Summary
Crista neural (CN), as células derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) tem um grande potencial para a modelagem de desenvolvimento humano e de doenças e para terapias de substituição celular. Aqui, uma adaptação livre de alimentador do atualmente utilizadoAbstract
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm um grande potencial para o estudo do desenvolvimento embrionário humano, para a modelagem de doenças humanas no prato e como fonte de células para transplante para aplicações regenerativas após doença ou acidentes. Células da crista neural (NF) são os precursores para uma grande variedade de células somáticas adultas, tais como células do sistema nervoso periférico e as células gliais, os melanócitos e células mesenquimais. Eles são uma valiosa fonte de células para estudar aspectos do desenvolvimento embrionário humano, incluindo a especificação destino e migração celular. Além disso a diferenciação de células progenitoras NC em tipos de células diferenciados terminalmente oferece a possibilidade de modelar doenças humanas in vitro, investigar os mecanismos da doença e para gerar células medicina regenerativa. Este artigo apresenta a adaptação de um protocolo atualmente disponível em vitro de diferenciação para a derivação de células a partir de NC hPSCs. Este novo protocolo requer 18 dias de diferentiation, é, facilmente escalável e altamente reprodutível entre (hiPSC) linhas humana (hESC) linhas de células estaminais embrionárias, bem como humana induzida de células-tronco pluripotentes sem alimentador. Ambos os antigos e novos protocolos de produzir células NC de igual identidade.
Introduction
Células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) mostraram um imenso potencial, em particular para a investigação e tratamento futuro de doenças humanas para as quais nem bons modelos animais nem tecidos primários estão disponíveis. Exemplos de aplicação para a tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / hiPSC são os seguintes: Células de interesse particular podem ser gerados a partir de células estaminais embrionárias humanas / hiPSCs para a medicina regenerativa em quantidade ilimitada 1. As células podem ser produzidos a partir de pacientes portadores de uma doença específica e utilizado para estabelecer, em modelos de doenças in vitro, 2,3. Tais modelos de doenças pode ser empregado para a triagem de drogas em grande escala na busca de novos compostos de drogas 4, bem como testes de drogas existentes para a eficácia e toxicidade 5. Em modelos de doenças in vitro podem levar à identificação dos mecanismos da doença da novela. Para todas as aplicações da tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / iPSC é importante trabalhar com específica, bem definirtipos d célula afetada na doença de interesse. Assim, a disponibilidade de protocolos de diferenciação in vitro sólidos e reprodutíveis é fundamental para todas as aplicações da tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / hiPSC. Protocolos são desejáveis que mostram variabilidade mínima, custa tempo, esforço, dificuldade e custo, bem como a reprodutibilidade máxima entre linhas hESC / hiPSC e diferentes pesquisadores.
Crista neural (NF), as células surgem durante neurulação vertebrado entre a epiderme e o epitélio neural. Eles proliferam e migram extensivamente durante todo o desenvolvimento do embrião, dando origem a uma diversidade impressionante de tipos de células descendentes, incluindo o osso / cartilagem, o esqueleto craniofacial, nervos sensoriais, as células de Schwann, os melanócitos, células musculares lisas, neurônios entéricos, os neurônios autonômicos, células cromafins , células do septo cardíaco, dentes e adrenal / tireóide células glandulares 6. Assim, células de CN são um tipo de célula atraente para o campo de células-tronco e importante para oa modelagem de uma variedade de doenças, tais como a doença de Hirschsprung, 7, disautonomia familiar 8, bem como os cancros, tais como o neuroblastoma 9. Além disso, eles oferecem a possibilidade de estudar os aspectos do desenvolvimento embrionário humano in vitro.
