Summary
Комбинированный оптический и μCT изображений в мышиной модели ортопедической инфекции имплантата, используя биолюминесцентное инженерии штамм золотистого стафилококка, при условии, возможность неинвазивного и продольно контролировать динамику бактериальной инфекции, а также соответствующий воспалительную реакцию и анатомические изменения в кости.
Abstract
Томография Комплексное стала общей технологической подхода, используемого как в доклинических и клинических исследований. Передовые технологии, которые сочетают в естественных условиях оптической и μCT визуализации позволяют визуализировать биологические явления в анатомической контексте. Эти диагностические методы могут быть особенно полезны для изучения условий, оказывающих воздействие кость. В частности, ортопедические инфекции имплантатов являются важной проблемой в клинической ортопедической хирургии. Эти инфекции трудно поддаются лечению, потому что бактериальные биопленки образуются на иностранных имплантируется материалов, что приводит к постоянной воспаления, остеомиелита и возможного остеолиз кости, окружающей имплантат, которого в конечном итоге имплантата рыхления и неудачи. Здесь мышиную модель инфицированного ортопедического протеза имплантата, который был использован участвует хирургического размещение в Kirschner-проводной имплантата в интрамедуллярной канала в бедренной кости таким образом, что конец имплантата еXtended в коленный сустав. В этой модели мышей, LysEGFP, штамм мыши, который имеет EGFP-люминесцентные нейтрофилы, были использованы в сочетании с биолюминесцентного штамма золотистого стафилококка, что, естественно, излучает свет. Бактерии инокулировали в коленных суставах мышей до закрытия места операции. В естественных условиях биолюминесцентного и флуоресцентные изображения был использован для количественной оценки бактериальной нагрузки и воспалительную реакцию нейтрофилов, соответственно. Кроме того, изображения μCT проводили на той же мышей, так что расположение 3D биолюминесцентного и флуоресцентных оптических сигналов могут совместно зарегистрирован анатомических изображений μCT. Для количественной оценки изменений в кости с течением времени, внешний том яблоком дистальных бедренных костей были измерены в определенных временных точках с помощью полуавтоматического контура основе процесс сегментации. Взятые вместе, сочетание в естественных условиях биолюминесцентного / флуоресцентных изображений с изображениями μCT может быть особенно полезно еили неинвазивный мониторинг инфекции, воспалительные реакции и анатомических изменений в костной ткани с течением времени.
Introduction
Комплексное методы доклинической визуализации, которые включают сочетание оптической и анатомической информации позволяют визуализацию и мониторинг биологических явлений в 3D 1-4. Поскольку изображения μCT позволяет изысканный визуализацию костей анатомии, используя визуализацию μCT в соединении с оптических изображений представляет собой уникальное сочетание, которые могут быть особенно полезны для изучения процессов, которые связаны с костной биологию 5-7. В качестве примера можно использовать эти методы для изучения ортопедические имплантаты инфекций, которые представляют ужасное осложнение ортопедических хирургических процедур 8,9. Бактерии биопленки образуют на имплантированных посторонних предметов, которые способствуют выживанию бактерий, выступая в качестве физического барьера, который предотвращает иммунные клетки от зондирования инфекция и блоки антибиотики доступ бактерии 10,11. Хронический и постоянный инфекция совместное ткани (септический артрит) апд кости (остеомиелит) индуцирует резорбцию кости, что приводит к расшатыванию протеза и последующего 8,9 отказа. Это приводит остеолита околопротезной связано с повышенной заболеваемости и смертности 12,13.
