Summary
وتنص هذه المادة على بروتوكول لاستخراج السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي ل1) إجراء توصيف بروتيوميك، 2) تنشيط غدة السم التعبير الجيني، و3) إجراء دراسات وظيفية من السموم. ويلي ذلك وصف لmicrodissections غدة السم للدراسات التعبير الجيني.
Abstract
السموم هي كيميائيا إفرازات معقدة تتألف عادة العديد من البروتينات والببتيدات مع الأنشطة الفسيولوجية المختلفة. التوصيف الوظيفي للبروتينات السم له التطبيقات الطبية الحيوية الهامة، بما في ذلك تحديد من الخيوط المخدرات أو تحقيقات لمستقبلات الخلوية. العناكب هي معظم الأنواع كليد غنية من الكائنات الحية السامة، ولكن من السموم فقط عدد قليل من الأنواع وفهمها جيدا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة المرتبطة بجمع كميات ضئيلة من السم من الحيوانات الصغيرة. تعرض هذه الورقة على بروتوكول لجمع السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي، مما يدل على الإجراء على الأرملة السوداء الغربية (كوكب الزهرة الزوع). السم جمعت مفيد للتحليلات المصب متنوعة بما في ذلك التعرف المباشر البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي، المقايسات الفنية، وتحفيز التعبير الجيني السم للدراسات transcriptomic. هذا الأسلوب له ميزة على البروتوكولات التي ISOأواخر السم من الخليط الغدة بأكملها، والتي لا تفصل مكونات السم حقيقية من البروتينات الخلوية التي لا تفرز كجزء من السم. وتظهر نتائج ممثلة الكشف عن الببتيدات السم المعروف من العينة التي تم جمعها باستخدام مطياف الكتلة. ويعقب عملية جمع السم بأي بروتوكول لتشريح الغدد سم العنكبوت، وكانت النتائج تدل على أن هذا يؤدي إلى توصيف البروتينات والببتيدات وأعرب السم على مستوى التسلسل.
Introduction
السموم هي إفرازات الحيوانات المحقونة في الغالب إلى حيوان آخر لأغراض الدفاع أو الافتراس، ولها أيضا تطبيقات البيولوجية الهامة ذات الأهمية الطبية الحيوية 1-3. فقط بعض الحيوانات تركب السم، ولكن إنتاجها على نطاق واسع في جميع أنحاء تصنيفيا اللافقاريات (مثل الكائنات المجوفة والقواقع المخروطية والعقارب، والعناكب) والفقاريات (مثل الثعابين، وبعض الأسماك والثدييات)، لأنها تطورت بشكل مستقل عدة مرات 1،4 . توصيف الكيمياء الحيوية من السموم عادة ما تظهر أنها تتألف من مجموعة واسعة من البروتينات والببتيدات، والتي تعمل بشكل كبير على الدورة الدموية والجهاز العصبي للحيوانات المحقونة لتسليم بسرعة السموم المكونة 1. وهناك نسبة ضئيلة من الحيوانات السامة قد تشكل خطرا على البشر، وخاصة الأنواع ذات التوزيعات synanthropic 5. وقد لعبت دراسة تكوين السم والأنشطة الوظيفية دورا هاما فيتوصيف وظيفي لمكونات الخلية الفقارية (خاصة القنوات الأيونية العصبية) 6 و في توضيح العمليات الخلوية الأساسية (مثل إفراز عصبي) 7. وعلاوة على ذلك، حدد الببتيدات السم لها خصائص مفيدة في سياقات الطبية الحيوية، بما في ذلك استخداماتها انها علاج لمرض السرطان وآلام 8،9، والملغومة ليؤدي المخدرات مرشح والتنمية للسم. السموم أيضا أن تلعب أدوارا بارزة في مجال البحوث البيئية والتطورية 1،4،10،11، وبالتالي جمع هذه الإفرازات الخطرة والعديد من المرافق العامة.