A atualmente disponíveis e amplamente aplicado em protocolo de diferenciação in vitro para a derivação de células da CN de hESCs 10,11 requer até 35 dias de diferenciação e que envolve indução neural em células alimentadoras, como as células do estroma MS5 e é, portanto, realizadas em condições mal definidas. Embora possa ser em maior escala para gerar grandes quantidades de células da CN, por exemplo necessário para high-throughput screening de drogas 4, este é o trabalho e onerosa. Além disso, envolve passaging manual das rosetas neurais, que podem ser difíceis de reproduzir e, portanto, é sujeito a variabilidade global, em particular quando é aplicado a uma grande variedade de células estaminais embrionárias humanas, ou hiPSClinhas. Aqui, a derivação gradual de células NC em um protocolo de 18 dias que está livre de células alimentadoras é mostrado. Este método é mais curto e mais definido do que o protocolo usado atualmente. Além disso, ele é muito robusto na geração de células NC entre diferentes linhas hiPSC. Importante, é mostrado que as células NC gerados por ambos os protocolos surgem na fronteira de rosetas neurais (doravante denominado roseta-NC ou R-NC). As células derivadas utilizando um dos dois protocolos olhar morfologicamente idênticos, eles expressam os mesmos marcadores NC e se agrupam em análise de microarray. Células NC derivadas usando o novo protocolo (R-NC) são funcionais, semelhantes às células NC derivados usando o protocolo de idade (MS5-R-NC) de tal forma que eles podem migrar e diferenciar-se em neurónios mais. Portanto, as células podem ser utilizadas simultaneamente com as células MS5-R-NC. O protocolo de células R-NC para a derivação de células a partir de células estaminais embrionárias humanas NC / iPSC será útil para todas as aplicações da tecnologia hESC / iPSC envolvendo a linhagem NC. </ P>
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Protocol
1. Preparação de Meios de Cultura, pratos revestidos e Manutenção de hPSCs
Preparação 1.1 Mídia
Nota: Filtro de todos os meios para a esterilização e armazenar a 4 ° C no escuro por até 2 semanas. Números nomes de reagentes, da empresa e catálogo estão listadas na Tabela de Materiais.
- DMEM/10% de FBS: Combinar 885 mL de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml de Pen / Strep e 5 ml de L-Glutamina.
- HES-médio: Combinar 800 mL de DMEM/F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 mL de Pen / Strep, 10 ml de solução de MEM essencial mínimo de aminoácidos, 1 ml β-mercaptoetanol. Adiciona-se 10 ng / ml de FGF-2, depois de filtrar o meio.
CUIDADO: β-mercaptoetanol é tóxico, evitar a inalação, ingestão e contato com a pele. - Meio KSR diferenciação: Combinar 820 mL Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-Glutamina, 10 ml de Pen / Strep, 10 ml de solução de MEM essencial mínimo de aminoácidos e 1 ml β-mercaptoetanol.
- N2-differentiatino meio: Dissolve-se 12 g do pó em DMEM/F12 980 mL de dH2O, adicionar 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonato de sódio e 100 mg de APO transferrina humana. Misturar 2 mL de dH2O com 25 mg de insulina humana e 40 mL de NaOH 1 N, adicionar a solução dissolvida ao meio. Adicionar 100 ul de di-hidrocloreto de putrescina, selenito de 60 ul, 100 ul de progesterona e trazer o volume até 1 L com dH2O
1.2 Revestimento de placas de cultura
- Revestimento Matrigel: Thaw 1 ml congelado matrigel alíquota pipetando 19 ml DMEM/F12 sobre a alíquota até que se dissolva. Remover aglomerados fazendo-o passar através de um filtro de células de 40 ^ m e placa 8 ml/10 cm de disco. Incubar os pratos durante 1 hora à temperatura ambiente. Aspirar o matrigel imediatamente antes do plaqueamento das células.
Nota: trabalhar rapidamente com matrigel porque podem aglutinar-se a temperaturas acima de 4 ° C. - Revestimento PO / Lam / FN: Adicionam-se 10 ml de 1x PBS contendo 15 ug / ml de bromidrato de poli-L Ornithin para uma placa de 10 cm. Incubar o prato durante a noite a 37 ° C. Lavar as placas com PBS 1x e depois adicionar 10 ml/10 cm de disco de 1x PBS contendo 2 mg / ml de rato laminina-I e 2 ug / ml de fibronectina. Incubar os pratos durante a noite a 37 ° C. Antes de plaqueamento das células, remova completamente a solução e deixe secar completamente as placas à temperatura ambiente durante 15-20 minutos por pé-los para a cultura parede capô do tecido, sem a tampa.
Nota: Os pratos são completamente seco e pronto para o chapeamento de celular quando pode-se ver as estruturas de cristal na superfície (visível a olho nu). As placas podem ser mantidas à temperatura ambiente durante algumas horas a este estado seco. Pratos PO / Lam / FN tem que estar preparado dois dias antes do tempo. Em casos de emergência Lam / FN pode ser incubada por apenas 2-4 horas. No entanto, isso pode arriscar subótimas resultados diferenciação / sobrevivência.
