Summary
מאמר זה מספק פרוטוקול להפקת ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי כדי 1) לנהל אפיון proteomic, 2) ביטוי ארס גן הבלוטה לעורר, ו- 3) לבצע מחקרים תפקודיים של ארס. זה ואחריו תיאור של microdissections בלוטת ארס ללימודי ביטוי גנים.
Abstract
ארס הם כימי הפרשות מורכבות בדרך כלל כוללות מספר רב של חלבונים ופפטידים עם פעילויות פיסיולוגיות מגוונות. אפיון פונקציונלי של חלבוני ארס יש יישומים ביו-רפואיים חשובים, לרבות זיהוי המקורות תרופתיים או בדיקות לקולטניות תאים. עכבישים הם clade העשיר ביותר המינים של יצורים ארסיים, אבל הארס של רק כמה מינים הם הבינו היטב, בין שאר בשל הקושי כרוך באיסוף כמויות זעירות של רעל מבעלי חיים קטנים. מאמר זה מציג פרוטוקול לאוסף של ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי, הממחיש את ההליך על האלמנה השחורה המערבית (אלמנה השחורה). הארס שנאסף שימושי לניתוח במורד הזרם מגוון הכוללים זיהוי ישיר של חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה, מבחני תפקודיים, וגירוי של ביטוי גני ארס ללימודי transcriptomic. טכניקה זו יש יתרון על פני פרוטוקולים שISOארס מאוחר מhomogenates בלוטה כולה, שאינו להפריד רכיבי ארס אמיתיים מחלבונים תאיים שאינם מופרשים כחלק מהארס. נציג תוצאות מדגימות את זיהוי של פפטידים ארס ידועים מהמדגם שנאסף באמצעות ספקטרומטר מסה. הליך גביית הארס ואחריו פרוטוקול לביתור בלוטות ארס עכביש, עם תוצאות מראות שזה מוביל לאפיון חלבונים הביעו ארס ופפטידים ברמת הרצף.
Introduction
ארס הוא הפרשות בעלי חיים בעיקר הוזרקה לחיה אחרת למטרות טריפה או הגנה, וגם יישומים ביולוגיים חשובים עם הרלוונטיות ביו-רפואיות 1-3. רק בעלי חיים מסוימים לסנתז ארס, אבל הייצור שלה הוא טקסונומית נרחב על פני חסרי חוליות (לדוגמא, צורבים, חלזונות חרוט, עקרבים, עכבישים ו) ובעלי חוליות (לדוגמא, נחשים, דגים ויונקים), משום שהיא התפתחה באופן עצמאי מספר פעמים 1,4 . האפיון ביוכימי של ארס בדרך כלל להראות שהם מורכבים ממגוון רחב של חלבונים ופפטידים, הפועלים במידה רבה על מערכות דם ועצבים של בעלי חיים הזריקו כדי לספק במהירות רעלים המרכיבים 1. חלק קטן מבעלי החיים ארסיים עלול להוות איום על בני האדם, מינים במיוחד עם הפצות בקרבת האדם 5. המחקר של הרכב ארס ופעילויות פונקציונליות שיחק תפקיד חשוב בהאפיון הפונקציונלי של רכיבי חוליות סלולריים (במיוחד תעלות יונים עצביות) 6 והבהרת תהליכים בסיסיים סלולריים (לדוגמא neurosecretion) 7. יתר על כן, יש לי פפטידים ארס בחרו תכונות שימושיות בהקשרים ביו-רפואיים, הכוללים את השימושים שלהם כטיפול בסרטן וכאב 8,9, והם ממוקש למקורות תרופתיים מועמד ופיתוח חומר. ארס גם לשחק תפקיד מרכזי במחקר אקולוגי והאבולוציוני 1,4,10,11, ובכך האוסף של הפרשות מסוכנות אלה יש כלי עזר רבים.
