekweekt laag werd gemaakt van sterk geordende arrays van kristallen met een diameter van ~ 50 nm, bij voorkeur groeien langs de c-as loodrecht op het oppervlak (pijlen in figuur 3A). Het is opmerkelijk dat deze naaldachtige kristallen in bundels, die vergelijkbaar zijn met de fundamentele eenheden van natuurlijke glazuur (figuur 3B) zijn georganiseerd. Het resultaat SAED herstelde laag vertoonde een boogvormig patroon onthullen een hiërarchische uitlijning van de pas gegroeide kristallen langs de [002] richting (Figuur 3C). XRD analyse bevestigde dat de nieuw-laag werd gegroeid uit apatietkristallen, die zijn uitgelijnd langs de kristallografische c-as, volgens de SEM en SEAD waarnemingen (figuur 3D).

Figuur 4 toont de microstructuur van de interface tussen de nieuw gegroeid laag en natuurlijke glazuur. Merk op dat de kristallen niet groeien in dezelfde richting als origineel emaille kristallieten. Men kan zien dat het eiwit gemedieerde groei van apatiet tot een loodrechte oriëntatie van nieuwe gekweekte kristallen ten opzichte van het natuurlijke glazuur kristallen (figuur 4A). De voorgestelde mechanismen reparatie inclusief stabilisatie van Ca-P clusters en de daaropvolgende georganiseerd kristallisatie door amelogenin zijn gepresenteerd in onze vorige studie 16. Het onderscheid tussen nieuw gevormde en oorspronkelijke kristallen Dat blijkt uit de snelle Fourier transformatie (FFT) analyse, waarbij verschillende patronen aangeeft bleek dat de kristallen in het glazuur en de gesmolten laag gerepareerde groeide metandere richting 16. Bovendien is er geen duidelijke opening aan het grensvlak tussen het herstelde laag en het glazuur substraat. Op nanoschaal, het glazuur en de regrown kristallen gesmolten samen een naadloze grensvlak (zwarte pijlen in figuur 4B).

De hechting tussen de herstelde laag en natuurlijke glazuur werd beoordeeld door ultrasone behandeling 16. Na sonicatie gedurende 10 minuten werd het pas gegroeide gevormd in het CS-AMEL hydrogel steeds stevig gebonden aan het glazuur (figuur 5A) en de organisatiestructuur werd bewaard (figuur 5B). Voor de behandeling met chitosan hydrogel zonder amelogenin monster echter een groot verschil tussen het glazuur en een herstelde laag werd gezien na ultrasone behandeling (figuur 5C).

Een duidelijk onderscheid tussen de nieuw gegroeid laag en de natuurlijke glazuur, de amelogenin in de nieuwely-gegroeid laag werd Immuunfluorescentie geëtiketteerd. De aanwezigheid van amelogenin werd aangetoond door de groene immunofluorescentie in het pas gegroeide laag (figuur 6).

Mechanische eigenschappen zoals hardheid en de elasticiteitsmodulus van het pas gegroeide laag werden geanalyseerd door nanoindentation proef 16. Zoals getoond in figuur 7, na etsen de hardheid en modulus van glazuuroppervlak daalde ongeveer 98% en 88%, respectievelijk. De controlegroep van chitosan hydrogel behandeld zonder amelogenin toonde slechts beperkte verbetering in zowel hardheid en modulus. Daarentegen na mineralisatie in de CS-AMEL hydrogel, namen wij een toename van bijna 4 keer in modulus en 9 keer in hardheid.

Figuur 1
Figuur 1. Foto's van amelogenin-chitosan (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Afbeelding van een typische CS-AMEL hydrogel. (B) Toepassing van de CS-AMEL hydrogel op een gematteerde tand slice.