1.3 Manutenção de hPSCs
Nota: hPSCs são mantidos em 0,1% de gelatina e rato mitoticamente inactivadas fibroblastos embrionários (MFE) em HES meio suplementado com 10 ng / ml de FGF-2, conforme descrito anteriormente 10,12. As células devem ser divididas a cada 6-8 dias.
- Revestir uma placa de 10 cm, com 8 ml de gelatina a 0,1% (em 1x PBS sem cálcio ou magnésio), a temperatura ambiente durante 5 min.
- Descongelar MEFs congeladas rapidamente num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 milhão MEFs para 10 ml DMEM/10% de FBS.
- Aspirar a gelatina e placa das células. Incubar a 37 ° C durante pelo menos 6 horas.
- Aspirar o FBS DMEM/10% a partir da placa MEF preparado, lavar placa com 1x PBS uma vez e adicionar 10 ml de HES-meio suplementado com 10 mM Y-27632, dicloridrato. Permitir que o meio para se aquecer a 37 ° C por 20 min.
Nota: Para a divisão manual hPSCs uma câmara de fluxo laminar com um microscópio incorporado é usado. No entanto, as células podem ser passadas através de métodos alternativos adequados. - Dentro de uma câmara de fluxo laminar com um microscópio incorporado, retire colônias separadas usando um levantador de celular e deixá-los flutuar.
- Use umaSeringa de 1 ml para aspirar as colônias flutuantes e despachá-los para o, placa MEF quente fresco. Transferir cerca de um quarto das células para a nova antena. Incubar a 37 ° C.
- Alimente células diariamente com meio HES fresco.
2. Chapeamento de hPSCs para Diferenciação
Nota: hPSCs deve ser dividido ou revestida de diferenciação, quando as colônias são grandes, mas ainda tem arestas cortantes com tão pouco como possíveis células diferenciadoras nas suas fronteiras (ver Figura 1B). Quando as células são mantidas através de passagens em manual, as colónias deve ser suficientemente grande para ser facilmente visto pelo olho. Para começar a sentir certo para este ponto do tempo pode-se manter um prato HPSC separado para duas semanas sem passaging e assistir as células alcançar e passar o ponto de tempo ideal para passaging / diferenciá-los.
- Preparar placas de 10 cm com matrigel 1 h antes de iniciar a diferenciação. Revestimento matrigel bem sucedida pode serverificada com ampliação de 4x.
- Quando os hPSCs está pronto para ser dividida, aspirar o meio e adicionar 4 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para as células.
- Agite o prato na horizontal por 2 min vigorosamente até que se possa ver os MEFs como células individuais levantando a placa sob o microscópio. As colônias HPSC permanecer anexado como colônias.
- Imediata e cuidadosamente, aspirar a tripsina e deixar o prato ficar à temperatura ambiente durante 2-4 min.
- Adicionar 2 ml de HES-meio para a placa e com uma pipeta P1000, separar as células.
Nota: Se as células não podem ser levantados facilmente para fora da superfície, a placa pode ser incubada vazio à TA por mais 2-3 minutos. - Transferir as células a 8 mL de HES-meio suplementado com 10 mM Y-27632, dicloridrato.
- Aspirar o matrigel a partir de uma previamente preparada placa de 10 cm. Placa as células em uma relação de 1:1 ou 1:2 (por exemplo: as células de uma placa de 10 cm são divididos em duas placas de 10 cm) sobre a placa de matrigel. Incubar a 37 °C durante a noite.
Nota: Esta camada deve resultar em cerca de 100.000 células / cm 2.
3. Indução da diferenciação neural
Nota: A diferenciação pode ser iniciado (dia 0), quando as células são 90-100% confluentes (ver Figura 1C), normalmente no dia seguinte. Se a confluência exata ainda não foi alcançado, as células podem ser alimentados diariamente com HES-médio até que estejam prontos para a diferenciação. Alternativamente, o número inicial de células plaqueadas pode ser aumentada.
- No dia 0-3, as células alimentar diariamente, com 10 ml/10 cm de disco médio KSR diferenciação contendo 0,1 uM e 10 uM LDN193189 SB431542.
- Nos dias 4 e 5 de alimentação das células com 75% de meio KSR-diferenciação e 25% de meio N2-diferenciação tanto contendo LDN193189 e SB431542.
- No dia 6 e 7 de alimentos para as células com 50% de médio KSR-diferenciação e 50% médio N2-diferenciação ambos contendo LDN193189 e SB431542.
- No dia 8 e 9 de alimentação das células com 25% de meio KSR-diferenciação e 75% de meio N2-diferenciação tanto contendo LDN193189 e SB431542.