יש> 40,000 מינים מתוארים של עכביש (להזמין Araneae), וכל אבל אחת משפחות העכביש יותר מ -100 להחזיק לזווג בלוטות ארס המסתיימות בניבים 12. מגוון המינים הגבוה של עכבישים עולה כי הם מייצגים את clade הגדול ביותר של יצורים ארסיים. עם זאת, אפיון ביוכימי של ארס של עכביש יש lמרוכז argely על מספר קטן של מינים לרוב משויכים envenomation האנושי. מחקרי proteomic וtranscriptomic האחרונים של ארס של עכביש לציין שהם בדרך כלל מכילים הרבה חלבונים ופפטידים 2,13,14 ייחודיים. התקדמות ברצף cDNA תפוקה גבוהה וטביעת אצבעות פפטיד ספקטרומטר המסה יש להקל באופן משמעותי את הגילוי של חלבוני ארס אלה 15. עם זאת, עבודה כזו מתחילה עם האוסף של ארס מספיק ו / או בלוטות ארס העכבישים, ותיעוד מפורט עבור טכניקות כגון מעט 16.
מאמר זה מציג פרוטוקול לאוסף של ארס ורעל בלוטות מעכבישי אלמנה שחורים, אשר יכול להיות מיושם על עכבישים בגודל דומה. האוסף של ארס בנפרד מהבלוטות מאפשר זיהוי של חלבונים שמופרשים לתוך הארס בניגוד לחלבונים מבצעים תפקידים סלולריים אחרים. אלמנות שחורות וL אחרמיני atrodectus מוכרים לציבור רחב כבקרב העכבישים המסוכנים ביותר בשל הארס שלהם הרעיל ביותר, אשר גורם לכאב עז בבני אדם, שלעתים מלווה בזעה מרובה, התכווצויות שרירים, יתר לחץ דם, קשיי נשימה ושיתוק בלתי סדיר 5. פרוטוקול אוסף הארס מוצג כאן משתמש אלקטרו-גירוי כדי לספק זרם חשמלי לעכבישים בהרדמה כדי לעורר התכווצויות ושחרורו של ארס שרירי. טיפות ארס נאספות במהירות עם מיקרו-נימים ולוותר לתוך צינורות לאחסון במקפיא. כי הפרוטוקול כרוך נהלים מסוכנים, זה צריך להתבצע רק על ידי אנשים מאומנים היטב וזהירות היא דחקה בשלבים עיקריים. יש הארס שנאסף רבים שימושים, כגון אפיון ובידוד של מולקולות המרכיבות את 2, לניסויים פיסיולוגיים או מבחני תפקודיים 18, וכדי לעורר ביטוי גני ארס 11. הפרוטוקול מסתיים בdescription של נתיחת בלוטת ארס ושימור שימושי לשיבוט של גני ארס ספציפי, הביטוי שהוכח להתרחש 2-3 ימים הבאים דלדול ארס בעכבישים שונים 10,11.
Protocol
1. הכנת מכשירי אלקטרו-ממריץ
- חבר כבל חשמל אלקטרו-ממריץ לשקעים ולצרף דוושת רגל חיצונית לכניסת האות החיצונית.
הערה: חוטי חשמל חייבים להיות מבודדים כראוי ונוכחיים מספקים נחשפה מתכת לא צריך לגעת בם. ללבוש כפפות גומי או nitrile להגנה. מתג הפעלת אלקטרו-ממריץ צריכה להיות במצב OFF בעת צירוף כבל חשמל וחיבור חוטים. - חבר האלקטרודה חיובית למסוף פלט אדום על אלקטרו-ממריץ (כאשר בורר קוטביות הוא במצב רגיל) ולחבר את האלקטרודה השלילית למסוף הפלט השחור. הערה: כל חוט האלקטרודה צריך לסיים בקליפ תנין.
- ממריץ נקבע ההגדרות הראשוניות המומלצים הבאות: מתח = 7 V, תדר = 1 פעימות בשנייה, עיכוב = 0 אלפיות שנייה, משך = 200 אלפיות שנייה, קטניות תאום לעבור = רגילות, ומתג מצב = off.
- פלט בדיקה של אלקטרודות על ידי הצמדת קליפים תנין לvoltmeחוטי בדיקה חיוביים ושליליים ter. הפעל מתג הפעלת ממריץ ולספק נוכחי עם דוושת רגל.
2. הכנת מלקחיים משתקים וחומרים אחרים
- טובלים שן אחת של מלקחיים במשקל נוצה לציפוי פלסטיק נוזלי ולחכות ארבע שעות כדי לאפשר יבש ציפוי. בחוזקה לעטוף 15 מ"מ של הקצה של שיניים היריבים עם שכבה אחת של חוט תפירה מכותנה, ולאבטח את החוט על ידי קשירת הסוף בקשר.