Figuur 2
Figuur 2. Typische gerichte-ion-beam proces voor TEM monstervoorbereiding. (A) Afzetting van een carbon laag op gerepareerde glazuuroppervlak. (B) Frezen het monster zorgvuldig rond een carbon laag aan een dun stukje van het monster te bereiden. (C) lassen van de Pt tip over het dunne stuk. (D) Dunner het monster totdat de dikte van minder dan 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3. Karakterisering van nieuwe gekweekte laag na mineralisatie in amelogenin-chitosan hydrogel gedurende 7 dagen. (A) na 7 dagen mineralisatie met amelogenin-chitosan hydrogel, een emaille-achtige laag gevormd op het oppervlak van het geëtste glazuur. Inzet toont dikte van nieuw geteelde laag; rechthoek toont het gebied dat overeenkomt met A. Witte pijlen geven de apatiet oriëntaties in de nieuw gegroeid laag. (B) Bundels van georganiseerde kristallen werden gevonden in de gerepareerde laag. De pijlen wijzen op een typische bundel evenwijdige kristallen in de nieuw gegroeid laag. (C) Geselecteerde gebied elektronen diffractie (SAED) beeld van de nieuw gegroeid laag inzet toont het homogene oppervlak van de gerepareerde laag.. TEM beeld van de gerepareerde laag bereid door focused ion beam (FIB) frezen inzet toont. (D) XRD spectra van nieuw geteelde laag namineralisatie in een amelogenin-chitosan hydrogel voor 7 dagen. Overgenomen met toestemming van referentie 16. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Microstructuur interface tussen de nieuw gegroeid laag en natuurlijke glazuur. (A) Doorsnede SEM beeld van herstelde laag na remineralisatie in amelogenin-chitosan gel gedurende 3 dagen, geeft nieuw gekweekt laag gefuseerd aan het oppervlak van de natuurlijke glazuur. De witte en zwarte pijlen geven de kristallografische oriëntaties van de kristallen in de nieuw gegroeid laag en natuurlijk email, respectievelijk. De stippellijn geeft de grens van het natuurlijke glazuur en de pas gegroeide laag. (B) HRTEM beeld van de intergezicht tussen het glazuur en regrown kristal, waaruit naadloze groei van hersteld kristal op het glazuur. De zwarte pijlen geven de interface tussen regrown en glazuur kristallen. Overgenomen met toestemming van referentie 16.

Figuur 5
Figuur 5. Bindende kracht tussen nieuw gegroeid laag en glazuur. (A) Terugverstrooide elektron beeld van het tweede elektron beeld van het oppervlak van een ultrasoon-behandelde onlangs gegroeid laag verkregen met chitosan-amelogenin hydrogel doorsnede, en (B). Inzet toont de typische morfologie van het oppervlak bij een sterkere vergroting. Terugverstrooide elektronen beeld van de dwarsdoorsnede van een ultrasoon behandelde nieuw gekweekt laag verkregen met chitosan hydrogel zonder amelogenin (C). Overgenomen met toestemming van referentie 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Fluorescentie afbeeldingen van de dwarsdoorsnede van de nieuw gekweekt laag. Rechthoek A het gekozen gebied overeenstemt met B. De pijlen in B geven de pas gegroeide laag op het glazuur oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Hardheid en elastic modulus van gezond glazuur, geëtst glazuur, en gereconstrueerde emaille gerepareerd door chitosan hydrogel met en zonder amelogenin. Het streepje was vergelijkbaar met wat eerder is gemeld 19. Overgenomen met toestemming van referentie 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel het mineraalgehalte van glazuur hoog waardoor het de moeilijkste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam, dit biokeramische gevoelig voor demineralisatie processen die vaak als cariës en erosie. Gen mutaties kunnen ook leiden dun of zacht email leiden tot een reeks van erfelijke ziekten emaille misvorming genoemd amelogenesis imperfecta 20. Orale gezondheidszorg producten met fluoride of CPP-ACP hebben op de markt voor meerdere jaren (dat wil zeggen, vernissen, tandpasta's en mondwaters) remineralisatie van initiële glazuurlaesies promoten. Geen van deze commercieel verkrijgbare producten hebben het potentieel om de vorming van georganiseerd apatietkristallen bevorderen. De conventionele behandelingen voor diepe emaille holtes betrekken mechanisch boren en daaropvolgende vullen met kunstmatige materialen zoals amalgaam, keramiek of composiet harsen. Een dergelijke benadering is niet ideaal voor de vroege laesies en gevallen waarin grote arEAS erosie optreden op emaille. Dit komt omdat onevenredig veel gezonde email worden verwijderd om meer schade aan de tand. Amalgaam en composiet harsen slechts tijdelijk 'repareren' de tand en dergelijke vullingen meestal niet verval van de tand te stoppen. Sterke hechting tussen originele tandoppervlak en de vulmaterialen is een uitdaging vanwege materiaal krimp en verschillen in chemische samenstelling en microstructuur.