- No dia 9 e 10 de preparar pratos PO / Lam / FN, tal como indicado em 1.2.2 por replating das células no dia 11.
- No dia 10 células de alimentação com meio N2-diferenciação contendo LDN193189 e SB431542.
4. Repique em gotas para Especificação NC
- No dia 11 aspirado Lam / FN a partir dos pratos previamente preparados e deixá-las secar completamente à temperatura ambiente, durante 20-30 minutos, tal como explicado em 1.2.2.
- Remova o meio das células em diferenciação, lave as células uma vez com PBS 1x e adicionar 8 mL accutase/10 cm prato. Incubar durante 20 min a 37 ° C.
- Usando um levantador de celular, separar as células e ressuspender-los em Accutase com uma pipeta de 5 ml. Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml.
- Adicionar 5 ml de PBS 1x e girar as células durante 5 min a 114 x g.
- Ressuspender as células em 10 ml de 1x PBS. Para garantir uma suspensão única célula, filtrá-los através de um filtro de células 40 mM e contar as células usando um hemocitômetro ou técnica equivalente.
- Rodar as células para baixo e ressuspender-los em meio N2-diferenciação contendo 200 ^ M do ácido ascórbico (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / mL de SHH, 10 uM Y-27632, dicloridrato, na concentração de 100 mil -150,000 células/10 jil.
- Usando um repeat-pipeta, placa 10 gotas ul próximos uns dos outros, sem lhes tocar na PO secos / Lam / FN 15 centímetros pratos.
Nota: Uma placa de 10 cm de células diferenciadas, normalmente resulta em cerca de 2-3 vezes 15 centímetros de pratos ou de aproximadamente 100 x 10 cm ul droplets/15 prato. - Deixe as gotículas repousar à temperatura ambiente durante 20-30 minutos, em seguida, muito cuidadosamente (para não perturbar as gotas) adicionar 30 ml de N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y e incubar a 37 ° C.
- No dia 12, cuidadosamente alimentar as células com 20 ml/15 cm de disco N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
- A partir day 14-17 alimentar as células a cada segundo ou terceiro dia com N2/AA/BDNF/FGF8.
- No dia 16 e 17 de preparar pratos PO / Lam / FN para replate células NC após FACS classificação.
5. Fluorescência celular ativado (FACS) de células NC
Nota: A preparação das células para FACS requer cerca de 2 horas.
- No dia 18 de meio de remoção, lave as células uma vez com PBS 1x no prato e adicionar 12 ml de Accutase. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C.
- Usando um levantador de célula, separar as células da superfície e deixá-los flutuar. Pipetar as células em suspensão usando uma pipeta de 5 ml, transferi-los para um tubo de 50 ml e adicionar 30 ml de PBS 1x. Rodar as células durante 5 min a 114 x g.
- Usando uma pipeta P1000, ressuspender as células em 1 ml de 2% de FBS / HBSS (HBSS contém 15 mM de HEPES). Adicionar 19 ml de 2% de FBS / HBSS e filtrar as células através de um coador de células de 40 mM para assegurar uma suspensão de células individuais. Incubar as células em gelo durante 15 min para bloqueio de anticorpos e depois contá-los usando um hemocitômetro.
- Rodar as células para baixo e ressuspender deles na concentração de 10 milhões de células / ml em 2% de FBS / HBSS.
- Separe 1 milhão de células cada um para o imaculado, single-coradas (HNK-1 apenas e só p75) e anticorpo secundário manchado apenas (APC só e 488 apenas) FACS controla.
- Adicionar 5 mL de HNK-1 e 5 uL de anticorpo primário p75 por 10 milhões de células em 1 ml de suspensão apropriados para as amostras e incuba-se durante 20 min em gelo.
- Lavar as células em 10 ml de PBS 1X (5 min de centrifugação a 114 xg) e ressuspender as células em 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Adicionar 2 mL de APC e 1 ml de 488 anticorpo secundário por 10 milhões de células em 1 ml de suspensão apropriados para as amostras e incuba-se durante 20 minutos em gelo no escuro.
Nota: A APC e 488 são os anticorpos secundários utilizados aqui para a coloração HNK-1 e p75, respectivamente. - Lave as células em 10 ml de 1x PBS, duas vezes, ressuspender 10 milhões de células em 500 ul de2% de FBS / HBSS contendo DAPI (a 0,5 ng / mL) ou alternativo da mancha de células vivas adequada para excluir as células mortas da análise de FACS.
