Summary
В этой статье мы опишем протокол для изготовления в амелогенина-хитозан гидрогель для поверхностного реконструкции эмали. Организованная в росте месте кристаллов апатита в гидрогеля формируется плотный интерфейс эмаль-реставрационные, что позволит улучшить эффективность и долговечность реставраций.
Protocol
Человеческие моляры были извлечены следующие стандартные процедуры по добыче на Острув школы стоматологии Университета Южной Калифорнии и обрабатываются с одобрения Institutional Review Board в.
1. Подготовка выгравирована кислотой Зуба Slice
- Выберите человека третий коренной зуб без восстановленных кариеса.
- Удалить корневой части коренного зуба, и сократить корону моляра продольно на ломтики толщиной 2 мм с помощью низкоскоростного алмазной пилой с водяным охлаждением. Ультразвуком очистить эти ломтики в течение 2 мин, а затем промыть деионизированной водой 3 раза.
- Для имитации эрозии поражений, травления ломтики зубов с 30%-ной фосфорной кислоты в течение 30 сек, то немедленно промыть деионизированной водой.
- Ультразвуком очистить выгравированные ломтики в течение 2 мин, а затем промыть их деионизированной водой 3 раза.
2. Подготовка амелогенина-хитозана гидрогеля
- ПОДГОТОВКАн хитозана раствора
- Растворить 1% (вес / объем) хитозан (средняя молекулярная масса, 75-85% деацетилированного) в 1% (объем / объем) раствора уксусной кислоты с последующим перемешиванием при 80 ° CO / N.
- После охлаждения раствора до комнатной температуры, фильтрации раствора хитозана с использованием 0,45 мкм фильтр. Регулировка величины рН до 5,0 добавлением 1 М раствора NaOH.
- Получение кальциевого и фосфатного раствора (0,1 М)
- Взвесить хлорид кальция (CaCl 2) и подготовить решение на 0,1 м, затем смешать с помощью вихрь, пока раствор не станет прозрачным. Регулировка величины рН до 11 добавлением 1 М раствора NaOH.
- Взвесить двухосновный фосфат натрия (Na 2 HPO 4) и подготовить решение на 0,1 м, затем смешать с помощью вихрь, пока раствор не станет прозрачным.
- Экспрессия и очистка рекомбинантного амелогенина 17-18
Рекомбинантный полнометражный свиной амелогенин (rP172) используется здесь имеет 172 аминокислот и является аналогом полныйДлина родной свиной P173, но не имея N-концевой метионин, а также фосфатную группу на Ser16 18.- Добавить 20 г лизогении бульона (LB) Агар порошка в 500 мл деионизированной воды, автоклав раствора при 121 ° С (значение жидкость) в течение 20 мин. Пусть агар остыть до ~ 55 ° C, добавляют ампициллин (100 мкг / мл) в растворе агара.
- Перенести агар решение чашки Петри, пусть каждая пластина здорово, пока он не является твердым телом, затем переверните, чтобы избежать конденсации на агар. Храните пластины в полиэтиленовых пакетах при 4 ° С.
- Подряд LB агар с рекомбинантных клеток (E.coli-BC21) от глицерина складе (-80 ° С). Инкубируйте пластин O / N при 37 ° С
- Подготовка 50 мл NZCYM СМИ и автоклав СМИ при 121 ° С в течение 30 мин. Разрешить СМИ остыть, добавить 50 мкл 100 мкг / мл ампициллина в средствах массовой информации 50 мл.
- Привить одну колонию из агаром LB в 50 мл NZCYM СМИ дополненной ampicillдюйма Инкубируйте клетки O / N дрожащим инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Подготовить 1 л NZCYM СМИ и автоклав СМИ при 121 ° С в течение 30 мин. Добавить 1 мл 100 мг / мл ампициллина до 1000 мл среды. Возьмите оптическую плотность (OD) чтения как заготовки с помощью UV-VIS спектрофотометр. ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте это после первого чтения.
