Summary
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בודה הידרוג'ל amelogenin-chitosan לשיקום אמייל שטחי. מאורגן בצמיחה באתרו של גבישי אפטיט בהידרוג'ל יצר ממשק אמייל-שיקום צפוף, אשר ישפר את היעילות ועמידות של שחזורים.
Protocol
טוחנות האדם חולצו בעקבות ההליכים סטנדרטיים להפקה בבית הספר לרפואת השיניים אוסטרוב מאוניברסיטת הדרום קליפורניה וטפלו באישור דירקטוריון סקירה המוסדית.
1. הכנת השן חרוטה חומצת Slice
- בחר טוחנת שלישית אדם ללא כל עששת משוחזרת.
- להסיר את חלק השורש של השן הטוחנת, ולחתוך את הכתר של השן הטוחנת longitudinally לפרוסות 2 מ"מ עובי בעזרת מסור יהלום במהירות נמוכה מקורר מים. Ultrasonically לנקות פרוסות אלה למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים deionized 3 פעמים.
- כדי לדמות נגעים מכרסמים, לחרוט את פרוסות שן עם 30% חומצה זרחתית ל30 שניות ולאחר מכן לשטוף אותם מייד במים deionized.
- Ultrasonically לנקות את הפרוסות חרוטות למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים deionized 3 פעמים.
2. הכנת Hydrogel Amelogenin-chitosan
- תרופות לn של פתרון מניות chitosan
- ממיסים 1% (w / v) chitosan (משקל מולקולרי בינוני, 75-85% deacetylated) ב1% (v / v) פתרון חומצה אצטית ואחרי ערבוב על 80 מעלות CO / נ
- לאחר קירור הפתרון לRT, לסנן את פתרון chitosan באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. כוון את ערך ה-pH ל5.0 על ידי הוספת 1 פתרון M NaOH.
- הכנת סידן ופתרון מניות פוספט (M 0.1)
- לשקול את סידן כלורי (CaCl 2) ולהכין פתרון 0.1 M, ואז לערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. כוון את ערך ה-pH ל11 על ידי הוספת 1 פתרון M NaOH.
- לשקול את פוספט dibasic נתרן (Na 2 HPO 4) ולהכין פתרון 0.1 M, ואז לערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור.
- ביטוי וטיהור amelogenin רקומביננטי 17-18
Amelogenin רקומביננטי באורך מלא החזיריים (rP172) משמש כאן יש 172 חומצות אמינו והוא אנלוגי של מלאאורך P173 חזירי ילידים, אבל חסר מתיונין N-המסוף כמו גם קבוצת פוספט בSer16 18.- הוסף 20 גרם של מרק Lysogeny אבקה אגר (LB) ל500 מיליליטר deionized מים, חיטוי הפתרון ב121 ° C (הגדרה נוזלית) עבור 20 דקות. בואו מגניב אגר ל~ 55 ° C, להוסיף אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לתוך פתרון אגר.
- מעביר את הפתרון אגר לצלחות פטרי, בואו כל צלחת מגניב עד שהוא מוצק, ואז להפוך כדי למנוע התעבות על אגר. צלחות חנות בשקיות פלסטיק ב 4 ° C.
- Streak הצלחת אגר LB עם תאי רקומביננטי (E.coli-BC21) ממניות גליצרול (-80 מעלות צלזיוס). דגירה הצלחות O / N ב 37 ° C.
- הכן 50 מיליליטר של תקשורת NZCYM וחיטוי התקשורת ב121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאפשר התקשורת להתקרר, להוסיף 50 μl של 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין ל50 מיליליטר התקשורת.
- לחסן מושבה אחת מהצלחת אגר LB לתוך תקשורת NZCYM 50ml בתוספת ampicillפנימה דגירה התאים O / N בחממה רועדת ב 37 ° C.
- הכן 1 ליטר של מדיה NZCYM וחיטוי התקשורת ב121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הוסף 1 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין ל1,000 מיליליטר תקשורת. קח את צפיפות אופטית קריאה (OD) כריק באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. הערה: אל תמחק את זה אחרי הקריאה ראשונה.
- לחסן 10 מיליליטר של תרבית התאים מהצעד 2.3.5 ל1,000 מיליליטר תקשורת מהצעד 2.3.6. קראו את הצפיפות האופטית ב595 ננומטר מייד לאחר חיסון. קח קריאת הצפיפות האופטית מעת לעת כדי לשמור על מסלול של הצמיחה. הערה: קראו את החסר בכל פעם שהובסו הוא נלקח.
- לגרום לעם 700 μl של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 מ '), כאשר התפתחות החיידקים מגיעה לכ 0.75 ~ 0.8 OD ב 595 ננומטר.
- קציר התאים כאשר OD מגיע 1.1. יוצקים את תכולת הבקבוק לתוך 6 בקבוקי פלסטיק. לאזן ולשקול את הבקבוקים לפני השימוש בצנטריפוגות. צנטריפוגה עבור 20 דקות ב8,554 XG ב 4 ° C.שמור על התא גלולה ב-20 ° CO / נ
- קח את כדורי התא ולשלב אותם בצינור 50 מיליליטר. הוספת 3.5 מיליליטר של 4M guanidine HCl לליטר של תסיסה. פעמים Sonicate 2-3 על קרח, 30 שניות בכל פעם, עם מרווחי דקות 1.
- לעשות דילולים 6x של נפח תא עם 0.5% חומצה פורמית ולתת לו לבחוש בחדר הקר במשך שעה 2. צנטריפוגה במשך 30 דקות, 8,554 XG ב 4 ° C. שמור את supernatant. הוסף 20% אמוניום סולפט רווי באמצעות פתרון המניות הרוויים ומערבבים בחדר הקר, O / נ
- צנטריפוגה במשך 30 דקות, 8,554 XG ב 4 ° C ולשמור את הכדור. לשקם את כדורים ב0.1% חומצת trifluoroacetic (TFA), עומס על עמודת C4 (מ"מ 10 x 250, 5 מיקרומטר), וfractionate באמצעות שיפוע ליניארי של 0.1% אצטוניטריל = 60% = TFA ו-B בTFA, ב קצב זרימה של 1.5 מיליליטר · -1 דקות.
- להקפיא את פתרון החלבון על קרח יבש וLyophilize מדגם O / נ הקפוא
- הכנת amelogenin-chitosan (CS-אמל) hydrogאל (איור 1 א)
- הוסף 200 מיקרוגרם של rp172 לתוך צינור המכיל 960 μl של 1% פתרון chitosan, ואז לערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור.
- הוסף 25 μl של 0.1 פתרון M CaCl 2 ואחריו 15 μl של 0.1 M Na 2 פתרון HPO 4 לפתרון chitosan המכיל amelogenin, ואז לערבב בעזרת מערבולת במשך 5 דקות.
- התאם את ה-pH של תמיסת CS-אמל ל6.5 על ידי הוספת 1 פתרון M NaOH בזהירות. הידרוג'ל CS-אמל יהווה כאשר ערך ה-pH מגיע 6.5.
3. אמייל לצמיחה מחודשת בHydrogel Amelogenin-chitosan
- הכנת פתרון רוק מלאכותי
- לפזר כמות מסוימת של מגנזיום כלוריד (MgCl 2, 0.2 מ"מ), סידן כלורי (CaCl 2, 1 מ"מ), אשלגן זרחה dihydrogen (KH 2 PO 4, 4 מ"מ), אשלגן כלורי (KCl, 16 מ"מ) ואמוניום כלוריד ( NH 4 Cl, 4.5 מ"מ) ב20 HEPES מ"מ(4 - (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-אתאן-sulfonic חומצה) חיץ 12.
- התאם ל-pH 7.0 עם 1 M NaOH ולאחסן את פתרון הרוק המלאכותי ב 4 ° C.
- לפני השימוש בפתרון, להוסיף פלואוריד הנתרן (NAF, 300 עמודים לדקה).
- יישום של הידרוג'ל CS-אמל
- תחול על 20 הידרוג'ל CS-אמל μl לפרוסת השן חרוטה באמצעות מזרק (איור 1).
- ייבש את פרוסת השן מכוסה הידרוג'ל בייבוש על RT במשך שעה 2.
- להעביר את פרוסת השן לכוס המכילה 30 מיליליטר של תמיסת רוק מלאכותית. מכסה את הכוס בנייר אלומיניום, ולאחר מכן לשמור את הכוס בתנור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
- הסר את פרוסת השן ולייבש אותו בתא ייבוש ב RT.
4. אפיון הממשק שבין שכבה גדלה לאחרונה ואמייל
מיקרו של הממשק שבין שכבת האמייל וגדל לאחרונה היה observed ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ומיקרוסקופיה גבוהה מהפכה העברת אלקטרונים (HR-TEM). מדגם TEM הוכן באמצעות אלומת יונים ממוקדת טכניקה (FIB), צעדים לאשר הנן כדלקמן.
- טען את הדגימה למכשיר FIB-SEM ולסיים את כל המערכים בהתאם להוראות ההפעלה. הערה: התאמת Z פיין יש לבצע לפחות 2 פעמים.
- להפקיד רובד פחמן (15 × 3 מיקרומטר) על המדגם כדי להגן על המבנה הבסיסי (איור 2 א).
- מיל המדגם בזהירות בצדדים העליונים, תחתון וימניים של שכבת פחמן להכין חתיכת המדגם דקה, ולאחר מכן לחתוך את הצד התחתון של פיסה דקה הזה. הערה: בדוק את יישור אלומת היונים לפני כל שלב טחינה (איור 2).
- ולד קצה Pt על פיסה דקה וחותך את צד השמאל כדי להפריד את החתיכה (איור 3 ג) לדוגמה. הערה: בדוק את יישור אלומת היונים לפני שלב הריתוך.
- הרם את tהוא PT להטות עם המדגם לאט, ולעלות על מדגם שבשבת על גבי רשת TEM עילוי-out.
- לנתק את הקצה מהמדגם, ודק מדגם עד העובי שלה הוא פחות מ 100 ננומטר (איור 3D). הסר את הדגימה מהמכשיר לבצע תצפית TEM. הערה: בדוק את יישור אלומת היונים לפני כל תהליך הרזיה.
5. הערכת נכסי עקידה והמכאנית של שכבה גדלה חדש
- הכוח המחייב נבחנים על ידי טיפול קולי. שמור על פרוסת השן תוקנה בשואב קולי (42 kHz, 100 W) עבור 10 דקות, ולאחר מכן לבחון את הממשק שבין השכבה לתיקון ואמייל טבעי עם ניתוח SEM backscattered אלקטרונים.
- למדוד את הקשיות ומודולוס אלסטיות ב20 נקודות בדיקה על כל משטח אמייל לתיקון (n = 3) על ידי ננו indenter עם טיפ ברקוביץ'.
6. Immunofluorescence מכתים
- שטוף את פרוסת השן עם buffe טריסמלוח r (TBS) ל15 דקות.
- לחסום עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) בTBS ל15 דקות.
- הסר את הנוזל ודגירת O המדגם / N עם 1 ° Ab (1:500 העוף Anti-Amelogenin) בדילול מלא בTBS (BSA 0.1%, 0.3% טריטון X-100).
- לשטוף את המדגם עם TBS ל30 דקות דגירה O / N עם 2 ° Ab (1:100 FITC אנטי עוף) בדילול מלא בTBS.
- לשטוף את המדגם עם TBS ל30 דקות ולהשאיר לייבוש למשך 30 דקות נוספות.
- שים לב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היעילות של הפרוטוקול המתואר כאן מודגמת על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), עקיפה נבחרה אזור אלקטרון (סעד) ועקיף X-ray (XRD) מנתח. לאחר תיקון על ידי הידרוג'ל amelogenin-chitosan (CS-אמל) למשך 7 ימים, כמו שכבת אמייל בעובי של 15 מיקרומטר הוקמה על פני השטח האמייל חרוטים. השכבה החדשה שגדלה הייתה עשויים מערכי הורה מאוד של גבישים בקוטר של ~ 50 ננומטר, הולכת וגדלה באופן מועדף לאורך c-הציר, בניצב לפני השטח (חיצים באיור 3 א). ראוי לציין כי גבישי מחט כמו אלה היו מאורגנים בצרורות, שהנן דומות ליחידות הבסיסיות של אמייל טבעי (איור 3 ב). תוצאת סעד של שכבה תוקנה הציגה תבנית בצורת קשת חושפת יישור היררכי של הגבישים גדלו עתה לאורך הכיוון [002] (איור 3 ג). ניתוח XRD אישר כי השכבה החדשה שגדלה הייתה מורכבת מאפטיטגבישים, אשר היו מיושרים לאורך ג ציר קריסטלוגרפיים, בהתאם לתצפיות SEM וSEAD (איור 3D).
איור 4 מראה את מיקרו של הממשק שבין השכבה החדשה שגדלה ואמייל טבעי. שים לב שהגבישים לא גדלו באותו הכיוונים כגבישי אמייל מקוריים. ניתן לראות כי צמיחת אפטיט בתיווך החלבון הביאה לנטיית ניצב של גבישים חדשים שגדלו ביחס לגבישים הטבעיים האמייל (איור 4 א). מנגנוני התיקון המוצעים כוללים ייצוב של אשכולות Ca-P וההתגבשות המאורגן שלהם לאחר מכן על ידי amelogenin הוצגו במחקר הקודם שלנו 16. ההבחנה בין גבישים חדשים שנוצרו ומקוריים נחשפה על ידי פורייה המהיר להפוך ניתוח (FFT) אשר הראה דפוסים שונים מצביעים על כך שהגבישים באמייל ובהתמזגה השכבה תוקנה גדלו עםנטייה שונה 16. יתר על כן, אין פער ניכר בממשק שבין השכבה לתיקון ואת מצע האמייל. בקנה המידה ננומטרי, האמייל והגבישים שצמחו מחדש התמזגו יחד כדי ליצור ממשק חלק (חיצים שחורים באיור 4 ב).
הכוח המליטה בין השכבה לתיקון והאמייל טבעי הוערך על ידי טיפול קולי 16. לאחר sonication עבור 10 דקות, השכבה גדלה עתה נוצרה בהידרוג'ל CS-אמל הייתה עדיין קשורה בחוזקה אל פני השטח האמייל (איור 5 א), והמבנה המאורגן נשמר (איור 5). למדגם שטופלו בהידרוג'ל chitosan ללא amelogenin, לעומת זאת, פער גדול בין האמייל ושכבת תיקון נצפה בעקבות הטיפול קולי (איור 5 ג).
כדי להבדיל בין השכבה החדשה שגדלה והאמייל הטבעי, amelogenin בחדש באופן ברורשכבה בוגרת ly תויגה Immunofluorescence. הנוכחות של amelogenin הודגמה על ידי immunofluorescence הירוק בשכבה גדלה עתה (איור 6).
תכונות מכאניות כגון קשיות ומודולוס אלסטיות של השכבה גדלה לאחרונה נותחו על ידי בדיקת nanoindentation 16. כפי שניתן לראות באיור 7, בעקבות חומצת תחריט הקשיות ומודול של משטח אמייל ירדו כמעט 98% ו88%, בהתאמה. קבוצת הביקורת שטופלה על ידי הידרוג'ל chitosan ללא amelogenin רק הראתה שיפור מוגבל בשתי קשיות ומודול. לעומת זאת, לאחר מינרליזציה בהידרוג'ל CS-אמל, צפינו גידול של כמעט פי 4 במודול ו -9 פעמים בקשיות.
איור 1. תצלומים של amelogenin-chitosan שעות (CS-אמל) ydrogel תמונה. (א) להידרוג'ל CS-אמל טיפוסי. (ב) יישום של הידרוג'ל CS-אמל בפרוסת שן חומצה חרוטה.
איור 2. תהליך ממוקד יון קורה אופייני להכנת מדגם TEM. (א) בתצהיר של שכבת פחמן על פני השטח אמייל לתיקון. (ב) כרסום מדגם זהירות סביב שכבת פחמן להכין חתיכת המדגם דקה. (C) ריתוך קצה Pt על פיסה דקה. (ד ') לדלל את המדגם עד העובי שלה הוא פחות מ 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5in "src =" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
איור 3. אפיון של שכבה חדשה שגדלה לאחר מינרליזציה בהידרוג'ל amelogenin-chitosan למשך 7 ימים. (א) לאחר 7 ימים של מינרליזציה עם הידרוג'ל amelogenin-chitosan, כמו שכבת אמייל-נוצרה על פני השטח של האמייל חרוט. הבלעה מראה עובי של שכבה חדשה שגדלה; מלבן מציג את האזור המתאים. חצים לבנים מציינים את אוריינטציות אפטיט בשכבה החדשה שגדלה. (ב ') חבילות של גבישים מסודרים נמצאו בתוך השכבה לתיקון. החיצים מצביעים על חבילה טיפוסית של גבישים במקביל בתוך השכבה החדשה שגדלה. הבלעה מראה את פני השטח האחידים של שכבת התיקון. תמונה (C) התאבכות אלקטרונים אזור הנבחר (סעד) של השכבה החדשה שגדלה. הבלעה מראה תמונת TEM של שכבת התיקון שהוכנה על ידי אלומת יונים ממוקדת כרסום (FIB). ספקטרום (ד ') XRD של שכבה חדשה שגדלה אחרימינרליזציה בהידרוג'ל amelogenin-chitosan למשך 7 ימים. לשכפל באישור מההתייחסות 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מייקרו של ממשק שבין השכבה החדשה שגדלה ואמייל טבעי. (א) תמונת חתך SEM של שכבה תוקנה לאחר מינרליזציה חוזרת בג'ל amelogenin-chitosan במשך 3 ימים, מראים שכבה חדשה שגדלה התמזגו אל פני השטח של האמייל הטבעי. החצים הלבנים ושחורים מציינים אוריינטציות קריסטלוגרפיים של הגבישים בשכבה החדשה שגדלה ואמייל טבעי, בהתאמה. תמונת HRTEM הקו המקווקו מראה את הגבול של האמייל הטבעי והשכבה גדלה לאחרונה. (ב) להיתרפנים בין האמייל והגביש שצמח מחדש, גידול חלק של גביש לתיקון באמייל. החיצים השחורים מצביעים על הממשק שבין גבישים שצמחו מחדש ואמייל. לשכפל באישור מההתייחסות 16.
איור 5. עקידת כוח בין שכבה החדשה שגדלה ופני שטח אמייל. (א) תמונת אלקטרון backscattered של החתך, ו( ב ') תמונת אלקטרון שנייה של פני השטח של שכבה חדשה שגדלה באולטרסאונד שטופלה הושגה עם הידרוג'ל chitosan-amelogenin. הבלעה מראה את המורפולוגיה האופיינית של פני השטח בהגדלה גבוהה יותר. תמונת אלקטרון backscattered של החתך של שכבה חדשה שגדלה באולטרסאונד שטופלה הושגה עם הידרוג'ל chitosan ללא amelogenin (C). לשכפל באישור מההתייחסות 16. <target = "_blank" href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. תמונות הקרינה של החתך של השכבה החדשה שגדלה. מלבן במייצג את האזור שנבחר מתאים ל-B. החיצים בB מציינים את השכבה גדלה עתה על פני השטח האמייל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. קשיות וELASמודולוס טיק של אמייל בריא, אמייל חרוט, ואמייל משוחזר לתיקון על ידי הידרוג'ל chitosan עם ובלי amelogenin. אזור הכניסה היה דומה למה שדווח 19. לשכפל באישור מההתייחסות 16 בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד שתכולת המינרלים של אמייל היא גבוהה מה שהופך את רקמת mineralized הקשה ביותר בגוף האדם, bioceramic זה הוא רגיש לתהליכי איבוד מינרלים, אשר לעתים קרובות להתרחש כעששת או שחיקת שיניים. מוטציות גנטיות יכולות גם היא לגרום לאמייל דק או רך שמוביל לסדרה של מחלות תורשתיות של מום אמייל נקרא Amelogenesis imperfecta 20. מוצרי טיפוח בריאות פה המכילים פלואוריד או CPP-ACP כבר על השוק במשך כמה שנים (כלומר, לכות, משחות שיניים ומי פה) כדי לקדם את מינרליזציה החוזרת של נגעי אמייל ראשוניים. עם זאת, אף אחד מהמוצרים הזמינים מסחרי האלה יש הפוטנציאל לקדם את היווצרות גבישי אפטיט מאורגן. הטיפולים קונבנציונליים לחללי אמייל עמוקים כרוכים בקידוח מכאני ומילוי הבא עם חומרים מלאכותיים כגון תערובת, קרמיקה או שרפי מרוכבים. גישה כזו היא לא אידיאלית לנגעים ומקרים מוקדם כאשר ar הגדולEAS של שחיקה מתרחש באמייל. סיבה לכך הוא כמות חסרת פרופורציה של אמייל בריא יש להסיר את מביאה יותר נזק לשן. רפי תערובת מורכבים ו 'תיקון' זמני בלבד בשיניים ובסתימות כאלה בדרך כלל לא עוצרים ריקבון של השן. הידבקות חזקה בין משטח שן המקורי וזה של חומרי המילוי היא אתגר בגלל התכווצות חומר והבדלים בהרכב כימי ומייקרו.
יתרונותיו של CS-אמל Hydrogel
אסטרטגית חלופה אחת כדי להתגבר על האתגרים הנ"ל היא לגדל מחדש כמו שכבת אמייל-ישירות על גבי משטח האמייל המקורי כאשר קשר כימי הדוק למצע הטבעי יכול להיווצר. במאמר זה וידאו, אנו מציגים אסטרטגית שיקום אמייל רומן המשתמשת הידרוג'ל amelogenin-chitosan (CS-אמל) לגדל גבישים מסודרים במבחנה על פני השטח אמייל. בהשוואה למבני ניקוי biomimetic אחריםNTS, הידרוג'ל CS-אמל הוא קל יותר להכנתו לשימוש קליני. חוץ מההתאמה הביולוגית והפריקות הביולוגיות, יש לו מאפיינים מיקרוביאלית והדבקה ייחודיים שהם חשובים עבור יישומי שיניים 16. יתרון נוסף הוא שהממשק חזק בין סינטטי וגבישי אמייל טבעיים מקדם מליטה חזקה בין השכבה גדלה לאחרונה ומשטח השן. ברפואת שיניים קליניות מליטה חלשה היא סיבה העיקרית לכישלון השיקום של החומרים זמינים כרגע. הידבקות עני בדרך כלל תוצאות בפערים בממשק אמייל-השיקום, המגדיל את הסיכון לדליפת חיידקים ועששת משנית. לכן, הקובץ המצורף החזקה של השכבה גדלה עתה נוצרה בהידרוג'ל CS-אמל יש את הפוטנציאל למנוע היווצרות של עששת חדשה בשוליים של השיקום ולשפר את העמידות של השחזורים.
אתגרים ותוכניות לעתיד
לאחר תיקון על ידי amהידרוג'ל elogenin-chitosan, התכונות מכאניות של פני השטח האמייל חרוטים השתפרו להפליא. האמייל תוקן הידרוג'ל CS-אמל הראה קושי גדול יותר באופן משמעותי ומודולוס אלסטיות מ דגימות שליטה בגלל החבילות מאורגנות של גבישי אפטיט דומים למבנה אמייל 21. הטכניקה לעומת זאת יש לו את המגבלות הבאות: (i) את הקשיות ואת מודול עדיין אינן עומדות ברמה של אמייל בריא טבעי בשל הנוכחות של חומר וחוסר המבנה מנסרתי-interprismatic heirarchial אורגניים; (Ii) כמות זמן הממושכת (3-7 ימים) הייתה זקוקה לייבוש הידרוג'ל ומינרליזציה כדי להשלים.
יש צורך במחקרים נוספים כדי להתגבר על המגבלות לעיל. אסטרטגיה אפשרית אחת לשיפור תכונות מכאניות תהיה היישום חוזר ונשנה של הידרוג'ל CS-אמל כדרך יעילה להשיג שכבה עבה יותר לתיקון. עיכול של החומר האורגני בתהליך מינרליזציה הוא stra אחרtegy לשיפור תכונות מכאניות. ניסויים הם בהתקדמות כדי לקצר את זמן הייבוש של הידרוג'ל כמו גם התקדמות מינרליזציה 22. בנוסף, יש צורך לפתח מערכת מודל עששת שמהווה את ההשפעות של חלבוני רוק בגידול גבישים.
שלבים וגורמים קריטיים
בהכנת הידרוג'ל CS-אמל לשיקום אמייל, אחד השלבים הקריטיים ביותר להשגת שכבת זגוגית עם ממשק צפוף התאמת ערך ה-pH של הידרוג'ל בשל האינטראקציה pH תלוי בין chitosan וamelogenin 16. Chitosan הוא פוליסכריד שרשרת ליניארית הכולל גלוקוזמין ושאריות גלוקוזאמין N-אצטיל חבר יחד על ידי β-1 ,4-glycosidic אג"ח. בגלל קבוצות אמינו, תכונות כימיות ופיסיות של chitosan יכולים להיות מכוונת על ידי שינוי ערכי ה-pH של התקשורת. לדוגמא, במערכת CS-אמל, בערכי ה-pH נמוכים יותר, גhitosan תיקשר עם amelogenin באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית, לעומת זאת ב-pH גבוה יותר מאשר 5.5, האינטראקציה chitosan הייתה חלשה בשל המסיסות הנמוכה שלה וdeprotonation 16. תכונת ה-pH היענות זה עושה הידרוג'ל chitosan לא רק ספק amelogenin אידיאלי, אלא גם שכבת הגנה יעילה אמייל מפני שחיקה. בסביבת פה חומצי, קבוצת אמינו של chitosan יכולה ללכוד את יוני המימן, ויוצר מחסום חיובי כדי למנוע דיפוזיה של יוני מימן אל פני השטח האמייל, כמו גם אינטראקציה עם amelogenin כדי למנוע האובדן שלה לרוק. כאשר ה-pH הנורמלי משוחזרת על ידי רוק amelogenin הוא שוחרר מהידרוג'ל CS-אמל לשלוט צמיחה מחודשת של אמייל.
במהלך צמיחה מחודשת האמייל, נוכחות amelogenin מהווה גורם קריטי בשליטה על צמיחת המוטית והמוארכת של גבישי אפטיט. בהידרוג'ל CS-אמל, אשכולות Ca-P מראש התגרענות, התייצבו על ידי amelogenin, במצטבר כדי ליצור ליןרשתות אוזן שפתיל נוסף עם גבישי אמייל וסופו של הדבר הופך לגבישי אפטיט כמו אמייל-16,23-24. הצמיחה המתמשכת של גבישים יוצרת ממשק צפוף, אשר מקדם אג"ח מצוין בין השכבה גדלה לאחרונה והאמייל.
לסיכום, אנחנו מציגים הידרוג'ל amelogenin-chitosan (CS-אמל) מבטיח לשיקום אמייל שטחי. מיקרו כמו האמייל המאורגן נוצר בהידרוג'ל יכול לשפר באופן משמעותי את התכונות מכאניות של אמייל חרוט; בינתיים, הקובץ המצורף החזקה של שכבת התיקון יכול למנוע את היווצרות עששת חדשה בשוליים של השיקום ואפשרות לשפר את העמידות של שחזורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