- Transferir as amostras para tubos de FACS apropriar.
- Prepare os tubos de FACS com 0,5 ml de 2% FBS / HBSS para coleta de células.
Nota: As células e tubos de coleta são mantidos em gelo, no escuro, durante o tempo de classificação. - Usando uma máquina de classificação de células com lasers que podem detectar DAPI, APC e 488 tipo DAPI-/HNK-1 + / P75 + células positivas duplas.
Nota: o tempo e manipulação das células Preparação leva a uma pequena percentagem de morte celular, DAPI manchas células mortas e, assim, permite que apenas a estas células a ser excluídos da população classificada. Qualquer mancha vivo / morto alternativa funciona igualmente bem para esta finalidade. O próprio DAPI não provocar citotoxicidade na população de células vivas.
6. Repique de células classificadas, NC Manutenção e Expansão
Nota: células FACS classificadas deve ser mãolevou com cuidado especial para garantir a sobrevivência ideal. Mantenha-os no gelo até repique eles. Não vórtice ou pipeta-los duramente. As células podem ser ressuspendidas sacudindo o tubo.
- Após separação FACS, contar as células de CN, em seguida, colocá-los para baixo e ressuspender em meio N2-diferenciação suplementado com 10 ng / mL de FGF2, 20 ng / mL de EGF e 10 uM dicloridrato Y-27632 no volume apropriado para replate los em 30.000 células / 10 gotas ul.
- Completamente seco previamente preparado PO / placas Lam / FN ea placa de aproximadamente 50-70 gotas por 10 centímetros prato. Deixe os pratos repousar à temperatura ambiente durante 20-30 min.
- Adicionar muito cuidado 20 ml/10 cm prato de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sem perturbar as gotas. Incubar as células a 37 ° C.
- Alimentar as células a cada 2-3 dias com N2/FGF2/EGF.
Nota: células NC são expandidos ou repicadas aproximadamente a cada 4-5 dias ou quando eles começam a se acumulando dentro das gotículas. - Para a passagem das células NC, retire o meio, wash as células uma vez com PBS 1x e adicionar 8 mL accutase/10 cm prato. Incubar durante 20 min a 37 ° C.
- Pipetar as células para fora da placa com uma pipeta de 5 ml, e transferi-los para um tubo de 15 ml. Adicionar 6 ml de 1x PBS.
- Rodar as células durante 5 min a 114 x g.
- Ressuspender as células em meio N2-diferenciação suplementadas com 10 ng / mL de FGF2, 20 ng / mL de EGF e 10 uM Y-27632, dicloridrato, a fim de ter 20000 células/10 ul gota.
- Replate as células em 10 gotas ul em placas de PO / Lam / FN secas. Deixe os pratos repousar à temperatura ambiente durante 20-30 min.
- Adicione cuidadosamente 20 ml/10 cm prato de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incubar a 37 ° C.
Nota: células NC pode ser mantido ou ampliado por até 2 semanas, como uma população progenitor relativamente homogênea. Cultura já pode levá-los a se diferenciar em vários tipos de células descendentes.
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Representative Results
As duas melhorias mais importantes do protocolo R-NC sobre o protocolo MS5-R NC-11, são as condições de diferenciação definidos isentos de alimentação e a redução global do requisito de tempo. Células alimentadoras MS5 13 são da medula óssea células estromais derivadas de ratinho que foram mostrados para apoiar a diferenciação neural de hESCs 14. HESCs cultivadas em células alimentadoras MS5 em estruturas de baixa densidade forma epiteliais e rosetas neurais 15, na periferia do qual as células NC emergem 10, imitando assim o desenvolvimento neural humano precoce. No entanto, não é claro o que moléculas de sinalização e os factores de crescimento são libertados a partir de células de alimentação MS5. Portanto, as condições de diferenciação são mal definidos, o que torna difícil reproduzi-los em experimentos recorrentes e através das linhas HPSC. Para a indução neural adequado, hESCs tem que ser semeado em baixa densidade em pequenas colônias em células alimentadoras MS5, complicating up-scaling e alcançar altos rendimentos de células diferenciadas. Em 2009, foi desenvolvido um método que visa neuralizing hPSCs muito eficiente 12. Neste método hPSCs são semeadas a uma densidade elevada, em monocamadas na ausência de células alimentadoras MS5, a obtenção de elevados rendimentos de indução neural em 10 dias. Nós seguimos o esquema do método de adaptação do protocolo de diferenciação MS5-R-NC (Figura 1A). HPSCs cultivadas em colónias em MEFs (Figura 1B) são dispersos e semeadas em matrigel, como células individuais em uma cultura monocamada em alta densidade (Figura 1C). No dia 11 de diferenciação, a maioria das células têm neuralized êxito (PAX6-positivo, não mostrados 12). Replating as células a uma densidade elevada em gotas, permite a formação de rosetas neurais condensadas no interior da gotícula (Figura 1D e Figura 2). Células NC emergem nas fronteiras da rosetas neurais (Figura 1D </ Strong>) e migrar para fora da gota (Figura 1E). Após 7 dias de cultura das células mais NC pode ser isolado por separação FACS. HNK-1/p75 células NC duplos positivos pode ser isolada na eficiência de 20-40% (Figura 1F). Este protocolo requer 18 dias, enquanto que o protocolo MS5-R-NC exige até 35 dias, fazendo com que o protocolo de células de R-NC mais útil para uma variedade de aplicações a jusante.
O objetivo deste trabalho é gerar células NC em um protocolo mais curto, mais reprodutível e mais barato, produzindo as mesmas células como o protocolo NC idade. Temos utilizado este novo protocolo para diferenciar com sucesso pelo menos 10 hESC e hiPSC linhas derivadas de pacientes e controles saudáveis (dados não mostrados), demonstrando reprodutibilidade sólida do protocolo em diferentes linhas HPSC. O novo protocolo economiza custos, devido à utilização de LDN contra noggin, a menor utilização de SHH e a falta de MS5 custos de produção. O novo protocolo tem duração de 18 dias, em comparação a 35 diass no antigo protocolo, o que economiza cerca de 5 refeições e, assim, seus custos de mídia associados. Para investigar se as células obtidas com os dois protocolos têm identidade semelhantes, mostra-se que o desenvolvimento de células NC em ambos os protocolos segue o mesmo padrão de diferenciação (Figura 2). As células passam por um estágio de roseta neural e produzir células com morfologia idêntica NC após FACS classificação. Quanto menor o tamanho das rosetas neurais no protocolo novo em comparação com o protocolo de idade é devido a uma densidade celular elevada, após replating no dia 11. Em contraste, nos antigos rosetas protocolo formam colónias dentro HPSC, que não são tão condensado. NC células derivadas com os dois protocolos de expressar os mesmos marcadores NC biológicos, tais como HNK-1, AP2 e nestin. Analisamos células NC gerados com os dois protocolos em um nível de expressão gênica global (Figura 3A) e descobriram que as células NC gerados com os dois protocolos agrupar em conjunto. NC células que eram gênerosted pela ativação da via de sinalização Wnt (Wnt-NC) e foram mostrados para ter o potencial de geração de melanócitos 16, conjunto separadamente quando analisados por expressão gênica global, indicando que esta pode ser uma população NC diferente. Na verdade, fomos incapazes de gerar células progenitoras melanócitos in vitro a partir de células (dados não mostrados) R-NC ou MS5-R-NC. Da mesma forma, as células gliais (LSB), diferenciados por 10 dias em LDN193189 e SB431542 só mostram um padrão de expressão de genes claramente distintos. As células gliais são progenitores precoces do sistema nervoso, e, assim, são menos diferenciadas em comparação com células de CN e estão incluídas aqui como uma amostra de controlo negativo. Para avaliar se as células de R-NC gerados aqui são semelhantes às células feitas com o protocolo de idade, que demonstram a sua capacidade de migração num ensaio zero in vitro (Figura 3B). 48 horas após a riscar uma bem confluente de células de R-NC ordenados, as células migram para a SCRAtch com sucesso. Por fim, mostra-se que as células de R-NC têm o potencial para se diferenciar em células do sistema nervoso autonômico. As células foram diferenciadas de forma espontânea, durante 4 dias pós HNK1 + / p75 + FACS e coradas para Mash1 e TUJ1, genes que são expressos nos neurónios autonômicos (Figura 3C).
Figura 1. Etapas críticas do protocolo de diferenciação R-NC. A MS5-R-NC 10,11 e R-NC esquema. Protocolo de diferenciação. Os passos de diferenciação específicos dos dois protocolos são mostrados. MS5: células estromais de alimentação, KSR: médio KSR-diferenciação, N2: N2 meio-diferenciação, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: ácido ascórbico, B:. BDNF B. Mostra colônias HPSC indiferenciadas corados com Oct-4 e DAPI antes da indução de diferenciação. C. Mostra a densidade celular (90-100% de confluência) no dia 0 de diferenciação, tipicamente um dia após o plaqueamento hPSCs. D. Mostra rosetas neurais corados com Pax6 e células emergentes NC corados com HNK-1 dentro da gota. E. Mostra dia 13, as células novamente plaqueadas no dia 11 em gotículas e células NC emergentes a partir da borda da gotícula. F. FACS Representante triagem trama, mostrando HNK-1/p75 células NC duplas positivas no dia 18 de diferenciação. Os portões foram escolhidos com base nos controles manchadas não coradas e individuais (não mostrados). FACS classificação parcelas pode diferir entre experimentos, linhas HPSC eo uso do protocolo antigo ou novo em termos da percentagem de células positivas positivas e únicas duplas. Assim, é importante isolar a população positiva dupla para assegurar que as células NC apropriados são extraídos. Imagens C a F foram gerados usando o novo protocolo R-NC.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Identidade crista neural Comparável celular das células derivadas com o MS5-R-NC ou o protocolo de R-NC. Em ambos os protocolos das células passam por uma fase de roseta neural. Células NC Ordenado parecem idênticos pela morfologia e pela expressão de marcadores NC como HNK-1 e AP2. Células NC são nestin positivo, mostrando que são as células progenitoras. Barra de escala: 200 um. Todas as imagens de fluorescência são contra por DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Células Figura 3. NC gerados com o velho e o novo protocolo tem identidade similar. Uma. Agrupamento não supervisionado de dados de expressão gênica Illumina microarray comparando células NC derivados com o MS5-R-NC eo protocolo R-NC. NC células derivadas com o MS5-R-NC ou o protocolo R-NC no dia 35 ou no dia 18, respectivamente, foram analisadas em triplicata por hibridização com uma matriz Oligonucleotídeo Illumina humano 12. A análise dos dados foi realizada utilizando o software Suíte Partek Genomic. Diferenças significativas foram definidos como aqueles com uma mudança de vezes maior do que 2 e menos do que 0,05 FDR. Foram analisadas 1421 genes. As configurações padrão, como dissimilaridade amostra euclidiana, método da média conjunto de ligação e 25 para o comprimento do dendrograma foram utilizados. NC células induzidas pela ativação de sinalização Wnt (Wnt-NC) foram incluídos (as células foram diferentiated em dia LDN193189 0-3, dia SB431542 0-4, CHIR99021 dia 0-11 e FACS ordenados no dia 11 para SOX10) 16. Estas células agrupam separadamente a partir de células R-NC, indicando que as células Wnt-NC e células R-NC são populações distintas. As células diferenciadas, por 11 dias em LDN193189 e SB431542 foram incluídas como um controlo neuroepitelial (LSB). As células de R-NC e MS5-R-NC agrupar em conjunto em comparação com as células de controlo. Dados de expressão gênica-primas estão disponíveis no GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) adesão #:. GSE50643 B. Ensaio de migração. HNK1 + / p75 + FACS classificadas células R-NC foram semeadas em PO / Lam / FN em 96 poços e arranhou manualmente 24 horas mais tarde. O quadro 0 hr foi tomada imediatamente após a coçar e pós coloração com Hoechst. Os demais poços foram autorizados a migrar para 48 horas antes da segunda foto foi tirada. Barra de escala: 200 mM C. Células R-NC classificadas foram autorizados a diferenciar espontaneamente por 4 dias e foram marcadas por Mash1, TUJ1 e DAPI. Barra de escala:. 500 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para a diferenciação de células bem sucedida R-NC a partir de células estaminais embrionárias humanas / hiPSCs as seguintes considerações devem ser feitas. É crítico para o trabalho sob condições de cultura estéril em todos os momentos. Em particular, é importante testar culturas HPSC de contaminação por micoplasma regular, uma vez que esta contaminação irá dificultar a diferenciação com êxito, mas não pode ser facilmente detectada visualmente em culturas HPSC. A diferenciação de R-NC deve ser iniciada com 90-100% densidade celular; menor densidade celular afeta a sobrevivência da célula e eficiência de diferenciação R-NC. É crítico para validar empiricamente as concentrações óptimas e os números de lotes de alguns dos reagentes, em particular para suportar a diferenciação KSR NC eficiente. Quando as células são plaqueadas de novo no dia 11, em