הערה: החוט משמש לקליטת תמיסת מלח מיושם שמקדמת מוליכות חשמליות, ואילו ציפוי הפלסטיק מספק בידוד לעכב נוכחי. - חותך קצה מחט מזרק בוטה במספריים חדים וחלק הפתיחה עם נייר חול. צרף את המחט למלכודת פסולת ואקום (למשל, בקבוק של מסנן אבק) דרך צינורות.
הערה: המחט לשאוב ממנו המים ולהקיא, ותשמש כדי להשלים את המעגל שנוצר על ידי אלקטרודות ממריץ. Mu פתיחת המחטרח 'להיות קטן מספיק כדי לא לפגוע בעכביש, עדיין גדול מספיק כדי פתרון ואקום מבלי לסתום (לדוגמא, 25 G x 1 ½ במד, ראה חומרי רשימה). - מלקחיים במשקל נוצת עמדה אופקיים בעמדה סגורה היטב באמצעות מהדק בשני ראשים מכוסים ויניל מאובטח לבסיס מגנטי או מכשירי עמדה קבועים תחת השדה של מיקרוסקופ לנתח מבט, עם שיניים מצופים פלסטיק של מלקחיים על גבי חוט ומצופה שיניים בתחתית.
הערה: מהדק שני הראשים נשמר במצב נייח לבסיס המגנטי על ידי בעל מהדק (ראה חומרי רשימה). גומייה עשויה להיות מאובטחת בצורה הדוקה סביב שיניים של מלקחיים במשקל הנוצה, בסמוך לבעל המהדק, להוסיף לחץ נוסף כדי לשמור על המלקחיים במשקל הנוצה במצב סגור סביב העכביש הציג פעם אחת. - צרף קליפ תנין האלקטרודה החיובי לשיניים התחתונה 'המלקחיים במעלה הזרם של חוט ולצרף קליפ תנין השלילי כדי להקהות מחט ואקום מתכת. מעגל הבדיקה נוכחי עם מד מתח על ידי הצבת להוביל חיובי על שיני מלקחיים בין החוט וקליפ תנין והצבה להוביל שלילי על מחט ואקום בוטה. לחץ דוושת רגל כדי להבטיח הנוכחי מספיק מזוהה ולהסיר הפניות אם נוכחי מספיק מזוהה.
- להכין כמה צינורות microcapillary לאוסף ארס. החזק צינור microcapillary אחת בקצה אחד עם יד עטויה בכפפה ובקצה השני עם מלקחיים מתכת סטרילי, הצבת הקצה התקיים מלקחיים אופקיים מעל להבת מבער בונזן. משוך את microcapillary עם המלקחיים מתכת מהלהבה כדי ליצור קצה מוארך, תוך החזקת הקצה השני במצב נייח.
הערה: ללבוש משקפי מגן כmicrocapillaries יכול בקלות שבר. - לנוח microcapillaries מוכן על רצועת מרק הרכבה בצלחת פטרי. לבחון microcapillary מסתיים תחת מיקרוסקופ לנתח וליצור פתח קטן, משופע בסוף משך עם מלקחיים מתכת מעוקרים.
- Laמספר משתנה bel של צינורות 0.5 מיליליטר סטרילי. מוסיף מים סטריליים, ללא יונים לסטרילי צינורות (לדוגמא, 5 μl מים ללא יונים autoclaved). צינורות סגורים וצינורות מניחים על קרח.
- הכן תמיסת מלח בכוס ולמלא כוס שנייה עם מים autoclaved.
3. קיבוע של עכביש במלקחיים
- הפעל CO 2 טנק ולהעביר עכביש מבקבוקון פלסטיק איסוף סגור (ראה חומרי רשימה) ל- CO 2 קאמרי באמצעות מלקחיים מתכת ארוכים.
שים לב: יש לי עכבישים אלמנה שחורים ארס מסוכן; תמיד ללבוש כפפות במהלך פרוטוקול זה. - שמור עכביש בחדר למשך 5-10 דקות או עד שהרדים וכבר לא נע אחרי שדחק בעדינות עם מלקחיים ארוכים. השתמש פיפטה ההעברה להרטיב חוט במלקחיים עם תמיסת מלח.
הערה: לקבלת הנחיות בנוגע CO 2 פרמטרים הרדמה לאלמנות שחורות, מתייחס לSpagna ומור 19. - אחזר עכביש מורדם מCO 2תא על ידי להרים אותו על ידי הרגליים הקדמית שלה באמצעות מלקחיים לנתח בוטים וידיים בכפפות. הזז עכביש מורדם למשקל נוצה מנגנון מלקחיים. שיניים נפרדות של מלקחיים במשקל נוצה סגורים ומניחים cephalothorax העכביש בין השיניים ולאפשר השיניים כדי לסגור עצומות כדי להבטיח עכביש מוחזק בחוזקה במקום אך לא נמחץ. ודא שהעכביש ממוקם צד dorsum השריון כלפי מטה (ראה Foelix 20 למדריך לאנטומיה עכביש), מונח על שיני חוט מצופה, והצד הגחוני של השריון מול ציפוי הפלסטיק, ואילו האלקטרודה החיובית נשארה מחוברת לשיניים תחתונה. עבודה במהירות בעת טיפול בעכביש.
- התאם לנתח הגדלת מיקרוסקופ, מיקוד, ומקור אור עד chelicerae של העכביש והניבים גלויים לעין.
4. ארס אוסף
- הפעל ואקום ולרסס chelicerae עכביש עם פתרון מים באמצעות מזרק n קהה שקצה שניeedle. יניקה משם מים עם מחט ואקום כדי להסיר זיהומים.
- גע במחט הוואקום עם האלקטרודה שלילית מצורף לדוכן עכביש ולספק דופק עם זמני דוושת רגל אחת או יותר. אבק משם להקיא במידת צורך.
הערה: דוכן עכביש הוא בתוך פה אחורי לchelicerae על פני השטח הגבי בין chelicerae וendites (ראה Foelix 20 לאנטומיה עכביש מפורטת). הערה: עם כל דופק, חוזו של עכביש רגליים, וארס יהיה גלויים כמו טיפות ברורות העולות מניבים. - לאסוף ארס טיפין עם קצה microcapillary וקצה נימי העברה ל0.5 צינור מיליליטר עם פתרון מים או חיץ (פתרון יהיה נשאב לתוך נימים).
הערה: למנוע ניקוב עכביש עם נימים שעלולות להוביל לזיהום hemolymph ומוות. כמו כן למנוע זיהום של נימים עם משי ודבק מspinnerets. - צרף מזרק העברה עם מתאם צינור לmicrocapillary (בהפך מקצה לקצה אוסף) ודפתרון ארס ispense בחזרה לתוך צינור. שים צינור על קרח.
הערה: השלך נימי פסולת במכל חד סמוך. - הנח בקבוקון פלסטיק איסוף פתוח, יחד עם הכובע שלה, קרוב לעכביש. לתפוס בזהירות את הרגליים של העכביש עם מלקחיים לנתח בוטים החזיקו ביד אחת ומשקל נוצה בזהירות פתוחה מלקחי שיניים עם יד השנייה, הזזה עכביש לאיסוף בקבוקון עם מלקחיים בוטים ולסגור במהירות את כובע. המשך עם צינורות המכיל ארס העכביש והחנות הבאים במקפיא -80 מעלות צלזיוס כאשר סיים.
הערה: ימשיך לנקוט בזהירות בעת העברת העכביש מהמלקחיים בחזרה לתוך הבקבוקון. ודא בקבוקון האיסוף והכובע נמצא בקרבת מקום לעכביש להעברה המהירה שלה וללבוש כפפות.
5. ארס בלוטת וניתוחים
- שני לשלושה ימים לאחר איסוף ארס, להרדים עכביש בCO 2 תא (ראה שלב 3.1). מלא ספק חנקן נוזלי ומקום הבא למיקרוסקופ לנתח.
הערה: ש"שen עבודה עם חנקן נוזלי, הגנה על העין שימוש וכפפות קריוגני. - אזור נקי לנתיחה ומלקחיים לנתח עם פתרון זה מבטל זיהום RNase ו- DNA. למלא צלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ לנתח עם לנתח חיץ (חיץ למשל, ציטראט מלוח-נתרן 1x (SSC)).
- העברת עכביש מCO 2 תא לצלחת הפטר ולהשתמש במלקחיים כדי להפריד במהירות את cephalothorax מהבטן.
- החזק את cephalothorax תחת מיקרוסקופ לנתח עם מלקחיים ומקם את chelicerae לשדה הראייה. השתמש בקצוות החדים של זוג שני של מלקחיים לחתוך ציפורן הצטרפות השריון להיבטים הרוחביים של chelicerae. רוחבי לתפוס chelicerae באמצעות הזוג השני של מלקחיים, ובעדינות למשוך קדימה ואחורה עד שבלוטות ארס הם הוציאו.
- בלוטות נפרדות מchelicerae (או להשאיר מצורף לchelicerae אם רוצה) ולהעביר צינור 0.5 מיליליטר cyrosafe. Clos מקוםצינור ed בחנקן נוזלי.
הערה: כל נתיחה צריכה לקחת לא יותר מ -15 דקות. - חזור לנתיחה עם עכבישים נוספים עד לסיום. העברת צינורות מחנקן נוזלי לתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס.
Representative Results
האוסף של ניתוחי ארס ובלוטת ארס לעתים קרובות מבוצע לאפיין חלבוני ארס ופפטידים ברמת הרצף 10,11,15. גם ארס נאסף עשוי לשמש במבחנים פיסיולוגיים כדי לקבוע הפעילויות פונקציונליות שלהם 18. האוסף של ארס יעודד ביטוי ארס גן הבלוטה, ובכך להקל על השיבוט של תמלילי רעלן ספציפיים באמצעות RT-PCR 10,11. זיהוי של חלבוני ארס גם יכול להיות מושלם באופן תפוקה גבוהה על ידי שילוב שיטות של ספקטרומטריית מסה סטנדרטית עם מסדי נתונים רצף שנוצרו מספריות cDNA בלוטת ארס 15,21. דוגמא לעבודה כזו, החל מארס והבלוטות שנאספו באמצעות הפרוטוקול המפורט לעיל, מדגימה את האפקטיביות שלה, באה לידי ביטוי באיור 1.
ארס שנאסף מL. נשים בוגרות Hesperus היו מתעכל עם טריפסין ונתונים לפתרוןניתוח MuDPIT, המקשר HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים) לספקטרומטר מסת טנדם (MS / MS). הנה ניתוח MuDPIT בוצע על ידי אוניברסיטת אריזונה פרוטאומיקה Consortium. המוני הפפטידים שזוהו ושברים ניתקו (יונים בתו, המשתמעים מספקטרום) הושוו לרצפי פפטיד נחזו באופן תיאורטי מתרגומים של רצפי cDNA שהתקבלו מספריית ביטוי גנים שנבנתה מL. בלוטות ארס Hesperus (בלוטות נרכשו על ידי הפרוטוקול לנתיחה שתוארו לעיל) 21. בניסוי זה, 36 חלבונים אותרו מכל הספקטרום שנאסף, על סף הסתברות 99.9%, והכילו לפחות אחת זוהה פפטיד. אחד החלבונים שזוהו נתמך על ידי 43 ספקטרום כולל (ספקטרום מופת שמוצג באיור 1 א), מקביל לשלושה פפטידים בלעדיים, המכסה 35% מרצף החלבון (איור 1). החלבון המזוהה (בתרגום מcollecte יש ד cDNA) להיט BLASTp עליון לlatrodectin מL. tredecimguttatus (GenBank הצטרפות P49125.1), עם דואר ציון של 2E-46, ומניות זהות 80% ברמת רצף חומצות אמינו עם החלבון שהתגלה בניסוי הזה. Latrodectin, אשר ידוע גם בשם חלבון מולקולרי נמוך אלפא-latrotoxin משקל, הוא רכיב ארס מוכר של אלמנה שחורה עכבישי 22, 23, המאמת את היעילות של הפרוטוקול שהוצג. כמה חלבונים זוהו מהארס מתאים לרצפים שלגביהם לא להיט פיצוץ הוא מצא. לא ברור אם זו תהיה תוצאה, בשל המשאבים מוגבלים הגנומי הזמינים לעכבישים, כמו גם המידע הפונקציונלי המוגבל לחלבונים שלהם, או בגלל שהחלבון ידוע מייצג מזהם ארס. עם זאת, גן או ביטוי חלבון מנתח בוחן את השפע של חלבון כגון רומן בבלוטות ארס ביחס לרקמות אחרות צריכים לגלות אם זה הוא מרכיב שנאה אמיתי.
אף אוזן גרון "fo: לשמור על-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 1: פפטיד Latrodectin זיהה מארס אלמנה שחור באמצעות ספקטרומטר מסה () ספקטרום נציג (אחד 43) זוהה באמצעות חלק MS / MS ניתוח MuDPIT של ל '. Hesperus ארס שיועד לתרגום חזוי של רצף cDNA שנאסף מוצג בחלק ב 'ספקטרה תערוכות המוניות לחייב יחס (m / z) של יוני בת זוהו על הציר האופקי המיוצר על ידי פיצול פפטיד ההורה (CGEEDFGEEIVK), עם אותיות בראש המציין את רצף הפפטיד המבוסס על המוני יון בת. (ב) רצף החלבון שאליו ספקטרום בחלק שהוקצה, מראה בצבע אדום, נועז וטקסט בקו תחתון את הרצף המקביל מהספקטרום שמוצג בחלק, טקסט אדום נוסף (לא מודגש) מייצג פפטיד אחר בחלבון זה זוהה עם sp שנאסף אחרectra. רצף החלבון מתורגם מרצף cDNA שהתקבל מבלוטות ארס גזורים.
Discussion
ארס מהווה מקור חשוב של חלבונים מבחינה פיזיולוגית תגובה, פפטידים ומולקולות אחרות בבקשות לגילוי תרופות, כמו גם להיבטים בסיסיים של מחקר סלולארי ואקולוגי 1-3. עם זאת, האוסף של ארס, במיוחד מבעלי חיים מסוכנים או קטנים, היא משימה מאתגרת. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן לאסוף בלוטות ארס ורעל מעכבישי אלמנה שחורות, ומאשר את ההצלחה של גישה זו באמצעות שילוב של ניתוח MuDPIT של הארס ומסד נתוני חלבון נגזרים מcDNAs המשובטים מארס בלוטות 21. בעוד פרוטוקול זה עובד היטב עבור אלמנות שחורות ועכבישים בגודל בינוניים, טכניקות אוסף ארס אחרות הייתם מועסקות במשך mygalomorph גדול עכבישים (כמו טרנטולה-), כגון שאיפה ישירה של ארס מניבים לתוך כוס טפטפות לדוגמא, 24. גישה זו אחרונה, עם זאת , לא יעבוד היטב עבור עכבישים קטנים יותר בגודל שאינם aggressive.
היבט אחד קריטי במיוחד של פרוטוקול אוסף ארס המתואר כאן הוא בשלבים הראשונים של הכנה ואופטימיזציה של תהליך האיסוף, כך שהוא הופך להיות יותר שיגרתי, עקבי ומהיר יותר. הפרוטוקול הוא בהתחלה מאתגר להורים, אבל עם ניסויים חוזרים ונשנים, הוא הופך להיות קל יותר ומהיר יותר. זהירות גם דחקה בו בכל השלבים הקריטיים מעורבים בטיפול בעכבישים מסוכנים, השימוש בזרם חשמלי, מיקרו נימי זכוכית עדין נקודה, ומחטים מזרק. חשוב ללבוש ציוד מגן אישי מתאים כגון כפפות nitrile, חלוק מעבדה, מכנסיים ארוכים ונעליים סגורות, כמו גם משקפי שמש, כאשר עיצוב נימי מיקרו.
עוד היבט מאתגר לאוסף ארס הוא הכמות הקטנה של ארס מיוצרת על ידי כל עכביש אחד, במיוחד מינים אלמנו, שממנה הסכומים שגבו יכול להיות ליmited ל1-2 מיקרוליטר לנפש, במקרה הטוב. קבלת ארס מספיק עבור יישומים במורד הזרם, כגון ג'לים חלבון או מבחני תפקודיים עשויה לדרוש שילוב של ארס מאנשים מרובים לתוך צינור אחד. במקרים כאלה, ארס צריך להיות משולב רק מאנשים מאותו המין, השלב האונטוגנטי, ואוכלוסייה נתון הכרה בשונות intersexual, התפתחותי וגיאוגרפיות בחלק הארס 25, 26. עכבישים יכולים גם להפגין הבדלים ניכרים בכמות הארס שהופקה בין אנשים, שבו כמויות פחותות עשויות לשקף הדלדול האחרון של הבלוטה. כך זה עשוי להיות כדאי לאסוף כמה ימי ארס לאחר ההאכלה האחרונה שלהם. אם ארס קטן משתחרר, נוכחי מוגזם לא צריך להחיל את העכביש, שעלולה לגרום לציפורן להתפקע, יגרום לזיהום של הארס עם hemolymph או מוות.
זיהום של דגימות ארס עם si העכבישיש להימנע גם ממקורות LK או אדם באמצעות השימוש בציוד סטרילי או נקי. למרות האתגרים הללו, אוסף של ארס טהור, שעזב את העכביש בחיים, עדיף על שיטות שלקבל ארס מhomogenates בלוטה (שאינו להפריד רכיבי ארס מחלבונים תאיים אחרים) ולהרוג את העכביש. כמו כן, חשוב להבטיח כי דגימות מוקפאות במהירות כדי למנוע פירוק חלבונים.
הפקת הארס מקדמת ייצור ארס שלאחר מכן, ובכך מגרה ביטוי גני ארס בבלוטת הארס. כמה ימים כך, מכיוון שפרוטוקול זה מאפשר לעכבישים כדי לשרוד דלדול ארס, עלולות להיות גזורים הבלוטות שלהם מאוחר יותר (הריגת העכביש) בנקודה שבה ביטוי גני הארס צפוי להיות מספיק למחקרים גנטיים, כגון תמליל שיבוט 10,11. כמה אמצעי זהירות חשובות גם יש לקחת בניתוחי בלוטת ארס. יש לשים דגש על שימוש במעבדת מכשירים וציודאף אוזן גרון וריאגנטים כי הם ללא RNases שלו פוגע בRNA. כך מומלץ לנגב מלקחיים וציוד שאינו חד פעמי אחר ומשטחים עם פתרונות שלחסל זיהום RNase ו- DNA. הניתוחים צריכים להתבצע במהירות אפשרית ובאופן ישיר הקפוא כדי להבטיח את שלמות RNA של הרקמות נוספות. לבסוף, יש לבצע ניתוחים רק על עכבישים מורדמים, לאחר cephalothorax והבטן שלהם מופרדים במהירות.
לסיכום, מאמר זה מספק פרוטוקול מאומת להשיג בלוטות ארס עכביש וארס. בלוטות ארס והרעל לאפשר לבידוד והאפיון של מרכיבי החלבון ופפטיד תוך שימוש בגישות proteomic וtranscriptomic. בנוסף, דגימות ארס יכולות לייצג את הנקודה של מבחני תפקודיים, הקובעים את הפוטנציאל ביו-רפואי והתרופתי של מולקולות המרכיבות אותן מתחילה. כמעט כל העכבישים מייצרים ארס, והצוללן הרחבעיר עתיקה של רכיבי ארס מסונתזים על ידי מינים בודדים מציעה מגוון עצום של מולקולות ארס הם עדיין לא גילו 13. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מספק כלים כדי לחקור את המקור העשיר של מולקולות פעילות ביולוגית קיימים בארס עכביש.
Disclosures
המחבר יש מה למסור ולא אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אני מודה לאנשים הבאים על עזרת בפיתוח של פרוטוקול זה: צ'אק Kristensen, גרטה Binford, אלכס ק 'לנקסטר, קונרד Zinsmaier, ומייז עימאד. נתונים ספקטרומטריית ופרוטאומיקה המוניות נרכשו על ידי פרוטאומיקה Consortium אריזונה נתמכת על ידי ES06694 מענק NIEHS לSWEHSC, CA023074 מענק NIH / NCI לAZCC ועל ידי מכון BIO5 מאוניברסיטת אריזונה. מימון עבור עבודה זו סופק מהמכון הלאומי לבריאות (המכון הלאומי לרפואה כללית) ממענקים 1F32GM83661-01 ו1R15GM097714-01 לג'סיקה א גארב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305127 | |
| Vacuum filter flask 1 L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Joann fabric and craft store | 7245855 | similar product could be substituted |
References
- Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
- Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).
- Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).
- Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).
- Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
- Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).
- Silva, J. -P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).
- Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).
- Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).
- Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).
- Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).
- Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html (2013).
- Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).
- King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).
- Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).
- Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).
- Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).
- Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).
- Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).
- Foelix, R. Biology of Spiders. , Oxford University Press. (2010).
- Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366 (2014).
- Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).
- Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
- Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
- Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
- Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).