- Привить 10 мл клеточной культуры с шага 2.3.5 в 1000 мл среды, начиная с шага 2.3.6. Считать оптическую плотность при 595 нм сразу после инокуляции. Снимите показания оптической плотности периодически отслеживать рост. ПРИМЕЧАНИЕ: Читайте заготовки каждый раз ОП берется.
- Вызвать 700 мкл изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG, 1 М), когда рост бактерий достигает до примерно 0,75 ~ 0,8 ОП при 595 нм.
- Сбора клеток при OD достигает 1,1. Налейте содержимое колбы в 6 пластиковых бутылок. Баланс и весят бутылки перед использованием центрифуги. Центрифуга течение 20 мин при 8554 мкг при 4 ° С.Держите осадок клеток в -20 ° CO / N.
- Выньте ячейки гранул и объединить их в 50 мл трубки. Добавить 3,5 мл 4М гуанидиновым HCl на L брожения. Разрушать ультразвуком 2-3 раза на льду, 30 секунд каждый раз, с минутными интервалами 1.
- Сделать 6x разведения объема клеток с 0,5% муравьиной кислоты и дайте ему движение в холодном помещении в течение 2 часов. Центрифуга в течение 30 мин, 8554 мкг при 4 ° С. Держите супернатант. Добавить 20% насыщенного сульфата аммония с помощью насыщенного раствора акции и переполох в холодной комнате, O / N.
- Центрифуга в течение 30 мин, 8554 мкг при 4 ° С и сохранить гранулу. Развести гранулы в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA), нагрузки на колонку C4 (10 • 250 мм, 5 мкм) и фракционирования с использованием линейного градиента А = 0,1% TFA и B = 60% ацетонитрила в TFA, в скорость 1,5 мл · мин -1 течь.
- Замораживание раствора белка на сухом льду и лиофилизировать замороженный образец O / N.
- Подготовка амелогенина-хитозана (CS-AMEL) HYDROGэль (рис. 1А)
- Добавить 200 мкг rp172 в пробирку, содержащую 960 мкл 1% раствора хитозана, затем смешать с помощью вихря, пока раствор не станет прозрачным.
- Добавить 25 мкл 0,1 М CaCl 2 раствором с последующим 15 мкл 0,1 М Na 2 HPO 4 решения амелогенина раствора, содержащего хитозан, затем смешать с помощью вихря в течение 5 мин.
- Доводят рН раствора CS-AMEL до 6,5 путем осторожного добавлени 1 М раствора NaOH. CS-AMEL гидрогель будет формироваться, когда значение рН достигает 6,5.
3. Эмаль Восстановление в амелогенина-хитозана гидрогеля
- Подготовка искусственного решения слюны
- Растворить определенное количество хлорида магния (MgCl 2, 0,2 мМ), хлорид кальция (CaCl 2, 1 мМ), дигидрофосфат калия (KH 2 PO 4, 4 мМ), хлорид калия (KCl, 16 мМ) и хлорид аммония ( NH 4 Cl, 4,5 ммоль) в 20 мМ HEPES(4 - (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этан-сульфоновой кислоты) буфера 12.
- Регулировка рН до 7,0 с помощью 1 М NaOH и хранить искусственную слюну раствор при 4 ° С.
- Перед использованием раствор, добавить фторид натрия (NaF, 300 частей на миллион).
- Применение CS-Амель гидрогеля
- Применить около 20 мкл CS-AMEL гидрогеля к травлению зуба долькой с помощью шприца (рис. 1В).
- Сушат гидрогель покрытый кусок зуба в эксикаторе при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Передача кусочек зуба в химический стакан, содержащий 30 мл искусственной слюны раствора. Стакан накрывают алюминиевой фольги, а затем держать стакан в печи при 37 ° С в течение 7 дней.