Voordelen van CS-AMEL Hydrogel

Een alternatieve strategie voor de bovengenoemde problemen te overwinnen is een emaille-achtige laag teruggroeien direct op het oorspronkelijke glazuur krappe chemische contact met het natuurlijke substraat kan worden gevormd. In deze video artikel presenteren we een nieuwe email reconstructie strategie die een amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel gebruikt om de georganiseerde kristallen groeien in vitro op een emaille oppervlak. Vergeleken met andere biomimetic treatmegen, CS-AMEL hydrogel gemakkelijker te bereiden voor klinisch gebruik. Naast de biocompatibiliteit en de biologische afbreekbaarheid, het heeft unieke antimicrobiële en adhesie eigenschappen die belangrijk zijn voor tandheelkundige toepassingen 16 zijn. Een ander voordeel is dat de robuuste interface tussen de synthetische en natuurlijke glazuur kristallen bevordert sterke binding tussen de pas gegroeide laag en het tandoppervlak. In klinische tandheelkunde zwakke binding is een hoofdreden voor het herstel falen van de beschikbare materialen. Slechte hechting resulteert meestal in spleten in het email-restauratie-interface, waardoor het risico voor bacteriële lekkage en secundaire cariës verhogen. Daarom is de robuuste bevestiging van de pas gegroeide gevormd in het CS-AMEL hydrogel heeft het potentieel om de vorming van nieuwe cariës aan de rand van de restauratie voorkomen en verbeteren de duurzaamheid van de restauraties.

Uitdagingen en toekomstplannen

Na reparatie door amelogenin-chitosan hydrogel, de mechanische eigenschappen van het geëtste glazuur oppervlak werden opmerkelijk verbeterd. De CS-AMEL-hydrogel gerepareerd emaille toonde significant grotere hardheid en elasticiteitsmodulus dan controlemonsters vanwege de georganiseerde bundels van apatietkristallen vergelijkbaar met glazuur structuur 21. De techniek heeft echter de volgende beperkingen: (i) de hardheid en modulus nog steeds niet aan het niveau van natuurlijke gezonde tandglazuur door de aanwezigheid van organisch materiaal en gebrek aan heirarchial prismatische-interprismatic structuur; (Ii) de uitgebreide tijd (3-7 dagen) die voor het drogen van de hydrogel en mineralisatie te voltooien.

Verdere onderzoeken zijn nodig om de bovenstaande beperkingen te overwinnen. Een mogelijke strategie om de mechanische eigenschappen te verbeteren zal de herhaalde toepassing van CS-AMEL hydrogel als een effectieve manier om een ​​dikkere laag te verkrijgen gerepareerd zijn. Vertering van het organisch materiaal tijdens de mineralisatie proces is een andere stragie voor de verbetering van de mechanische eigenschappen. Momenteel worden proeven om de droogtijd van de hydrogel en de mineralisatie voortgang 22 verkorten. Bovendien moet een cariës modelsysteem die verantwoordelijk zijn voor de effecten van speekselproteïnen op kristal groei.

Kritische stappen en factoren

Bij het ​​bereiden van de CS-AMEL hydrogel voor het emailleren wederopbouw, een van de meest kritische stappen waarmee een emaille-achtige laag met een dichte interface is de pH waarde van hydrogel door de pH-afhankelijke interactie tussen chitosan en amelogenin 16. Chitosan is een lineair polysaccharide keten omvattende glucosamine en N-acetyl glucosamine residuen verbonden door β-1 ,4-glycosidische bindingen. Door de aminogroepen kunnen de chemische en fysische eigenschappen van chitosan worden afgestemd door het variëren van de pH van het medium. Bijvoorbeeld, in een CS-AMEL systeem bij lagere pH-waarden, chitosan interactie met amelogenin elektrostatische interactie, maar bij een pH hoger dan 5,5, chitosan interactie zwak vanwege de lage oplosbaarheid en deprotonering 16. Deze pH-respons functie maakt chitosan hydrogel niet alleen een ideale amelogenin drager, maar ook een effectieve laag beschermt glazuur tegen erosie. In een zure omgeving orale, kan de aminogroep van chitosan waterstofionen vangen, die een positieve barrière voor de verspreiding van waterstofionen voorkomen dat het glazuur oppervlak en interactie met amelogenin om het verlies in het speeksel voorkomen. Wanneer de normale pH wordt hersteld door het speeksel amelogenin vrijkomt uit CS-AMEL hydrogel om de hergroei van email regelen.