В нашей предыдущей работы, биолюминесцентное в естественных условиях и люминесцентные визуализации используют вместе с рентгеновской и микро-компьютерной томографии томографии (μCT) в ортопедической протеза модели совместной инфекции у мышей 14-19. Эта модель участвует размещения титана Kirschner-провод (К-проволоки) таким образом, что обрезанный конец имплантата расширенной в коленном суставе от бедренных костей мышей 14-19. Посевной материал золотистого стафилококка штамм (биолюминесцентного Xen29 или Xen36) затем пипеткой на поверхность имплантата в коленном суставе до того, как хирургический участок был закрыт 14-19. В естественных оптических изображений был использован для обнаружения и определения биолюминесцентного сигнала, которые соответствует нюMBER бактерий в зараженном совместной и костной ткани 14-19. Кроме того, в естественных условиях флуоресцентного изображения из LysEGFP мышей, которые обладают флуоресцентными нейтрофилы 20, был использован для количественного определения количества нейтрофилов, что эмигрировали в зараженных коленных суставов, содержащих К-проволочные имплантаты 14,19. Наконец, анатомические диагностические методы, в том числе высокого разрешения рентгеновских изображений и изображений μCT, разрешается соответствующее 2D и 3D анатомическую визуализацию пораженной кости по всей продолжительности хронической инфекции, которые мы бы произвольно конца обычно от 2 до 6 послеоперационных недель 16 , 18. Используя эту модель, эффективность местного и системного антимикробной терапии, защитных иммунных реакций и патологических анатомических изменений в кости могут быть оценены 14-18. В этой рукописи, подробные протоколы для оптических и μCT методов визуализации в этой ортопедической протеза модели совместной инфекции были предоставлены как representatiве системы для изучения биологических процессов в анатомической контексте кости. К ним относятся хирургические процедуры для моделирования ортопедический протез совместное инфекции у мышей, 2D и 3D в естественных процедур оптических изображений (для выявления бактериальных сигналов биолюминесцентные и флуоресцентные сигналы нейтрофилов), μCT приобретение визуализации и анализа и со-регистрация 3D оптических изображений с μCT изображения.
Protocol
Заявление по этике: Все животные были обработаны в строгом соответствии с надлежащей практикой животных, как это определено в федеральных как изложенных в защиты животных Закона (AWA), 1996 Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и PHS политики за гуманное Уход и использование лабораторных животных и всех работ животного был одобрен Джонса Хопкинса уходу и использованию животных комитета (Протокол №: MO12M465).
1. Подготовка инокулятом Mid-логарифмические Биолюминесцентный Бактерии
- Подряд биолюминесцентное С. стафилококк штамм Xen29 (или другой bioluminscent штамм такие как Xen36) на триптического соевых пластин агара (триптического соевый бульон в агар [1,5%]).
ПРИМЕЧАНИЕ: С. стафилококк Xen29 21 является генной инженерии С. стафилококк штамм, который содержит модифицированную лк оперон, полученный из Photorhabdus luminescens, которая внедрена в стабильную родной плазмиды, найденного в этой бактериального штамма. Они двигателясматриваются бактерии конституитивно излучают свет от живых и метаболически активных клеток. - Grow колоний на пластинах путем инкубации их при 37 ° С в течение приблизительно 16 ч (O / N).
- Выберите одну бактериальную КОЕ и культуру в встряхивая жидкость БСЭ (240 оборотов в минуту) в течение примерно 16 ч (O / N).
- Выполните субкультуру с 1/50 разбавления O / N культуры для получения среднего логарифмической фазе роста бактерий (продолжительность примерно 2 часа).
- Пелле, ресуспендируют и мыть бактерии 3x в PBS.
- Оценить бактериальной инокулята (1 х 10 3 КОЕ в 2 мкл PBS) путем определения плотности поглощения оптического при 600 нм.
- Проверьте КОЕ в инокулята после культивирования бактерий O / N на пластинах.
2. мыши Хирургические процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих эксперимента, использовать двенадцать-недельных самцов LysEGFP мышей. Эти мыши обладают повышенной зеленый флуоресцентный белок (EGFP), выражающее миелоидных клеток (которые состоят из мostly нейтрофилы) 20. Поддержание стерильных условий во время операции и после хирургического преп с бетадином и 70% спирта путем размещения каждой мыши на стерильной драпировки на верхней части жесткого поверхности воды, циркулирующей грелку. Используйте платье, стерильные перчатки, маску и стерилизации инструмента.
- Обезболить мышь, используя 2% вдыхания изофлураном. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Оценить соответствующий уровень анестезии, наблюдая частоту дыхания, тонус мышц, ног щепотку, роговицы рефлекс и цвет слизистых оболочек. Накройте мышей со стерильной хирургической простыне с отверстием в хирургии сайта на правом колене. Мышь должна получить вспомогательные нагревательные меры для поддержания температуры тела в то время как под наркозом. Теплый 37 ° C вода, циркулирующая в теплой воде с рубашкой одеяло или воды, циркулирующей жесткого пластика с подогревом рабочей станции (ProStation, Patterson, науки) являются хорошими способами предотвратить переохлаждение.