- Снимите кусочек зуба и высушите его в эксикаторе при комнатной температуре.
4. Характеристика интерфейса между Недавно Grown слоя и эмали
Микроструктура поверхности раздела между вновь выращенного слоя и эмали было наблювед помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) и высокий революции просвечивающей электронной микроскопии (HR-TEM). Образец TEM получали, используя сфокусированный пучок ионов (FIB) техника, шаги, на которые заключаются в следующем.
- Загрузите образец в приборе FIB-SEM и закончить все выравнивания в соответствии с инструкциями по эксплуатации. ПРИМЕЧАНИЕ: Точная регулировка Z должна быть выполнена, по крайней мере в 2 раза.
- Внесите углеродного слоя (15 × 3 мкм) на образце, чтобы защитить основные структуры (рис. 2а).
- Мельница образец тщательно на верхних, нижних и правой сторон углеродного слоя, чтобы подготовить тонкую часть образца, а затем разрезать нижнюю сторону этой тонкой части. ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте выравнивание ионного пучка перед каждым стадии измельчения (рис. 2В).
- Weld совет Pt на тонкий кусок и сократить левую сторону, чтобы отделить образец кусок (рис. 3C). ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте выравнивание ионного пучка до этапе сварки.
- Выньте тон PT чаевые с образцом медленно, и смонтировать слоистую образец на лифт-аут ТЕМ сетки.
- Снимите наконечник от образца, и тонкие образца до его толщина не меньше 100 нм (рис. 3D). Удалите образец из инструмента для выполнения ТЕА наблюдения. ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте выравнивание ионного пучка перед каждым процессом прореживания.
5. Оценка Binding и механические свойства Недавно Grown слоя
- Связывание сила оценивается путем ультразвуковой обработки. Держите ремонт зуба кусочек в ультразвуковой очиститель (42 кГц, 100 Вт) в течение 10 мин, а затем наблюдать интерфейс между отремонтированного слоя и естественной эмали с обратного рассеяния электронов SEM анализа.
- Измерьте твердость и модуль упругости при 20 контрольных точек на каждой ремонтируемой поверхности эмали (п = 3) с помощью нано-индентора с наконечником Беркович.
6. Иммунофлуоресценции Окрашивание
- Вымойте кусочек зуба с Трис BuffeR физиологический раствор (TBS) в течение 15 мин.
- Блок 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TBS в течение 15 мин.
- Удалить жидкость и инкубировать образец O / N с 1 ° АВ (1:500 Chicken Anti-амелогенина) разбавленной в Трис-буфере (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Промыть образец с TBS в течение 30 мин и инкубировать O / N с 2 ° АВ (1:100 Anti-курица FITC), разведенного в TBS.
- Промыть образец с TBS в течение 30 мин и оставьте сохнуть в течение еще 30 мин.
- Соблюдайте по флуоресцентным микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность протоколу, описанному здесь демонстрируется с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), выбранный область дифракции электронов (Саед) и рентгеновской дифракции (РД) анализирует. После ремонта по амелогенин-хитозан (CS-AMEL) гидрогеля в течение 7 дней, слой эмали, как с толщиной 15 мкм был образован на протравленной поверхности эмали. Вновь выращивают слой был изготовлен из очень упорядоченных массивов кристаллов с диаметром ~ 50 нм, растет преимущественно вдоль с-оси, перпендикулярной поверхности (стрелки на фиг.3А). Стоит отметить, что эти игольчатые кристаллы были организованы в пучки, которые похожи на основных единиц естественной эмали (рис. 3В). SAED результат отремонтированного слоя выставлены шаблон дугообразную раскрывая иерархическую согласование новых выращенных кристаллов вдоль [002] направлении (рис. 3C). Анализ XRD подтверждено, что вновь выращивают слой состоит из апатитаКристаллы, которые были выровнены вдоль кристаллографической оси с, в соответствии с SEM и Сеад наблюдений (рис. 3D).