Tijdens het glazuur hergroei, amelogenin aanwezigheid is een kritische factor bij het beheersen van de georiënteerde langwerpige en groei van apatiet kristallen. In een CS-AMEL hydrogel, de pre-nucleatie Ca-P clusters, gestabiliseerd door amelogenin, aggregaat te lin vormenoor kettingen die verder zekering met emaille kristallen en uiteindelijk transformeert in om email-achtige apatietkristallen 16,23-24. De continue groei van kristallen vormt een dichte interface, die een uitstekende hechting tussen de pas gegroeide laag en het glazuur bevordert.

Samengevat, introduceren we een veelbelovende amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel voor oppervlakkige glazuur wederopbouw. De georganiseerde emaille-achtige microstructuur gevormd in de hydrogel kan een aanzienlijke verbetering van de mechanische eigenschappen van geëtst glazuur; Ondertussen kan de robuuste bevestiging van de gerepareerde laag de vorming van nieuwe cariës te voorkomen in de marge van de restauratie en mogelijk verbeteren van de duurzaamheid van restauraties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human third molar  Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California  N/A The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board.
Recombinant pocine amelogenin Expression and purification  in lab N/A rP172, full-length 
Chitosan  Sigma-Aldrich 448877 Medium molecular weight, 75-85% deacetylated
Phosphoric acid  VWR AA033266
Acetic acid glacial VWR A036289
Sodium hydroxide VWR BDH9292
Calcium chloride  Sigma-Aldrich 223506
Dibasic sodium phosphate anhydrous VWR BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP  Agilent Technologies Inc. 230255
Ammonium sulfate VWR BDH8001
Trifluoroacetic acid VWR AAAL06374
Acetonitrile VWR BDH1103
Magnesium chloride  VWR BDH0244
Potassium dihydrogen phosphate  VWR BDH9268
Potassium chloride  VWR BDH0258
Ammonium chloride  VWR AAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) VWR AAA14777
Sodium fluoride  VWR AA11561
Tris-buffered saline Bio-Rad 170-6435 10× TBS
Bovine serum albumin EMD Millipore  12659 CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals 
Triton X-100 EMD Millipore  TX1568-1
Chicken Anti-Amelogenin N/A N/A A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California
Bovine Anti-Chicken IgY-FITC Santa Cruz Biotechnology Sc-2700
High Performance Liquid Chromatography System Agilent Technologies Inc. Varian Prostar 210
C4 column Phenomenx  Jupiter 5μ 300A
Scanning Electron Microscopy  JEOL  JSM-7001
FIB-SEM  JEOL  JIB-4500
Transmission Electron Microscopy  JEOL JEM-2100F
Digital low speed diamond saw MTI Corporation SYJ-150
Fluorescence microscopy Leica DMI3000 B
Ultrasonic cleaner  Branson  2510 42 kHz, 100 W
Nano-indenter  Agilent Technologies Inc. MTS XP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
  2. Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
  3. Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
  4. Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
  5. Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
  6. Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
  7. Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
  8. Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
  9. Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
  10. Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
  11. Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
  12. Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
  13. Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
  14. Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
  15. Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
  16. Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
  17. Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
  18. Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
  19. Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
  20. Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
  21. Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
  22. Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
  23. Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
  24. Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).

Tags

Biotechniek email Amelogenine Chitosan hydrogel Apatiet Biomimetic Erosie Oppervlakkige emaille wederopbouw Dense-interface
Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Emaille Hergroei met een dichte Interface
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruan, Q., Moradian-Oldak, J.… More

Ruan, Q., Moradian-Oldak, J. Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface. J. Vis. Exp. (89), e51606, doi:10.3791/51606 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter