Summary
Dans cet article, on décrit un protocole de fabrication d'un hydrogel de chitosane-amélogénine à la reconstruction de l'émail superficiel. Organisé croissance in situ de cristaux d'apatite dans l'hydrogel formé dans une interface émail-restauration dense, ce qui permettra d'améliorer l'efficacité et la durabilité des restaurations.
Protocol
Les molaires humaines ont été extraites en suivant les procédures standard pour l'extraction de l'École de médecine dentaire Ostrow de l'Université de Californie du Sud et manipulés avec l'approbation de l'Institutional Review Board.
1. Préparation de la Dent dépoli à l'acide Slice
- Sélectionner une troisième molaire humaine sans caries restaurées.
- Retirer la partie racine de la molaire, et couper la couronne de la molaire longitudinalement en tranches de 2 mm d'épaisseur en utilisant un faible débit diamant scie refroidi à l'eau. Nettoyer par ultrasons ces tranches pendant 2 min, puis les rincer avec de l'eau déminéralisée 3 fois.
- Pour simuler des lésions érosives, graver les tranches de dents avec 30% d'acide phosphorique pendant 30 secondes puis les rincer immédiatement avec de l'eau déminéralisée.
- Nettoyer par ultrasons des tranches gravées pendant 2 min, puis les rincer avec de l'eau déminéralisée 3 fois.
2. Préparation d'hydrogel chitosane-Amelogenin
- Preparation de la solution mère de chitosane
- Dissoudre 1% (w / v) chitosane (masse moléculaire moyenne, 75 à 85% désacétylée) dans une (v / v) d'une solution à 1% d'acide acétique suivi par une agitation à 80 ° CO / N.
- Après refroidissement de la solution à la température ambiante, filtrer la solution de chitosane à l'aide d'un filtre de 0,45 um. Ajuster le pH à 5,0 par addition d'une solution de NaOH.
- Préparation de calcium et de solution stock de phosphate (0,1 M)
- Peser le chlorure de calcium (CaCl 2) et préparer une solution à 0,1 M, puis mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire. Ajuster la valeur du pH à 11 par addition d'une solution de NaOH.
- Peser le phosphate disodique (Na 2 HPO 4) et préparer une solution à 0,1 M, puis mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
- Expression et purification de l'amélogénine recombinant 17-18
La pleine longueur amelogenin porcin recombinant (rP172) utilisé ici a 172 acides aminés et est un analogue de la pleineLongueur porcine P173 natif, mais sans la méthionine N-terminale ainsi que d'un groupe phosphate sur Ser16 18.- Ajouter 20 g de bouillon Lysogénie (LB) Agar en poudre dans 500 ml d'eau déminéralisée, l'autoclave la solution à 121 ° C (réglage de liquide) pendant 20 min. Laisser refroidir la gélose à ~ 55 ° C, ajouter de l'ampicilline (100 ug / ml) dans une solution d'agar.
- Transférer la solution de gélose des boîtes de Petri, laisser chaque plaque froide jusqu'à ce qu'il soit solide, puis retournez pour éviter la condensation sur la gélose. plaques de magasins dans des sacs en plastique à 4 ° C.
- Streak la plaque de gélose LB avec des cellules recombinantes (E. coli-BC21) du stock de glycérol (-80 ° C). Incuber les plaques O / N à 37 ° C.
- Préparer 50 ml de milieu NZCYM et autoclave les médias à 121 ° C pendant 30 min. Autoriser les médias à refroidir, ajouter 50 ul de 100 pg / ml d'ampicilline à 50 ml de milieu.
- Inoculer une colonie unique à partir de la plaque d'agar-agar dans le milieu LB 50 ml de NZCYM supplémenté avec ampicillIncuber les cellules po O / N dans un incubateur agitateur à 37 ° C.
- Préparer 1 L de médias NZCYM et autoclave les médias à 121 ° C pendant 30 min. Ajouter 1 ml de 100 mg / ml d'ampicilline à 1000 ml de milieu. Prenez une densité optique (DO) de la lecture comme une vierge à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. NOTE: Ne pas jeter ce après la première lecture.
- Inoculer 10 ml de la culture cellulaire de l'étape 2.3.5 dans 1000 ml de milieu de l'étape 2.3.6. Lire la densité optique à 595 nm immédiatement après l'inoculation. Prendre la mesure de la densité optique pour assurer le suivi de la croissance. REMARQUE: Lire la vierge à chaque fois la DO est prise.
- Induire avec 700 ul d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 M) lorsque la croissance bactérienne atteint à environ 0,75 ~ 0,8 DO à 595 nm.
- Récolter les cellules lorsque la DO atteint 1.1. Verser le contenu de la fiole dans des bouteilles en plastique 6. Et peser les bouteilles avant d'utiliser la centrifugeuse. Centrifuger pendant 20 min à 8554 g à 4 ° C.Conserver le culot cellulaire dans l'-20 ° CO / N.
- Sortez les culots de cellules et de les combiner dans un tube de 50 ml. Ajouter 3,5 ml de guanidine HCl 4M par L de fermentation. Fois Soniquer 2-3 sur la glace, 30 secondes à chaque fois, avec des intervalles de 1 min.
- Faire des dilutions 6x de volume de la cellule avec de l'acide formique à 0,5% et laisser remuer dans la chambre froide pendant 2 heures. Centrifuger pendant 30 min, 8554 g à 4 ° C. Gardez le surnageant. Ajouter 20% de sulfate d'ammonium saturé à l'aide de la solution mère saturée et remuer dans la chambre froide, O / N.
- Centrifuger pendant 30 min, 8554 g à 4 ° C et garder le culot. Reconstituer les pastilles dans 0,1% d'acide trifluoroacétique (TFA), de la charge sur une colonne C4 (10 x 250 mm, 5 um), et fractionner en utilisant un gradient linéaire de A = 0,1% de TFA et B = 60% d'acétonitrile dans du TFA, à une taux de 1,5 ml · min -1 débit.
- Congeler la solution de protéine sur glace sèche et lyophiliser l'échantillon congelé O / N.
- Préparation de amelogenin-chitosane (CS-AMEL) hydrographieel (figure 1A)
- Ajouter 200 ug de rp172 dans un tube contenant 960 pi de solution de chitosane à 1%, puis mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
- Ajouter 25 ul de 0,1 M CaCl 2 solution suivis par 15 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 solution à la solution de chitosane contenant amélogénine-, puis mélanger à l'aide d'un vortex pendant 5 min.
- Ajuster le pH de la solution de CS-AMEL à 6,5 en ajoutant avec précaution une solution de NaOH. CS-AMEL hydrogel se forme lorsque la valeur du pH atteigne 6,5.
3. Émail repousse dans Amelogenin-chitosane hydrogel
- Préparation de la solution de salive artificielle
- Dissoudre une certaine quantité de chlorure de magnésium (MgCl 2, 0,2 mM), du chlorure de calcium (CaCl 2, 1 mM), du dihydrogénophosphate de potassium (KH 2 PO 4, 4 mM), du chlorure de potassium (KCl, 16 mM) et de chlorure d'ammonium ( NH 4 Cl, 4,5 mM) dans 20 mM d'HEPES(4 - (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthane-sulfonique) en mémoire tampon 12.
- Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH 1 M et de stocker la solution de salive artificielle à 4 ° C.
- Avant d'utiliser la solution, ajouter du fluorure de sodium (NaF, 300 ppm).
- Application de CS-AMEL hydrogel
- Appliquer environ 20 ul hydrogel CS-AMEL à la tranche de la dent mordancée à l'aide d'une seringue (Figure 1B).
- Sécher la dent tranche recouverte d'un hydrogel dans un dessiccateur à la température ambiante pendant 2 h.
- Transférer la tranche de la dent dans un bêcher contenant 30 ml d'une solution de salive artificielle. Recouvrir de papier d'aluminium, puis garder le bécher dans un four à 37 ° C pendant 7 jours.
- Retirez la tranche de la dent et le sécher dans un dessiccateur à la température ambiante.
4. Caractérisation de l'interface entre la couche nouvellement Cultivé et émail
La microstructure de l'interface entre la couche nouvellement développé et l'émail a été observed par microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission à haute révolution (HR-TEM). L'échantillon de MET a été préparé en utilisant un faisceau d'ions focalisé (FIB) de la technique, pour les étapes qui sont les suivantes.
- Chargez l'échantillon dans un instrument FIB-SEM et terminer tous les alignements selon les instructions de fonctionnement. REMARQUE: Le réglage fin de Z doit être effectuée au moins 2 fois.
- Déposer une couche de carbone (15 x 3 um) sur l'échantillon afin de protéger la structure sous-jacente (figure 2A).
- Mill soigneusement l'échantillon sur les côtés supérieur, inférieur et droit de la couche de carbone pour préparer un petit morceau de l'échantillon, et ensuite coupé la partie inférieure de cette pièce mince. REMARQUE: Vérifiez l'alignement du faisceau d'ions avant chaque étape de broyage (figure 2B).
- Souder une pointe de Pt sur la pièce mince et couper la partie gauche de séparer l'échantillon pièce (figure 3C). REMARQUE: Vérifiez l'alignement du faisceau d'ions avant l'étape de soudage.
- Sortez til pt basculer avec l'échantillon lentement, et monter l'échantillon lamellaire sur une grille de TEM-soulèvement.
- Détachez la pointe de l'échantillon, et mince de l'échantillon jusqu'à ce que son épaisseur est inférieure à 100 nm (figure 3D). Enlever l'échantillon de l'instrument pour effectuer l'observation TEM. REMARQUE: Vérifiez l'alignement du faisceau d'ions avant chaque processus d'amincissement.
5. Évaluation des propriétés de liaison et mécaniques de la couche nouvellement Grown
- La résistance de liaison est évaluée par un traitement aux ultrasons. Gardez la tranche de dent réparée dans un nettoyeur à ultrasons (42 kHz, 100 W) pendant 10 min, puis observer l'interface entre la couche réparé et l'émail naturel avec un électron rétrodiffusé analyse SEM.
- Mesurer la dureté et le module d'élasticité à 20 points de test sur chaque surface de l'émail réparé (n = 3) par un nano-indentation avec une pointe Berkovich.
6. Immunofluorescence
- Laver la tranche de la dent avec du Tris Buffer solution saline (TBS) pendant 15 min.
- Bloquer avec 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du TBS pendant 15 minutes.
- Éliminer le liquide de l'échantillon et incuber O / N avec 1 ° Ab (1:500 poulet anti-Amelogenin) dilués dans du TBS (0,1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
- Laver l'échantillon avec le SCT pour 30 min et incuber O / N avec 2 ° Ab (1:100 anti-poulet FITC) dilué dans du TBS.
- Laver l'échantillon avec le SCT pour 30 min et laisser sécher pendant 30 min.
- Observez par microscope à fluorescence.
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Representative Results
L'efficacité du protocole décrit ici est mise en évidence par microscopie électronique à balayage (MEB), la diffraction d'électrons de la zone sélectionnée (DSA) et la diffraction des rayons X (XRD) des analyses. Après la réparation par amélogénine-chitosan (CS-AMEL) hydrogel pendant 7 jours, une couche d'émail en forme avec une épaisseur de 15 pm a été formée sur la surface de l'émail mordancé. La couche nouvellement développée a été faite de matrices hautement ordonnées de cristaux d'un diamètre d'environ 50 nm, de préférence de plus en plus le long de l'axe c perpendiculaire à la surface (flèches sur la figure 3A). Il est à noter que ces cristaux aciculaires ont été organisées en faisceaux, qui sont semblables aux unités de base de l'émail naturel (Figure 3B). Le résultat de la SAED couche réparé présente un diagramme en forme d'arc révélant un alignement hiérarchique des cristaux nouvellement cultivés le long de la [002] direction (figure 3C). l'analyse de diffraction des rayons X a confirmé que la couche nouvellement développée a été composé d'apatitedes cristaux, qui ont été alignées le long de l'axe cristallographique c, en accord avec les observations au MEB et SEAD (Figure 3D).
La figure 4 montre la microstructure de l'interface entre la couche nouvellement développé et l'émail naturel. Notez que les cristaux ne poussent pas dans les mêmes directions que cristallites de l'émail d'origine. On peut voir que la croissance de l'apatite médiée par une protéine traduite par une orientation perpendiculaire des cristaux nouvellement développées par rapport aux cristaux de l'émail naturel (Figure 4A). Les mécanismes de réparation proposées, y compris la stabilisation de Ca-P grappes et leur cristallisation organisée ultérieurement par amelogenin ont été présentés dans notre étude précédente 16. La distinction entre les cristaux nouvellement formés et originales a été révélée par la transformée de Fourier rapide (FFT), une analyse qui a montré différentes configurations indiquant que les cristaux de l'émail et de la couche fondue réparé augmenté avecorientation différente 16. En outre, il n'y a pas d'écart apparent à l'interface entre la couche et le substrat réparée de l'émail. À l'échelle nanométrique, l'émail et cristaux recrûes fusionnées pour former une interface transparente (flèches noires dans la figure 4B).
La force de liaison entre la couche et de l'émail naturel réparé a été évaluée par traitement aux ultrasons 16. Après sonication pendant 10 min, la couche nouvellement formée cultivées dans l'hydrogel CS-AMEL était encore étroitement liée à la surface de l'émail (figure 5A), et la structure a été préservée organisé (figure 5B). Pour l'échantillon traité avec hydrogel de chitosane sans amelogenin, cependant, un grand écart entre l'émail et une couche réparé a été observée après le traitement par ultrasons (figure 5C).
De distinguer clairement entre la couche nouvellement développé et l'émail naturel, la amelogenin dans la nouvellecouche ment cultivés a été marqué par immunofluorescence. La présence d'amélogénine a été démontré par immunofluorescence le vert dans la couche nouvellement développé (figure 6).
Les propriétés mécaniques telles que la dureté et le module d'élasticité de la couche nouvellement développée ont été analysés par test de nanoindentation 16. Comme le montre la figure 7, à la suite de l'acide gravure de la dureté et le module de surface de l'émail a diminué de près de 98% et 88%, respectivement. Le groupe témoin traité par hydrogel de chitosane sans amelogenin seulement montré une amélioration limitée à la fois la dureté et le module. En revanche, après minéralisation dans l'hydrogel CS-AMEL, nous avons observé une augmentation de près de 4 fois en module et 9 fois la dureté.
Figure 1. Photographies de amelogenin-chitosane (CS-AMEL) h ydrogel. (A) Image d'un hydrogel typique CS-AMEL. (B) Application de l'hydrogel CS-AMEL sur une dent tranche gravé à l'acide.
Figure 2. Du processus ciblé-faisceau d'ions typique pour TEM préparation de l'échantillon. (A) le dépôt d'une couche de carbone sur la surface de l'émail réparé. (B) Fraisage soigneusement l'échantillon autour d'une couche de carbone pour préparer un petit morceau de l'échantillon. (C) de soudure la pointe de Pt sur la pièce mince. (D) Dilution de l'échantillon jusqu'à ce que son épaisseur est inférieure à 100 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Caractérisation de la couche nouvellement développée après minéralisation en hydrogel chitosane-amélogénine pendant 7 jours. (A) Après 7 jours de minéralisation avec amélogénine-hydrogel de chitosane, une couche d'émail analogue formé sur la surface de l'émail mordancé. En médaillon, épaisseur de la couche nouvellement cultivés; rectangle indique la zone correspondant à un. Les flèches blanches indiquent les orientations d'apatite dans la couche nouvellement développé. (B) Les cadres de cristaux organisés ont été trouvés à l'intérieur de la couche réparé. Les flèches indiquent un faisceau typique de cristaux parallèles à l'intérieur de la couche nouvellement développée. Encart montre la surface homogène de la couche réparé. L'image (C) diffraction d'électrons de la zone sélectionnée (SAED) de la couche nouvellement développé. Encart montre l'image TEM de la couche réparé préparé par faisceau d'ions focalisé (FIB) de fraisage. (D) des spectres de diffraction des rayons X de la couche nouvellement augmenté aprèsminéralisation dans un hydrogel de chitosane-amélogénine pendant 7 jours. Reproduit avec la permission de la référence 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Microstructure de l'interface entre la couche nouvellement développé et l'émail naturel. (A) Section image MEB de la couche réparé après reminéralisation en gel de amelogenin-chitosane pendant 3 jours, montrant couche nouvellement développé fondue à la surface de l'émail naturel. Les flèches blanches et noires indiquent les orientations cristallographiques des cristaux dans la couche nouvellement développé et l'émail naturel, respectivement. La ligne en pointillés représente la limite de l'émail naturel et la couche nouvellement développée (B). Image HRTEM de l'interfaire face entre l'émail et cristal regrown, affichant une croissance homogène de cristal réparé sur l'émail. Les flèches noires indiquent l'interface entre les cristaux repousses et émail. Reproduit avec la permission de la référence 16.
Figure 5. Reliure force entre la couche nouvellement développée et la surface de l'émail. (A) Image en électrons rétrodiffusés de la section transversale, et (B) seconde image d'électrons de la surface d'une couche nouvellement développé par ultrasons-traitée obtenue avec du chitosane-amélogénine hydrogel. Encart montre la morphologie typique de la surface, à un grossissement supérieur. Image électronique rétrodiffusée de la section transversale d'une couche nouvellement développé par ultrasons-traitée obtenue avec un hydrogel de chitosane sans amélogénine (C). Reproduit avec la permission de la référence 16. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Des images de fluorescence de la section transversale de la couche nouvellement développée. Rectangle en A représente la région sélectionnée correspondant à B. Les flèches indiquent la couche B nouvellement développée sur la surface de l'émail. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Dureté et élasticitémodule tic de l'émail sain, émail gravé, émail et reconstruit réparé par hydrogel de chitosane avec et sans amelogenin. L'espace tiret est semblable à ce qui a été indiqué précédemment 19. Reproduit avec la permission de la référence 16.
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Discussion
Bien que la teneur en minéraux de l'émail est élevé rend plus difficile le tissu minéralisé dans le corps humain, ce biocéramique est sensible aux processus de déminéralisation, qui se produisent souvent que la carie dentaire ou de l'érosion. Les mutations génétiques peuvent aussi provoquer émail fines et souples menant à une série de maladies héréditaires de malformation de l'émail appelé Amélogenèse imparfaite 20. Produits de soins de santé bucco-dentaire contenant du fluorure ou CPP-ACP ont été sur le marché depuis plusieurs années (par exemple, vernis, pâtes et bains de bouche dents) pour promouvoir la reminéralisation des lésions de l'émail initiales. Cependant, aucun de ces produits disponibles dans le commerce ont le potentiel de favoriser la formation de cristaux d'apatite organisés. Les traitements conventionnels pour les cavités de l'émail en profondeur nécessitent forage mécanique et remplissage ultérieur avec des matériaux artificiels tels que les amalgames, en céramique ou en résine composite. Cette approche n'est pas idéale pour les lésions et premiers cas lorsque de grandes arEAS de l'érosion se produit sur l'émail. C'est parce que une quantité disproportionnée de l'émail sain doit être retiré apportant plus de dommages à la dent. Résines composites amalgame et «réparation» temporaire de la dent et les garnitures en général ne s'arrête pas la décroissance de la dent. Adhérence solide entre la surface de dent d'origine et celui de la matière de remplissage est un défi en raison du retrait du matériau et de différences dans la composition chimique et la microstructure.
Avantages de CS-AMEL hydrogel
Une autre stratégie pour relever les défis ci-dessus est de repousser une couche d'émail comme directement sur la surface de l'émail d'origine lorsque le contact chimique étanche au substrat naturel peut être formé. Dans cet article, vidéo, nous vous présentons une nouvelle stratégie de reconstruction de l'émail qui utilise un amelogenin-chitosane (CS-AMEL) hydrogel faire croître des cristaux organisés in vitro sur une surface de l'émail. Comparé à d'autres treatme biomimétiquents, CS-AMEL hydrogel est plus facile à préparer pour une utilisation clinique. Outre la biocompatibilité et la biodégradabilité, il a des propriétés antimicrobiennes uniques et d'adhérence qui sont importantes pour les applications dentaires 16. Un autre avantage est que l'interface entre le solide et la synthèse des cristaux de l'émail naturel favorise une forte liaison entre la couche nouvellement développée et la surface de la dent. En dentisterie clinique liaison faible est la raison principale de l'échec de la restauration des matériaux actuellement disponibles. Mauvaise adhérence se traduit généralement par des lacunes à l'interface émail-restauration, qui augmentent le risque de fuite bactérienne et les caries secondaires. Par conséquent, la fixation solide de la couche nouvellement formée cultivées dans l'hydrogel CS-AMEL a le potentiel d'éviter la formation de nouvelles caries à la marge de la restauration et d'améliorer la durabilité des restaurations.
Défis et plans futurs
Après réparation par helogenin hydrogel chitosane-, les propriétés mécaniques de la surface de l'émail mordancé ont été remarquablement améliorée. L'émail hydrogel réparé CS-AMEL a montré significativement plus grande dureté et module d'élasticité que les échantillons de contrôle en raison des faisceaux organisés de cristaux d'apatite similaires à la structure de l'émail 21. La technique a toutefois des limites suivantes: (i) la dureté et le module ne répondent toujours pas le niveau de l'émail naturel et sain en raison de la présence de matière organique et de l'absence de structure prismatique-interprismatique heirarchial; (Ii) le montant de temps prolongée (3-7 jours) nécessaire pour le séchage de l'hydrogel et de la minéralisation à compléter.
D'autres études sont nécessaires pour surmonter les limitations ci-dessus. Une stratégie possible pour améliorer les propriétés mécaniques sera l'application répétée de CS-AMEL hydrogel comme un moyen efficace d'obtenir une couche plus épaisse réparé. La digestion de la matière organique au cours du processus de minéralisation est un autre stragie pour améliorer les propriétés mécaniques. Des expériences sont en cours pour réduire le temps de séchage de l'hydrogel, ainsi que la progression de la minéralisation 22. En outre, il est nécessaire de développer un système de modèle de caries qui représentent les effets de protéines salivaires sur la croissance des cristaux.
Étapes et facteurs critiques
Dans la préparation de l'hydrogel CS-AMEL pour la reconstruction de l'émail, une des étapes les plus critiques pour la réalisation d'une couche d'émail en forme avec une interface dense est le réglage de la valeur du pH de l'hydrogel due à l'interaction dépendante du pH entre le chitosane et amélogénine 16. Le chitosane est un polysaccharide à chaîne linéaire comprenant de la glucosamine et de résidus de glucosamine N-acétyle reliées entre elles par des liaisons β-1 ,4-glucosidiques. En raison de ses groupes amino, les propriétés chimiques et physiques du chitosane peuvent être ajustées en faisant varier les valeurs de pH des milieux. Par exemple, dans un système CS-AMEL, à des valeurs de pH plus faibles, chitosan interagi avec amélogénine par une interaction électrostatique, mais à un pH supérieur à 5,5, l'interaction chitosane était faible en raison de sa faible solubilité et de 16 déprotonation. Cette caractéristique rend la réactivité du pH hydrogel de chitosane non seulement un support d'amélogénine idéal, mais également une couche efficace pour protéger l'émail de l'érosion. Dans un environnement oral acide, le groupe amino du chitosane peut capter les ions d'hydrogène, la formation d'une barrière positive à empêcher la diffusion des ions hydrogène à la surface de l'émail, ainsi que l'interaction avec amélogénine pour éviter sa perte dans la salive. Lorsque le pH normal est rétabli par la salive du amelogenin est libéré de CS-AMEL hydrogel pour contrôler la repousse de l'émail.
Au cours de la repousse de l'émail, la présence amelogenin est un facteur essentiel dans le contrôle de la croissance orientée et allongé de cristaux d'apatite. Dans un hydrogel CS-AMEL, les pré-nucléation Ca-P grappes, stabilisés par amelogenin, ensemble pour former linchaînes d'oreille de laquelle des fusibles avec des cristaux d'émail et finalement transforme pour apatite cristaux d'émail comme 16,23-24. La croissance continue de cristaux formant une interface dense, ce qui favorise une excellente liaison entre la couche nouvellement développé et l'émail.
En résumé, nous introduisons une amelogenin-chitosane (CS-AMEL) hydrogel prometteur pour la reconstruction de l'émail superficiel. La microstructure de l'émail comme organisé formé dans l'hydrogel peut améliorer de manière significative les propriétés mécaniques de l'émail mordancé; Pendant ce temps, la fixation solide de la couche réparé peut éviter la formation de nouvelles caries à la marge de la restauration et potentiellement améliorer la durabilité des restaurations.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
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