Фиг.4 показывает микроструктуру поверхности раздела между вновь выращенного слоя и естественной эмали. Обратите внимание, что кристаллы не растут в тех же направлениях, оригинальные эмали кристаллитов. Видно, что рост апатит белок-опосредованной привело к перпендикулярной ориентации вновь выращенных кристаллов относительно естественных кристаллов эмаль (фиг.4А). Предложенные механизмы ремонт в том числе стабилизации Ca-P кластеров и их последующей организованной кристаллизации по амелогенина были представлены в нашем предыдущем исследовании 16. Различие между новообразованной и оригинальных кристаллов было выявлено по быстрого преобразования Фурье анализ (FFT), который показал различные шаблоны, сигнализирующие о том, что кристаллы в эмали и в расплавленном отремонтированного слоя вырос сотличается ориентация 16. Кроме того, нет никаких видимых разрыв на границе раздела между восстановленной слоем и подложкой эмали. На наноуровне, эмали и отросших кристаллы конденсированы вместе с образованием шва интерфейс (черные стрелки на фиг.4В).
Прочность сцепления между восстановленной слоем и естественной эмали оценивали по ультразвуковой обработки 16. После обработки ультразвуком в течение 10 мин, вновь вырос слой, образованный в гидрогеле CS-Амель еще тесно связан с поверхности эмали (рис. 5А), и организованная структура сохранилась (рис. 5Б). Для образца, обработанного хитозана гидрогеля без амелогенина, однако, большой зазор между эмалью и отремонтированного слое наблюдалось после ультразвуковой обработки (фиг. 5C).
Чтобы четко различать вновь выросли слоя и естественной эмали, в амелогенина в новыйLY-вырос слой Иммунофлуоресценции помечены. Наличие амелогенина была продемонстрирована зеленой иммунофлуоресценции в недавно выращенного слоя (рис. 6).
Механические свойства, такие как твердость и модуль упругости вновь выращенного слоя были проанализированы с помощью теста наноиндентирования 16. Как показано на фиг.7, после кислотного травления твердость и модуль поверхности эмали снизилась почти 98% и 88%, соответственно. Контрольная группа лечить хитозана гидрогеля без амелогенина показал ограниченное улучшение в обоих твердости и модуля. Напротив, после минерализации в гидрогеля CS-Амель, мы наблюдали увеличение почти в 4 раза по модулю и 9 раз в твердости.
Рисунок 1. Фотографии амелогенин-хитозан (CS-AMEL) ч ydrogel. (А) Изображение типичного CS-Амель гидрогеля. (B) Применение CS-Амель гидрогеля на кислой гравировкой ломтик зуба.
Рисунок 2. Типичный процесс сфокусированного ионного пучка для пробоподготовки ПЭМ. (A) Осаждение углеродной слоя на ремонтируемой поверхности эмали. (B) тщательно Фрезерование образца вокруг углеродного слоя, чтобы подготовить тонкую часть образца. (C) Сварочный наконечник Pt на тонкой части. (D) Разбавление образца пока его толщина не меньше 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
5 дюймов "Первоначально" / files/ftp_upload/51606/51606fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Характеристика недавно выращенной слоя после минерализации в амелогенина-хитозан гидрогеля в течение 7 дней. (A) После 7 дней минерализации с амелогенина-хитозан гидрогеля, слой эмали, как сформированного на поверхности протравленной эмали. На врезке показано толщину вновь выросли слоя; прямоугольник показывает область, соответствующую. Белые стрелки указывают апатит ориентации в недавно выращенной слоя. (В) Связки организованных кристаллов были найдены внутри отремонтированного слоя. Стрелки указывают на типичном пучка параллельных кристаллов внутри вновь выращенного слоя. Вставка показывает однородную поверхность ремонтируемой слоя. (С), выбранна область дифракции электронов (SAED) образ вновь выращенного слоя. Вставка показывает ТЕМ изображение восстановленной слоя, полученного путем сфокусированного ионного пучка (FIB) фрезерования. (D) XRD спектры вновь выращенного слоя послеминерализация в амелогенина-хитозан гидрогеля в течение 7 дней. Воспроизводится с разрешения ссылкой 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Микроструктура интерфейса между вновь выросли слоя и естественной эмали. (A) Сечение СЭМ-изображение отремонтированного слоя после реминерализации в амелогенина-хитозан геля в течение 3 дней, показывая вновь выращенный слой, слитый с поверхности естественной эмали. Белые и черные стрелки указывают кристаллографические ориентации кристаллов в недавно выращенной слоя и естественной эмали, соответственно. Пунктирная линия показывает границу естественной эмали и вновь выросли слоя. (В) ВРЭМ образ Интерсталкиваются между эмали и отросшими кристалл, показывающий плавный рост кристалла на ремонтируемой эмали. Черные стрелки указывают интерфейс между отросших и эмали кристаллов. Воспроизводится с разрешения ссылкой 16.
Рисунок 5. Связывание силы между вновь выросли слоя и поверхности эмали. (А) электронное изображение обратного рассеяния сечения, и (B) второй электронное изображение поверхности ультразвуком обработанной вновь выросли слою, полученному с хитозана-амелогенин гидрогеля. Вставка показывает типичную морфологию поверхности с большим увеличением. (C) электронное изображение обратного рассеяния от поперечное сечение обработанной ультразвуком вновь выращенного слоя, полученного с хитозана гидрогеля без амелогенина. Воспроизводится с разрешения ссылкой 16. <Нет созданных плейлистов: = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51606/51606fig5highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Флуоресценции изображения поперечного сечения вновь выращенного слоя. Прямоугольник в А представляет выделенную область, соответствующую B. Стрелки на B указывают на вновь выросли слой на поверхности эмали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Твердость и ELASкрестики модуль здорового эмали, травления эмали и реконструированного эмали отремонтированного по хитозана гидрогеля с и без амелогенина. отступ площадь была похожа на то, что было ранее сообщалось 19. воспроизведена с разрешения ссылкой 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как содержание минеральных веществ эмали с высоким делает его трудное минерализованной ткани в организме человека, это биокерамических восприимчив к деминерализации процессов, которые часто встречаются как кариес зубов или эрозии. Генные мутации могут также вызвать тонкие или мягкие эмаль, ведущие к серии унаследованных болезней эмали пороков называется Амелогенез Несовершенный 20. Устные продукты медицинского назначения, содержащие фтор или СРР-АСР были на рынке в течение нескольких лет (например, лаки, зубные пасты и жидкости для полоскания рта) для содействия реминерализации начальных поражений эмали. Тем не менее, ни одна из этих коммерчески доступных продуктов не имеют потенциал, чтобы способствовать формированию организованных кристаллов апатита. Традиционные методы лечения глубоких полостях эмали связаны механическую бурение и последующее наполнение искусственных материалов, таких как амальгама, керамики или композитных смол. Такой подход не является идеальным для ранних поражений и случаев, когда большая арEAS эрозии происходят на эмали. Это потому, что непропорционально большое количество здоровой эмали должны быть удалены в результате чего больше вреда зуба. Амальгама и композитные смолы лишь временный 'ремонт' зуб и такие пломбы обычно не останавливаются распад зуба. Прочная адгезия между исходной поверхности зуба и что из пломбировочных материалов является проблемой из-за усадки материала и различий в химическом составе и микроструктуры.