- Введите buprenorphине (с замедленным высвобождением) (2,5 мг / кг) подкожно непосредственно перед операцией. Дополнительные дозы с замедленным высвобождением бупренорфина можно вводить через каждые 3 дня по мере необходимости для обезболивания.
- Бритье оперативную колено и приготовительному использованием трех чередующихся скрабы, используя бетадин и 70% спирта.
- Выполните срединный разрез в коже, покрывающей правого коленного сустава. Расширить разрез кожи так, что механизм разгибателей можно четко определены.
- Выполните медиальной parapatellar Артротомия и sublux четырехглавой-надколенника механизм сухожилия разгибателей боков с пинцетом Адсон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это приносит межмыщелковой выемку бедренной кости в виду. - Вручную полосный интрамедуллярный канал с помощью 25 G иглу с последующим иглой 23 G.
Примечание: Во избежание повреждения бедра, стабилизации платформа может использоваться. Это должно быть важно для техники, чтобы минимизировать случайное перелом бедренной кости. - Вставьте медицинское марки титановой Kirschner-провод (диаметр 0,8 мм) с помощью пресс-форме технику, которая влечет за собой вручную нажатием его с помощью фиксатора, контактный, в ретроградном направлениях в интрамедуллярного канала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Титан K-провода были использованы в качестве было меньше артефакты видны на изображениях μCT с титановыми спиц по сравнению с нержавеющей стали спиц 16. - Обрежьте конец Kirschner проволоки с контактных ножей таким образом, чтобы сократить конец спицы проходит приблизительно 1 мм в коленный сустав пространстве.
- Использование микропипетку, пипетки 2 мкл 1 х 10 3 КОЕ биолюминесцентной S. стафилококк Xen29 на кончик имплантата внутри коленного сустава пространстве.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более объем приводит к широкому загрязнения ткани и меньше дискретной визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: В контрольных неинфицированных мышей, добавить 2 мкл стерильного физиологического раствора без бактерий. - Уменьшите четырехглавой-надколенника комплекс обратно в средней линии с помощью щипцов и закрыть вышележащая подкожной клетчатки и кожи, используя рассасывающиесясубкутикулярных швы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, которое претерпела операцию в компании других животных, пока полностью не восстановился. - В конце экспериментов, эвтаназии всех животных, используя углерода вдыхания углекислого согласно рекомендациям по уходу и использованию животных комитета Джона Хопкинса. Убедитесь, смерть, наблюдая животное не успеет восстановиться в течение 10 мин после окончания воздействия углекислого газа и смещения шейных позвонков.
3 2D оптических изображений (В естественных условиях Биолюминесцентный и флуоресцентная томография)
- Обезболить LysEGFP мышей (например, 2% ингаляции ИФ) и разместить их с брюшной стороны вверх в камере изображений.
- Выполните в естественных условиях биолюминесцентного изображений с помощью IVIS спектр оптического целое животное в системе естественных изображений. Прежде всего, проверьте люминесцентных и подтвердить выбор открытой FВыбор МСДЭНИ, поле зрения (FOV) C - 13 см, и прокрутите время экспозиции вниз Авто (автоматическая экспозиция настройки). Автоэкспозиция будет автоматически регулировать время приема (выдержка), бинирование (цифровой пиксель биннинга) и диафрагмы (диафрагма) прибора для оптимизации интенсивности сигнала, избегая при этом насыщенность. Затем нажмите Приобретать захватить биолюминесцентного изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации в естественных биолюминесцентное, мышей изображений от 1 - 5 мин. - Выполните последовательного в естественных условиях флуоресцентных изображений, установив флажок рядом с Fluorescent. Выберите фильтр возбуждения 465 нм и 520 нм фильтра выбросов. Выделите время экспозиции до Авто и выберите FOV C (шаг 3.2.1). Затем нажмите Приобретать для захвата изображения флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для в естественных условиях флуоресцентных изображений, мышей изображения между 0,5 сек. - Количественно в естественных сигналов биолюминесцентные как полного потока (фотонов / сек) в зоне интереса (ROI), используя Living программного обеспечения изображения сначала расширяетсяROI Инструменты часть палитры инструментов.
- Выберите Circle значок и количество трансформирования, которые соответствуют количеству подлежащих животных в поле зрения. Измените размер ROI, чтобы охватить область процентной т.е., биолюминесцентный модели диффузии собраны.
- Появится Выберите трансформирования Мера в ROI Инструменты в палитре инструментов и окна в ROI измерения. Всего Radiance (фотонов / сек) значения представляют собой сумму биолюминесцентных пикселей в рамках сформированного ROI.
- Выберите Выбрать все и скопировать вкладки в правом нижнем углу этого окна будет передавать информацию в буфер обмена и позволяют его вставки в последующих программах для анализа.
- Количественно в естественных флуоресцентные сигналы, как полная лучистой эффективности ([фотоны / сек] / [мкВт / см 2]) в круговой области интереса (ROI) с помощью Living программного обеспечения изображения.
- В окне программы Living Image, расширить ROI Инструменты в палитре инструментов. ВыберитеКруг Значок и количество трансформирования что соответствует числу подлежащих животных в поле зрения.
- Измените размер ROI, чтобы охватить область интереса соответствующий близко к биолюминесценции сигнала от предыдущего получения изображений.
- Появится Выберите трансформирования Мера в ROI Инструменты в палитре инструментов и окна в ROI измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всего Radiant эффективности ([фотон / с] / [мкВт / см 2]) представляет суммы люминесцентных пикселов в ROI. - Выбрать все и Копировать вкладки в правом нижнем углу этого окна будет передавать информацию в буфер обмена и позволяют его вставки в последующих программах для анализа.
4 μCT Image Acquisition
- Поместите наркозом мышей LysEGFP в изображения камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта камера изображений предназначен для установки как в системе формирования изображения IVIS Spectrum и квантовой FX в естественных условиях μCT системы формирования изображений, чтобы позволитькорегистрацию оптических и μCT изображений. - Откройте программу КТ и выберите Меню предустановленной 60 мм FOV STD динамический из выпадающего списка.
- Вставьте большую крышку отверстия и адаптера руку для шаттла изображений в прибор.
- Поместите трансфер изображений мыши в кронштейном затем нажмите руку в отверстие и закройте дверь. Включите режиме Live (кнопка глаз на панели управления) и размещения объекта на 0 ° и 90 ° положении козлового помощью X-ось и управления Y-оси к центру животное в окне захвата X. Затем выключите режим Live Mode, нажав на кнопку глаз.
- Приобретать динамический сканирования изображения с 60 мм FOV, нажав на кнопку КТ (рядом с кнопкой Live Mode). Экспорт полученное изображение в формате DICOM и хранить в месте, доступном позже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерный доза будет 26 мГр за одно сканирование. 30 мм Поле зрения может быть использован, если требуется лучшее разрешение.
5.3D Приобретение оптического изображения, Формирование и μCT Co-регистрации
- Поместите изображений мыши трансфер вставки в Spectrum, поместив трансфер изображений, содержащий мышь в этой вставки и обеспечить мышь не двигается.
- Использование живой образ, выберите мастера визуализации в панели управления Acquisition начать работы мастера установки. Для начала, выберите биолюминесценции, то DLIT, а затем выберите репортер "бактерии" из выпадающего меню и соответствующих фильтров выбросов для модели будет выбран автоматически, в этом случае, 500 - 620 нм.
- Выберите Далее, затем назначают параметры измерения и темах в последнем окне. В частности, изображений Тема будет мышь, Авто Установки будут отобраны позволяя автоэкспозиции, чтобы максимизировать качество сигнала, избегая при этом насыщенность, и поле зрения будет установлен в C - 13см.
- Выберите Готово в завершающем окне и окно последовательность Панели Acquisition будетutomatically заполняется последовательности DLIT. Там будет один изображение, полученное за эмиссии фильтра выбранного и автоэкспозицией выберет оптимальные настройки для каждой длины волны в соответствии с Wizard изображений выборов. Сгенерированную последовательность также включает в себя структурированную светлый образ, необходимый для генерации Заголовок поверхности с помощью топографии поверхности инструмента, указанного ниже.
- Выберите Acquire последовательности для получения данных DLIT.
- После получения изображения будет завершена, генерировать топографии поверхности. Начните с расширения вкладку топографии поверхности под инструментальную палитру.
- Далее, выберите ориентацию, что точно отражает сторону животного перед камерой или верхней части прибора IVIS. Тогда нажмите кнопку Создать поверхность. Обрезать область поля зрения, который содержит животное.
- Затем используйте фиолетовые маску, чтобы определить границы животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент маскировки использует цветовой контраст так животные с темного меха или кожи не будет маскировать соответствующим от хТаге. - Выберите Готово и поверхность появится автоматически. Сохранить результат в закладке топографии поверхности закройте вкладку как мы больше не будет нужно.
- Реконструировать положение источника оптической 3D, используя диффузные алгоритмы оптические реконструкции реализованные в живой образ 22 путем расширения вкладку DLIT 3D реконструкции.
- Изображения, полученные для последовательности DLIT показаны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение автоматически проверяет качество полученных данных и будет отменить изображения считаются слишком тусклым или где насыщенность присутствует. Выберите Пуск на нижней стороне правой. - При необходимости, можно настроить порог для каждого биолюминесцентной изображение двойным щелчком и с помощью пороговой ползунок в нижней левой стороне.
ПРИМЕЧАНИЕ: это главным образом включить более низкую интенсивность сигнала и осторожность следует практиковать, когда пороговой выше, так как это может отрегулировать общую интенсивность конечном реконструированного источника.
- Изображения, полученные для последовательности DLIT показаны.
- Откройте DICOM-браузер, нажав на значок 3D в панели инструментов в верхней части программного обеспечения (третий слева) и искать изображения Квантовая FX приобретенного ранее.
- Загрузите это фото в 3D вкладка Вид живой образ двойным щелчком по файлу для импорта.
ПРИМЕЧАНИЕ: доверительное должны определяться автоматически и привести в изображении μCT регистрируется с оптического изображения 3D.
- Загрузите это фото в 3D вкладка Вид живой образ двойным щелчком по файлу для импорта.
- Снимите топографии поверхности карту визуализации за счет расширения 3D оптических инструментов в палитре инструментов и сняв флажок помечены Display Subject Surface на вкладке Surface.
- Вручную создайте таблицу поиска для визуализации скелет и K-проволоки имплантат, что видны на изображении μCT использованием гистограммы на вкладке объем 3D Multi-Modaliти Инструменты часть палитры инструментов.
- Гистограмма представляет собой распределение интенсивности воксельных в 3D объемных данных и их цвета непрозрачности. Чтобы определить, где частности ткань интерес на гистограмме, не использовать инструмент ползунок порога рендеринг до ткани или структуры видна.
- Затем щелкните правой кнопкой на гистограмме генерировать точки и образуют кривую, чтобы изолировать эту область гистограммы. Это будет повторяться для каждой структуры - скелет с последующим К-проволоки имплантата и могут быть сохранены как таблица поиска для будущего анализа.
- Компоненты могут быть цветом, если это необходимо, дважды щелкнув то, что сгенерированный точку на гистограмме и выбрав нужный цвет в появившемся окне.
6 μCT Визуализация изображений и анализ
- Использование программного обеспечения Квантовая FX, выберите образ интерес и запустить Viewer. Выберите инструмент поворота и переориентировать на картинку, чтобы visualiZe продольную ось бедренной кости. Выберите инструмент измерения и измерения длины бедренной кости.
- Запустите 3D Viewer для создания 3D-визуализации. Отрегулируйте порог, чтобы показать изменения в костной анатомии, связанных с имплантата инфекции.
- Применение отсечения плоскости таким образом, что рендеринг 3D ограничено до нужного поперечного сечения части области, представляющей интерес в дистальной бедренной кости.
- Запустите программный пакет Проанализируйте 11,0. Загрузите * .vox файл, который был использован для создания 3D-рендеринга.
- Запустите Image Calculator инструмент. Используйте инструмент в "области Падь, чтобы обрезать изображение (удалить самолеты, которые не включают бедренную кость).
- Запустите Oblique инструмент разделах. Найти точки, в середине бедра, большого вертела и конце штифта Используйте опцию 3 очка. Сделать эти точки косым срезом и генерировать изображение с новых ломтиками.
- Запустите интересующей области инструмента. Отображение трансаксиальной ломтики. Отрегулируйте минимальное и максимальное значениес для отображения кортикальной кости. Создание контуров для срезов, соответствующих течение нескольких срезов (с приблизительным интервалом в 5 срезов) для срезов, соответствующих дистальных 25% от бедренной кости. Используйте инструмент 'распространяться Регионов для интерполяции между этими контурами и создать 3D область интереса. Сохранить область интереса в качестве объекта карте.
- Запустите 'Примеры Опции' инструмент. Установите флажок для объекта карте, которая была создана и выберите радио-кнопки для соответствующих вариантов. Нажмите кнопку "настроить Журнал Статистика ', чтобы подтвердить, что выбран« Объем Флажок. Нажмите кнопку 'примеры изображений ", чтобы сделать фактические измерения.
- Экспорт измерений объемные в программу анализа данных. Нормализовать внешние объемы кости из более поздние моменты времени до первого отображаемого момент времени по формуле: Δ Volume (%) = ([Объем (день Х) - Объем (2 день)] / [Объем (день 2)]) х 100 .
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой формуле, переменная "X" представляет собой временную точку интереса. Полученный число будет представлять собой изменение размера внешнего объема костной ткани дистальной бедренной кости с течением времени. - Для визуализации 3D область интереса на верхней части кости, загрузить изображение КТ в инструменте 'Объем Визуализация'. Загрузите карту объектов, содержащий 3D область интереса. К «View''Objects» и установить «оригинал», чтобы быть «On». Откройте окно "Предварительный просмотр". Пуск меню 'Render типов и выберите' Object композитинга '.
- Нажмите кнопку «порог» и инструмент и настроить порог, чтобы показать карту кости и объекта. Используйте ту же фиксированную пороговый диапазон для всех временных точках. Нажмите кнопку 'вращения' и установить ориентацию быть истинным переднебоковой вид. Нажмите 'Рендер », чтобы создать финальную визуализацию. Сохраните рендеринг от главного "ТомРендер 'окно.
Representative Results
В естественных условиях Bioluminescent и флуоресцентных изображений
В настоящем исследовании, протокол описывается для этого ранее опубликованной модели ортопедическим протезирования совместной инфекции у мышей 14-19, который предполагает хирургическое размещение титанового K-проволоки имплантата, который простирается от интрамедуллярного канала в бедренной кости в суставе пространство 14-19. С. стафилококк биолюминесцентного штамм Xen29 (1 х 10 3 КОЕ в 2 мкл PBS) пипеткой непосредственно на верхней части имплантата титана конец в коленном суставе до закрытия места операции 16. Для визуализации и количественной оценки бактериальной бремени и притока нейтрофилов неинвазивным под наркозом мышей LysEGFP, все животное оптических изображений в естественных условиях была выполнена для последовательного изображения биолюминесцентный сигналы от бактерий и EGFP флуоресцентные сигналы от проникающих нейтрофилов с использованием ИВИС спектра оптического целое животное в естественныхСистема формирования изображения на трех дней после операции (т.е. дней 2, 14 и 28). Биолюминесцентного сигналы Xen29-инфицированных мышей оставались выше фоновых сигналов ложной инфицированных мышей в течение всего срока эксперимента (рисунок 1А, С) 16. Наша предыдущая работа показала, что в естественных условиях биолюминесцентные сигналы Близкого количество экс естественных КОЕ выделенные из совместного / костной ткани и приверженца для имплантатов 17,18. Кроме того, EGFP флуоресцентные сигналы были выше, чем фиктивные-инфицированных мышей на ранних временных точках, но подошел фоновых уровней в ходе инфекции (фиг.2В, С) 16.
3D со-регистрация в естественных условиях оптических сигналов с μCT изображений
Для визуализации оптических сигналов (т.е., бактериальная биолюминесцентные и EGFP флуоресцентные сигналы) в анатомическом контексте пост-хирургических коленных суставах ян 3D, оптические изображения, создаваемые при помощи системы визуализации IVIS Spectrum были совместно зарегистрированы μCT изображений, полученных с помощью системы визуализации Квантовая FX μCT. Этот со-регистрации может быть достигнуто, поскольку изображения камеры мыши может быть вставлена в любой машине, чтобы гарантировать, что мыши были в том же самом положении. Чтобы проверить эту точность, результаты были сопоставлены с захвата изображений выполняется с помощью Спектр-КТ в естественных условиях системы визуализации ИВИС, которая объединяет оба условия в одном инструменте, не требуя физического переселения животного. Чтобы сопоставить оптические данные на изображениях μCT в 3D, мы использовали диффузный оптической томографии алгоритмом восстановления 16. Полученный 3D-реконструкция показано (Видео 1).
Кроме того, изображения μCT позволило визуализации и количественной оценки соответствующих изменений в качества и размеров кости, которая произошла во времяинфекция (Рисунок 2) 16. Как сообщалось ранее, внешний том кость дистального отдела бедренной кости значительно увеличилось в течение долгого времени (Рисунок 2A) 16. Для количественной оценки этих изменений, 3D объемный анализ изображений проводили на дистальной 25% от опознавательной поверхности бедра и изменения объема костной течением времени были нормализованы до первоначального объема костной ткани. Внешний объем кости значительно увеличилось в зараженных мышей по сравнению с имитацией инфицированных мышей (Рисунок 2B) 16. Увеличение в дистальной бедренной кости наружный объем костной ткани, вероятно, вследствие повреждения кости, вызванного инфекцией совместного ткани и кости, которые наблюдались с помощью μCT изображений и гистологический анализ обработанных 16.
Рис.1 2D в естественных условиях биолюминесцентное и флуоресцентные сигналы. С. стафилококк Xen29 или нет бактерий (неинфицированных) были привиты в коленный сустав после размещения K-провод и мышей LysEGFP были обследованы с использованием системы 16 изображений IVIS Spectrum. (А) Среднее в естественных условиях биолюминесцентные сигналы как измеряется полного потока (фотонов / сек) ± SEM. (B) Среднее в естественных условиях EGFP флуоресцентные сигналы как измеряется общей сияющей эффективности (фотон / сек) / (мкВт / см 2) ± SEM. (C) представителя в естественных условиях Bioluminescent и флуоресцентных сигналов накладывается на черно-белой фотографической Образ мышей. Предел обнаружения бактериальной нагрузки с использованием биолюминесцентного изображений в естественных условиях находится в диапазоне от 1 х 10 2 и 1 х 10 3 КОЕ. * Р <0,05, † р <0,01, ‡ р <0,001 Xen29-инфицированных мышей против ложной инфицированных мышей (Т-тест Стьюдента [два хвостами]). Пожалуйста,обратите внимание, это представитель цифра включает ранее опубликованные данные, полученные с помощью Xen29 и вошедшие с системой 16 изображений IVIS Lumina XR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 3D μCT изображений. Золотистого стафилококка Xen29 или нет бактерий (неинфицированных) инокулировали в коленный сустав после размещения K-проволоки и мышей были обследованы с помощью Quantum FX в естественных условиях системы μCT. (A) Представитель 3D μCT переложения Xen29 -infected мышей (верхние панели) и обман-инфицированных мышей (нижние панели). (B) Процент внешней изменения объема кости (дистальной 25% бедренных костей) нормирована на начальную тимне указать (среднее ± SEM). * Р <0,05, † р <0,01, ‡ р <0,001 Xen29-инфицированных мышей против ложной инфицированных мышей (Т-тест Стьюдента [два хвостами]). Обратите внимание, это представитель цифра включает ранее опубликованные данные, полученные с помощью биолюминесцентного штамм S. стафилококк Xen29 и отображаемого с FX в естественных условиях μCT системы 16 изображений квантовой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1 . Представитель 3D анатомические корегистрацию из биолюминесцентных сигналов Xen29 и EGFP-нейтрофилов флуоресцентных сигналов в сочетании с изображениями μCT. Изображения повернуты на вертикальной оси.
Discussion
Комплексное изображений, такие как методы визуализации, которые используют в естественных оптических изображений в сочетании с изображениями μCT предоставляет новый технологический подход, который позволяет 3D-визуализацию, количественной и продольный мониторинг биологических процессов в анатомической связи 1-4. Протоколы в настоящем исследовании представить подробную информацию о том, как в естественных условиях биолюминесцентное и люминесцентные изображения могут быть объединены с изображениями μCT в ортопедическим протезирования имплантата модели инфекции у мышей контролировать бактериальную нагрузку, нейтрофильный воспаление и анатомических изменений в кости неинвазивным и продольно над Время. Взятые вместе, информация, полученная путем объединения оптических и структурных построений представляет собой крупный технологический прорыв, который может быть особенно хорошо подходит для изучения биологических процессов и патологических состояний, которые влияют на опорно-двигательный аппарат.
Один интересчисле вывод, что следует отметить, это то, что мы наблюдали, что EGFP-нейтрофилов флуоресцентные сигналы снизилась до фонового уровня на 14-21 дней и остался на фоновых уровней в течение всего срока эксперимента, несмотря на присутствие биолюминесцентных бактерий. Маловероятно, что рентгеновское облучение повлияло выживание нейтрофилов, как мы наблюдали подобные кинетики нейтрофилов сигналов в не-облученных мышей 19. В нашей предыдущей работе участием модель S. стафилококк инфицированные раны, инфильтрации нейтрофилов включал сочетание надежной найма нейтрофилов из циркуляции, длительное выживание нейтрофилов в очаге инфекции и хоминге KIT + клеток-предшественников к абсцесса, где они локально привести к зрелых нейтрофилов 23. Вполне вероятно, что аналогичные процессы способствовали инфильтрации нейтрофилов в ортопедической имплантата С. стафилококк инфекция модель. Несмотря на то, что неизвестно, почему сигналы нейтрофилов снизилось в Orthopaedic модель инфекция, это может быть, что иммунный ответ изменились с течением времени, как эта инфекция прогрессировала от острого к хронической инфекции, и это является предметом будущих исследований.
Есть ограничения с этим мыши модели ортопедических протезов совместной инфекции и в естественных условиях комплексном изображений, которые необходимо отметить. Впервые эта модель мыши упрощение реальных процедур и материалов, используемых в ортопедической хирургии в людях 24. Тем не менее, эта модель делает резюмировать хронических инфекций, и последовавшего воспаление в костях и суставах ткани, которая рассматривается в человека ортопедических имплантатов инфекций 8,9. Кроме того, для получения изображения μCT, относительно низкие дозы рентгеновского облучения были использованы для минимизации негативного влияния на здоровье животных в ходе инфекции. Для лучшего разрешения кости, более высокие дозы рентгеновского излучения могут быть использованы для работы с изображениями μCT на эвтаназииnimals. Тем не менее, это устранило бы возможность неинвазивного мониторинга и продольно костные изменения в течение всего срока эксперимента.
В заключение, мультимодальность изображений предполагающей сочетание целого животного оптических изображений в естественных условиях с анатомической визуализации μCT позволило более полную информацию о инфекции и воспалительного ответа. Кроме того, эти методы позволили оценку последствий инфекции и воспаления на костях и суставах ткани. Будущая работа может воспользоваться изображений комплексном чтобы оценить эффективность антимикробной терапии, иммунных реакций, патогенезе болезни и реактивных изменений в кости, как мы начали изучать 14-18. Кроме того, изображения мультимодальность могли оценить зондов и индикаторов, чтобы диагностировать наличие инфекции, как описано ранее в животных моделях бедра инфекция, эндокардит, легочная заразитьионы и биоматериала инфекции 25-28. Наконец, использование изображений комплексном может быть расширена за инфекционными заболеваниями и используется в различных дисциплинах, в том числе ортопедии, ревматологии и онкологии, для расследования других условий, оказывающих воздействие на опорно-двигательный аппарат, таких как скелетные рака, метастазов, переломов и артрита 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, КПФ выплачиваются сотрудникам PerkinElmer, которая производит самые изображений инструментов, при условии, что Xen29 биолюминесцентного С. штамм стафилококка, и оплатил расходы по публикации этой видео-статье. Остальные авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Хирургическое Resident исследовательской программы Ученые H & H Lee (до января), АО Фонд Start-Up грант S-12-03M (в LSM) и Национальные институты здравоохранения гранта R01-AI078910 (к LSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