gotas, a densidade de células no interior da gota de 10 ul deve ser elevado e pode ser melhor determinado empiricamente. Adequada roseta e NC-formação depende da densidade celular apropriada dentro da gotícula. Nós empiricamente observed aumentou a sobrevivência das células quando as células são lavadas, pelo menos duas vezes após o tratamento com Accutase. Para o isolamento de células R-NC por FACS os controles experimentais adequados, tais como imaculada, de anticorpos único manchado e anticorpo secundário apenas as células manchadas são cruciais. As células mortas pode ser excluído por DAPI, 7-AAD ou coloração iodeto de propídio. Além disso, as diluições de anticorpos deve ser determinada empiricamente para cada lote de anticorpo específico. É importante para purificar células FACS R-NC por coloração dupla com HNK-1 e p75, uma vez que a coloração única pode levar à contaminação da população NC com tipos de células indesejadas, tais como células do sistema nervoso central de p75-positivos, mesoderme cedo ou placode. Em nossas percentagens de experiência da dupla contra populações manchadas individuais podem variar entre as linhas HPSC e experimentos de diferenciação. R-NC pós sobrevivência celular FACS pode ser aumentada, evitando pipetagem dura das células, em vez de sacudindo o tubo para re-suspender as células é aconselhável. Além disso, chapeamento FACS R-NCcélulas isoladas em meio condicionado (meio de filtrado, as células cresceram em antes FACS) demonstrou melhorar a sobrevivência 11. É aconselhável realizar uma diferenciação menor escala em paralelo que pode ser manchado com o Pax6 marcador epitelial neural no dia 11 e dia 14 para garantir a neutralização eficiente e formação de roseta. NC marcadores, tais como HNK-1 ou AP2 no estádio roseta para diferenciação NC adequada deve ser avaliado como bem. Além disso, as células de R-NC isolado deve ser validado por meio da morfologia e por coloração marcadores NC, como AP2, HNK-1 e nestina (Figura 2).
A derivação de células MS5-R-NC de HPSC foi descrita em 2007 por Lee et al. 10. Mostrou-se que esta população precursora pode ser propagado e mais diferenciadas in vitro em derivados da estirpe NC. Células MS5-R-NC podem ser diferenciadas usando a espontaneamente neural esfera método 10,17ou por dirigido na diferenciação in vitro. Foi estabelecido que as células MS5-R-NC podem dar origem a células do sistema nervoso periférico (neurônios autônomos e sensoriais), glia periférica (células de Schwann), miofibroblastos, células-tronco mesenquimais e sua progênie e do músculo liso 10. Transplante em pintinho e camundongos mostraram que as células MS5-R-NC migrar e diferenciar in vivo 10. Células MS5-R-NC foram mais implicado na modelagem de doenças humanas. O fenótipo característico da doença genética disautonomia familiar (FD) foi modelada in vitro utilizando células de um paciente específico MS5-R-NC-hiPSC derivados 2. NC fenotipos característicos, tais como o desenvolvimento de células NC disfuncional e migração foram mostrados em células derivadas de pacientes FD, mas não em células de controlo saudáveis. Células MS5-R-NC foram também utilizados para estabelecer testes toxicológicos de compostos que afectam a migração da crista neural durante embrionário humanodesenvolvimento, com o potencial de evitar o lançamento de futuros medicamentos que podem afetar negativamente o desenvolvimento neurológico 5. Uma aplicação interessante da tecnologia HPSC é rastreio de alto débito e de testes de opções farmacêuticos de tratamento de doenças humanas. Células MS5-R-NC foram utilizados para realizar o primeiro tal tela em um modelo de doença com base em iPSC, ou seja familiar Dysauto 4. Esta tela levou à identificação de novos compostos que possam ser ainda avaliado em ensaios clínicos.
Para todas as aplicações do campo HPSC é crítico para ter exacta, reproduzível, definido e específico em protocolos de diferenciação in vitro disponível. Neste relatório, mostramos a adaptação de um protocolo estabelecido em vitro de diferenciação para a derivação de células R-NC de hPSCs. O protocolo relatado produz as mesmas células como anteriormente relatados 10 em condições de cultura mais definida e um encurtamentor tempo. Este protocolo pode ser utilizado para gerar células de R-NC para doenças humanas que afectam as células da linhagem NC, para rastreio de compostos, os testes de toxicologia e no desenvolvimento de protocolos de diferenciação dirigidos para tipos de células derivadas da linhagem NC.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para pesquisadores avançados da National Science Foundation suíço e através de doações de NYSTEM (C026446; C026447) ea iniciativa de células-tronco Tri-institucional (Fundação Starr).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
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