Преимущества CS-Амель гидрогеля
Один из вариантов стратегии для преодоления вышеуказанных проблем является возобновление в слой эмали, как непосредственно на оригинальной поверхности эмали при жесткой химической контакт с природного субстрата может быть сформирована. В этом видео статье мы представляем новый эмали стратегии восстановления, который использует амелогенин-хитозан (CS-AMEL) гидрогель расти организованные кристаллы в пробирке на поверхности эмали. По сравнению с другими биомиметического очистныхNTS, CS-AMEL гидрогель легче подготовить для клинического применения. Кроме того, биосовместимости и способности к биологическому разложению, он имеет уникальные антимикробные и адгезионные свойства, которые важны для применения в стоматологии 16. Еще одним преимуществом является то, что надежный интерфейс между синтетические и природные кристаллов эмали способствует прочное сцепление между вновь выращенного слоя и поверхности зуба. В клинической стоматологии слабая связь является основной причиной восстановления провала имеющихся в настоящее время материалов. Плохо адгезия обычно приводит к пробелы в интерфейсе эмаль-реставрационных, которые повышают риск развития бактериальной утечки и вторичного кариеса. Таким образом, надежная привязанность вновь выросли слоя, сформированного в гидрогеле CS-Амель имеет потенциал, чтобы избежать образования новых кариеса на грани восстановления и улучшения долговечность реставраций.
Проблемы и планы на будущее
После ремонта по утраelogenin-хитозан гидрогель, механические свойства протравленной поверхности эмали были значительно улучшились. CS-AMEL гидрогель отремонтировать эмаль показали значительно более высокую твердость и модуль упругости, чем контрольные образцы из-за организованных пучков кристаллов апатита, подобных структуре 21 эмали. Метод, однако, имеет следующие ограничения: (I) твердость и модуль упругости до сих пор не соответствовать уровню естественного здорового эмали из-за присутствия органического материала и отсутствием heirarchial призматического-interprismatic структуры; (II) продлен количество времени (3-7 дней), которые необходимы для сушки гидрогеля и минерализацию, чтобы закончить.
Необходимы дальнейшие исследования, чтобы преодолеть перечисленные выше ограничения. Одна из возможных стратегий для улучшения механических свойств будет повторное применение CS-Амель гидрогеля в качестве эффективного способа получения более толстого ремонт слой. Переваривание органического материала в процессе минерализации является еще одним страtegy для улучшения механических свойств. Эксперименты ведутся, чтобы сократить время сушки гидрогеля, а также прогресс, 22 минерализации. Кроме того, необходимо разработать кариес модельную систему, на которые приходится последствий слюнных белков по выращиванию кристаллов.
Критические шаги и факторы
При подготовке гидрогель CS-AMEL для реконструкции эмали, один из наиболее важных шагов для достижения слой эмали, как с плотной интерфейса доведении величины рН гидрогеля в связи с рН-зависимой взаимодействия хитозана и амелогенина 16. Хитозан представляет собой линейный полисахарид, содержащий цепь глюкозамин и N-ацетилглюкозамина остатков, соединенных вместе β-1 ,4-гликозидных связей. Из-за своих аминогрупп, химические и физические свойства хитозана могут быть настроены путем изменения значения рН СМИ. Например, в системе CS-AMEL, при более низких значениях рН, сhitosan взаимодействовали с амелогенина через электростатическое взаимодействие, однако при рН выше, чем 5,5, хитозан взаимодействие было слабым из-за его низкой растворимости и депротонирования 16. Эта функция рН-отзывчивость делает хитозана гидрогель не только идеальную носитель амелогенина, но и эффективный слой, защищающий эмаль от эрозии. В кислой среде полости рта, аминогруппа хитозана могла захватить ионы водорода, образуя положительный барьер, чтобы предотвратить диффузию ионов водорода на поверхности эмали, а также взаимодействовать с амелогенина, чтобы избежать его потери в слюну. Когда нормальный рН восстанавливается слюной амелогенин освобождается от CS-Амель гидрогеля контролировать отрастания эмали.
В ходе эмали отрастания, амелогенин наличие является критическим фактором в борьбе с ориентированной и удлиненную рост кристаллов апатита. В гидрогеля CS-Амель, предварительно зарождения Ca-P кластеры, стабилизированные амелогенина, совокупности с образованием линуха цепи, которые в дальнейшем сливаются с кристаллов эмали и в конечном итоге превращает и эмали, как кристаллов апатита 16,23-24. Непрерывный рост кристаллов образует плотную интерфейс, который способствует отличную связь между вновь выращенного слоя и эмали.
Таким образом, мы вводим многообещающее амелогенин-хитозан (CS-AMEL) гидрогель для поверхностного реконструкции эмали. Организованный эмаль, как микроструктура образована в гидрогеле может значительно улучшить механические свойства протравленной эмали; тем временем, надежная привязанность отремонтированного слоя может избежать образования новых кариеса на краю реставрации и потенциально улучшить долговечность реставраций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human third molar | Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California | N/A | The human molars were extracted following the standard procedures for extraction at the Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California and handled with the approval of the Institutional Review Board. |
| Recombinant pocine amelogenin | Expression and purification in lab | N/A | rP172, full-length |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | Medium molecular weight, 75-85% deacetylated |
| Phosphoric acid | VWR | AA033266 | |
| Acetic acid glacial | VWR | A036289 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH9292 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Dibasic sodium phosphate anhydrous | VWR | BDH0316 | |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RP | Agilent Technologies Inc. | 230255 | |
| Ammonium sulfate | VWR | BDH8001 | |
| Trifluoroacetic acid | VWR | AAAL06374 | |
| Acetonitrile | VWR | BDH1103 | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH0244 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | VWR | BDH9268 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH0258 | |
| Ammonium chloride | VWR | AAAA15000 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) | VWR | AAA14777 | |
| Sodium fluoride | VWR | AA11561 | |
| Tris-buffered saline | Bio-Rad | 170-6435 | 10× TBS |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore | 12659 | CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals |
| Triton X-100 | EMD Millipore | TX1568-1 | |
| Chicken Anti-Amelogenin | N/A | N/A | A gift from Prof. Malcolm Snead, University of Southern California |
| Bovine Anti-Chicken IgY-FITC | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2700 | |
| High Performance Liquid Chromatography System | Agilent Technologies Inc. | Varian Prostar 210 | |
| C4 column | Phenomenx | Jupiter 5μ 300A | |
| Scanning Electron Microscopy | JEOL | JSM-7001 | |
| FIB-SEM | JEOL | JIB-4500 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM-2100F | |
| Digital low speed diamond saw | MTI Corporation | SYJ-150 | |
| Fluorescence microscopy | Leica | DMI3000 B | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | 2510 | 42 kHz, 100 W |
| Nano-indenter | Agilent Technologies Inc. | MTS XP |
References
- Moradian-Oldak, J. Protein- mediated enamel mineralization. Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).
- Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel. Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).
- Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions. J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).
- Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate. Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).
- Li, L., et al. Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics. Advanced Materials. 23, (2011).
- Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions. Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).
- Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride. Biomaterials. 30, 478-483 (2009).
- Li, L., et al. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks. J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).
- Chen, H., et al. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Advanced Materials. 18, (2006).
- Yamagishi, K., et al. A synthetic enamel for rapid tooth repair. Nature. 433, 819-819 (2005).
- Bleek, K., Taubert, A. New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution. Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).
- Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces. Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).
- Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).
- Yang, X., et al. How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite. Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).
- Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels. Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).
- Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface. Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).
- Hu, C. C., et al. Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs. Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).
- Bromley, K. M., et al. Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals. Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).
- Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly. Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).
- Wright, J. The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta. Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).
- Eimar, H., et al. Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions. Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).
- Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree. Connect Tissue Res. , (2014).
- Pouget, E. M., et al. The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM. Science. 323, 1455-1458 (2009).
- Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters. Science. 322, 1819-1822 (2008).