هناك> 40،000 الأنواع وصف العنكبوت (أمر الرتيلاوات)، ولكن كل واحدة من الأسر العنكبوت أكثر من 100 يقترن تمتلك غدد السم التي تنتهي في 12 الأنياب. تنوع الأنواع عالية من العناكب يوحي بأنها تمثل أكبر كليد من الكائنات السامة. ومع ذلك، وتوصيف الكيمياء الحيوية للسموم العنكبوت لديه لتتركز argely على عدد قليل من الأنواع في أغلب الأحيان المرتبطة التأثر بزعاف الحشرات البشري. دراسات البروتين وtranscriptomic الأخيرة من سموم العنكبوت تشير إلى أنها تحتوي عادة على العديد من البروتينات والببتيدات 2،13،14 فريدة من نوعها. التقدم في الإنتاجية العالية التسلسل [كدنا] وقياس الطيف الكتلي الببتيد البصمات قد سهلت كثيرا من اكتشاف هذه البروتينات 15 سم. ومع ذلك، يبدأ هذا العمل في جمع ما يكفي من السم و / أو غدد السم من العناكب، وثائق مفصلة عن هذه التقنيات هي قليلة (16).
تعرض هذه الورقة على بروتوكول لجمع السم والغدد السم من العناكب الأرملة السوداء، التي يمكن تطبيقها على العناكب ذات الحجم المماثل. جمع السم بشكل منفصل من الغدد يمكن تحديد البروتينات التي تفرز في السم بدلا من البروتينات أداء الوظائف الخلوية الأخرى. الأرامل السود وغيرهم Lيتم التعرف على الأنواع atrodectus على نطاق واسع على أنها من بين أخطر العناكب بسبب السم أعصاب عالية، والذي يسبب آلاما شديدة في البشر، والذي يترافق أحيانا التعرق الغزير، تقلصات العضلات، ارتفاع ضغط الدم، وصعوبة في التنفس وشلل غير مكتمل 5. بروتوكول جمع السم المقدمة هنا يستخدم التحفيز الكهربائي لتوصيل التيار الكهربائي إلى العناكب تخدير للحصول تقلصات العضلات والافراج عن السم. وتجمع قطرات السم بسرعة مع الشعيرات الدموية الصغيرة والاستغناء في أنابيب لتخزين الفريزر. لأن البروتوكول يتضمن إجراءات الخطرة، يجب فقط أن يتم تنفيذ ذلك من قبل الأفراد المدربين تدريبا جيدا وحثت الحذر في الخطوات الرئيسية. السم جمعت له العديد من الاستخدامات، مثل توصيف وعزل الجزيئات المكونة 2، لإجراء التجارب الفسيولوجية أو المقايسات الفنية 18، وإلى تحفيز التعبير الجيني 11 سم. ويخلص بروتوكول مع description من تشريح غدة السم والحفاظ مفيد لاستنساخ الجينات السم محددة، والتعبير عن التي ثبت حدوثها 2-3 أيام بعد نضوب سم العناكب في مختلف 10،11.
Protocol
1. إعداد أجهزة الكهربائية ومشجعا
- ربط الكهربائي مشجعا سلك الطاقة إلى منفذ وتعلق دواسة القدم خارجية لإدخال إشارة خارجية.
ملاحظة: الأسلاك الكهربائية يجب أن تكون معزولة بشكل صحيح ويجب عدم لمس المعدن يتعرض إيصال التيار. ارتداء قفازات اللاتكس أو النتريل للحماية. وينبغي أن يكون مشجعا الكهربائية مفتاح الطاقة في موقف OFF عندما ربط سلك الكهرباء وربط الأسلاك. - توصيل القطب الموجب لالحمراء محطة الانتاج الكهربائية ومشجعا على (عند التبديل الاستقطاب هو في الوضع العادي) وتوصيل القطب السالب إلى محطة الانتاج السوداء. ملاحظة: كل سلك كهربائي يجب أن ينتهي في مقطع التمساح.
- وضع مشجعا إلى الإعدادات الأولية الموصى بها التالية: الجهد = 7 V، تردد = 1 نبضات في الثانية الواحدة، تأخير = 0 مللي ثانية، والمدة = 200 ميلي ثانية، والبقول التوأم = التبديل العادية، ومفتاح الوضع = إيقاف.
- اختبار الانتاج من الأقطاب الكهربائية عن طريق ربط مقاطع التمساح إلى voltmeثالثا يؤدي اختبار الإيجابية والسلبية. بدوره على مفتاح الطاقة مشجعا وتقديم الحالي مع دواسة القدم.
2. إعداد الشل الملقط وغيرها من المواد
- تراجع الشق واحد من ملقط وزن الريشة في طلاء من البلاستيك السائل والانتظار اربع ساعات للسماح للطلاء الجاف. التفاف بإحكام 15 ملم من غيض من الشق الآخر مع طبقة واحدة من خيط القطن الخياطة، وتأمين طريق ربط موضوع في نهاية عقدة.
ملاحظة: يتم استخدام الخيط لاستيعاب أي محلول ملحي التطبيقية التي تعزز التوصيل الكهربائي، في حين يوفر طلاء بلاستيكي عازل للتؤخر الحالية. - قطع رأس الإبرة تحت الجلد حادة مع مقص حاد وتسهيل فتح مع الرمل ورقة. إرفاق الإبرة إلى فخ النفايات فراغ (على سبيل المثال، قارورة فراغ فلتر) عبر أنابيب.
ملاحظة: إن الإبرة بعيدا شفط المياه واجتر، وسيعمل على استكمال الدوائر التي أنشأتها الأقطاب مشجعا. ومو افتتاح إبرةالحادي تكون صغيرة بما يكفي لعدم الإضرار العنكبوت، ولكن كبيرة بما يكفي لإيجاد حل فراغ دون انسداد (على سبيل المثال، 25 G × 1 ½ في مقياس، انظر قائمة المواد). - ملقط موقف الريشة أفقيا في موقف مغلقة بإحكام باستخدام المشبك ذي شقين المغطاة الفينيل المضمون إلى قاعدة مغناطيسية أو جهاز موقف ثابت تحت حقل مجهر تشريح وجهة نظر، مع البلاستيك المغلفة الشق من ملقط على رأس والخيط المغلفة الشق على الجزء السفلي.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ المشبك ذي شقين في وضع ثابت إلى قاعدة مغناطيسية من قبل حامل المشبك (انظر قائمة المواد). قد حصلت على الشريط المطاطي بإحكام حول شوكات من ملقط وزن الريشة، إلى جانب حامل المشبك، إضافة إلى ضغوط إضافية للحفاظ على ملقط وزن الريشة في موقف مغلقة حول العنكبوت مرة واحدة قدم. - إرفاق إيجابي كليب القطب التمساح إلى الشق السفلي ملقط "المنبع من موضوع ونعلق مقطع التمساح السلبي لفظة فراغ إبرة معدنية. اختبار الدوائر الحالية مع الفولتميتر من خلال وضع الرصاص إيجابي على ملقط الشق بين الخيط ومقطع التمساح ووضع الرصاص سلبي على إبرة حادة فراغ. الصحافة دواسة القدم لضمان الكشف عن التيار كافية وإزالة الخيوط إذا تم الكشف الحالية كافية.
- إعداد عدة أنابيب microcapillary لجمع السم. عقد أنبوب microcapillary واحد في نهاية واحدة مع يد القفاز وعلى الطرف الآخر مع ملقط معقم المعدنية، ووضع نهاية عقد ملقط أفقيا فوق لهب الموقد بنسن. سحب على microcapillary مع ملقط معدني بعيدا عن اللهب لخلق تلميح ممدود، بينما يمسك الطرف الآخر في وضع ثابت.
ملاحظة: ارتداء النظارات الواقية كما microcapillaries يمكن كسر بسهولة. - راحة microcapillaries مستعدة على تصاعد الشريط المعجون في طبق بتري. دراسة microcapillary ينتهي تحت مجهر تشريح وخلق، مشطوف فتحة صغيرة في نهاية سحبت مع ملقط معقم المعادن.
- لاعدد متغير من بيل العقيمة 0.5 مل أنابيب. إضافة عقيمة، منزوع الأيونات الماء إلى أنابيب معقمة (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات تعقيمها). أنابيب وثيقة وأنابيب مكان على الجليد.
- إعداد محلول ملحي في كوب وملء كوب بالماء الثاني تعقيمها.
3. الشلل العنكبوت في الملقط
- بدوره على CO 2 خزان ونقل العنكبوت من البلاستيك جمع قارورة مغلقة (انظر قائمة المواد) إلى CO 2 غرفة باستخدام ملقط معدنية طويلة.
ملاحظة: العناكب الأرملة السوداء لها السم الخطر. دائما ارتداء القفازات أثناء هذا البروتوكول. - الحفاظ العنكبوت في الغرفة لمدة 5-10 دقائق أو حتى تخدير والتي لم تعد تتحرك عندما حث بلطف مع ملقط طويلة. استخدام ماصة نقل الرطب موضوع على ملقط مع محلول ملحي.
ملاحظة: للحصول على إرشادات حول CO 2 المعلمات التخدير للأرامل السوداء، والرجوع إلى سبنا ومور 19. - استرداد العنكبوت تخدير من CO 2غرفة عن طريق التقاط ما يصل به الأرجل الأمامية لها باستخدام ملقط تشريح حادة وقفاز. الانتقال العنكبوت تخدير لوزن الريشة جهاز الملقط. شوكات منفصلة من ملقط الريشة المغلقة وتضع مقدمة الرأس العنكبوت في بين شوكات وتسمح شوكات لإغلاق اغلاق لضمان العنكبوت يقام بإحكام في مكان ولكن لا يتم سحقهم. ضمان أن يتم وضع العنكبوت الجانب درع ظهر أسفل (انظر Foelix 20 لدليل لتشريح العنكبوت)، ويستريح على موضوع المغلفة الشق، والجانب البطني درع ليواجه طلاء البلاستيك، في حين لا تزال القطب الموجب تعلق على الشق السفلي. العمل بسرعة عند التعامل مع العنكبوت.
- ضبط تشريح التكبير المجهر، والتركيز، ومصدر للضوء حتى chelicerae العنكبوت والأنياب هي واضحة للعيان.
4. جمع السم
- بدوره على فراغ والرش العنكبوت chelicerae بمحلول الماء باستخدام حقنة حادة الرؤوس الثاني نeedle. شفط المياه بعيدا مع فراغ إبرة لإزالة الشوائب.
- لمس إبرة فراغ المرفقة مع القطب السالب إلى العنكبوت المنبر وتقديم النبض مع دواسة قدم واحدة أو أكثر من مرة. فراغ بعيدا اجتر إذا لزم الأمر.
ملاحظة: العنكبوت المنبر هي داخل الفم الخلفي لchelicerae على السطح الظهري بين chelicerae وendites (انظر Foelix 20 لتشريح مفصل العنكبوت). ملاحظة: مع كل نبضة، وعقد الساقين العنكبوت، والسم تكون مرئية مثل قطرات اضحة الخارجة من الأنياب. - جمع قطرات السم مع تلميح microcapillary الشعرية ونقل معلومات سرية إلى أنبوب 0.5 مل بمحلول الماء أو عازلة (سيتم امتص الحل في الشعرية).
ملاحظة: تجنب ثقب العنكبوت مع الشعرية التي قد تؤدي إلى تلوث الدملمف والموت. تجنب أيضا تلوث الشعرية مع الحرير والغراء من المغازل. - نقل إرفاق المحاقن مع محول أنبوب لmicrocapillary (في الطرف المقابل لجمع معلومات سرية) و دالحل السم ispense مرة أخرى إلى الأنبوب. وضع أنبوب على الجليد.
ملاحظة: يجب التخلص من الشعيرات الدموية النفايات في حاوية الأدوات الحادة القريبة. - مكان مفتوح جمع قارورة بلاستيكية، جنبا إلى جنب مع غطاء لها، على مقربة من العنكبوت. فهم دقيق لأرجل العنكبوت مع ملقط تشريح حادة عقدت في يد واحدة والريشة المفتوحة بعناية مع ملقط شوكات ناحية أخرى، انزلاق العنكبوت في جمع قارورة مع ملقط كليلة وغطاء وثيق بسرعة. تواصل مع العنكبوت وتخزين المقبل الأنابيب التي تحتوي على السم في الفريزر -80 درجة مئوية عند الانتهاء.
ملاحظة: الاستمرار في توخي الحذر عند نقل العنكبوت من ملقط العودة إلى القارورة. تأكد من القارورة جمع والحد الأقصى هو قريب إلى العنكبوت للنقل السريع وارتداء القفازات.
5. السم الغدة تشريح
- بعد يومين إلى ثلاثة أيام جمع السم، تخدير العنكبوت في CO 2 غرفة (انظر الخطوة 3.1). ملء الناقل النيتروجين السائل ومكان المقبل لتشريح المجهر.
ملاحظة: WHأون العمل مع النيتروجين السائل، وحماية العين واستعمال قفازات المبردة. - منطقة تشريح نظيفة وملقط تشريح مع الحل الذي يقضي على ريبونوكلياز الحمض النووي والتلوث. ملء طبق بتري صغيرة وضعت تحت مجهر تشريح مع تشريح عازلة (على سبيل المثال، 1X سيترات الصوديوم المالحة (SSC) عازلة).
- نقل العنكبوت من CO 2 غرفة إلى طبق بتري واستخدام ملقط لفصل بسرعة مقدمة الرأس من البطن.
- عقد مقدمة الرأس تحت مجهر تشريح مع ملقط ووضع chelicerae في مجال الرؤية. استخدام نهايات حادة من الزوج الثاني من ملقط لخفض بشرة الانضمام للدرع إلى الجوانب الجانبية للchelicerae. أفقيا فهم chelicerae باستخدام الزوج الثاني من الملقط، والساحبة بلطف ذهابا وإيابا حتى يتم سحب غدد السم خارجا.
- غدد منفصلة عن chelicerae (أو ترك تعلق على chelicerae إذا رغبت في ذلك) ونقل إلى cyrosafe أنبوب 0.5 مل. مكان كلوسإد أنبوب في النيتروجين السائل.
ملاحظة: كل تشريح ينبغي أن لا يزيد عن 15 دقيقة. - تكرار تشريح مع العناكب إضافية حتى الانتهاء. أنابيب نقل من النيتروجين السائل في الفريزر -80 درجة مئوية.
Representative Results
وكثيرا ما يتم تنفيذ مجموعة من السم والغدد السم تشريح لتحديد خصائص البروتينات والببتيدات السم على مستوى تسلسل 10،11،15. ويمكن أيضا أن تستخدم السم جمعها في المقايسات الفسيولوجية لتحديد الأنشطة الوظيفية 18. وجمع السم السم يحفز الغدة التعبير الجيني، مما يسهل استنساخ النصوص سموم معينة عن طريق RT-PCR 10،11. ويمكن أيضا تحديد بروتينات السم أن يتحقق بطريقة عالية الإنتاجية من خلال دمج تقنيات مطياف الكتلة القياسية مع قواعد البيانات تسلسل المتولدة من مكتبات غدة السم [كدنا 15،21. مثال على مثل هذا العمل، بدءا من السم والغدد التي تم جمعها باستخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، مما يدل على فعاليته، ويتضح في الشكل رقم 1.
السم التي تم جمعها من L. تم هضمها الإناث البالغات كوكب الزهرة مع التربسين واخضاعه لعملية في حلتحليل MuDPIT الذي يربط HPLC (عالية الأداء اللوني السائل) إلى جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS). هنا تم إجراء تحليل MuDPIT من جامعة أريزونا البروتيوميات الكونسورتيوم. وتمت مقارنة جماهير الببتيدات والكشف عن شظاياها فصل (أيونات ابنة، المستنتجة من أطياف) لمتواليات الببتيد تنبأ نظريا من الترجمات من متواليات [كدنا] تم الحصول عليها من مكتبة التعبير الجيني شيدت من L. غدد السم كوكب الزهرة (تم الحصول على الغدد بواسطة بروتوكول تشريح المذكورة أعلاه) 21. في هذه التجربة، تم الكشف عن 36 البروتينات من جميع الأطياف التي تم جمعها، على عتبة الاحتمال 99.9٪، ويتضمن واحدة على الأقل الكشف عن الببتيد. واحد من الكشف عن بروتينات تدعمه 43 مجموع الأطياف (أطياف قدوة هو مبين في الشكل 1A)، أي ما يعادل ثلاثة الببتيدات الحصرية، والتي تغطي 35٪ من تسلسل البروتين (الشكل 1B). الكشف عن البروتين (مترجمة من collecte د [كدنا]) لديه كبير ضرب BLASTp لlatrodectin من L. tredecimguttatus (بنك الجينات الانضمام P49125.1)، مع درجة الإلكتروني لل2E-46، و 80٪ أسهم الهوية على مستوى تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين في الكشف عن هذه التجربة. Latrodectin، والذي يعرف أيضا باسم ألفا latrotoxin منخفض البروتين الوزن الجزيئي، هو عنصر السم المعترف بها الأرملة السوداء العناكب 22، 23، والتحقق من فعالية البروتوكول المقدمة. بعض البروتينات التي تم تحديدها من السم تتوافق مع تسلسل التي يتم العثور على أي ضرب الانفجار. ومن غير الواضح ما إذا كانت هذه النتيجة هي بسبب الموارد المحدودة المتاحة لالجينومية العناكب وكذلك معلومات وظيفية محدودة للبروتينات، أو لأن البروتين معروف يمثل الملوث السم. ومع ذلك، الجين أو البروتين التعبير يحلل دراسة وفرة هذا البروتين الرواية في الغدد السم نسبة إلى الأنسجة الأخرى يجب أن تكشف ما إذا كان عنصر السم حقيقي.
والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1: الببتيد Latrodectin تحديدها من السم الأسود أرملة باستخدام مطياف الكتلة (A) أطياف ممثل (واحد من 43) الكشف عن طريق MS / MS جزء من التحليل MuDPIT من L.. كوكب الزهرة السم الذي تم تعيينه لتوقع الترجمة من سلسلة [كدنا جمعها هو مبين في الجزء باء أطياف الكتلة يظهر لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من أيونات ابنة الكشف على المحور الأفقي التي تنتجها تفتيت الببتيد الأم (CGEEDFGEEIVK)، مع رسائل في أعلى تم تعيين تشير إلى تسلسل الببتيد على أساس ابنة الجماهير أيون. (ب) تسلسل البروتين الذي الأطياف في جزء A، تظهر باللون الأحمر، جريئة وشدد النص على تسلسل المقابلة من الأطياف هو مبين في الجزء ألف، نص أحمر إضافية (غير جريئة) يمثل الببتيد آخر في الكشف عن هذا البروتين مع الآخرين س التي تم جمعهاectra. ويترجم تسلسل البروتين من سلسلة [كدنا] تم الحصول عليها من غدد السم تشريح.
Discussion
السموم تمثل مصدرا هاما للبروتينات رد الفعل من الناحية الفسيولوجية، والببتيدات والجزيئات الأخرى مع تطبيقات لاكتشاف المخدرات، فضلا عن الجوانب الأساسية للخليوي والبحوث البيئية 1-3. ومع ذلك، فإن مجموعة من السم، وخاصة من الحيوانات الخطرة أو صغيرة، هو مهمة صعبة. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن جمع السم والغدد السم من العناكب الأرملة السوداء، ويؤكد نجاح هذا النهج عن طريق الجمع بين التحليل MuDPIT من السم وقاعدة بيانات البروتين المشتق من cDNAs المستنسخة من السم الغدد 21. في حين أن هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد للأرامل السوداء والعناكب متوسطة الحجم، وقد استخدمت تقنيات أخرى لجمع السم mygalomorph أكبر العناكب (مثل الرتيلاء)، مثل التطلع المباشر من السم من الأنياب في الزجاج الماصات على سبيل المثال، 24. وهذا النهج الأخير، ومع ذلك ، لن تعمل بشكل جيد لالعناكب الصغيرة الحجم التي لا aggressiهاء.
أحد الجوانب البالغة الأهمية وخاصة البروتوكول جمع السم الموصوفة هنا هي المراحل الأولية للإعداد وتعظيم الاستفادة من عملية جمع بحيث يصبح أكثر روتينية، بما يتفق وأسرع. بروتوكول يمثل تحديا في البداية لسيده، ولكن مع التجارب المتكررة، فإنه يصبح أسهل وأسرع. وحثت الحذر أيضا في كل المراحل الحرجة التي تنطوي على التعامل مع العناكب الخطرة، واستخدام التيار الكهربائي، والزجاج غرامة نقطة الشعيرات الدموية الدقيقة، وإبر حقنة. من المهم أن ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، والسراويل الطويلة والأحذية المغلقة، وكذلك النظارات عند تشكيل الشعيرات الدموية الدقيقة.
جانب آخر تحديا لجمع السم هو كمية صغيرة من السم التي تنتجها أي العنكبوت واحد، وخاصة الأنواع الزوع، والتي من المبالغ التي تم جمعها قد تكون لىmited إلى 1-2 ميكرولتر لكل فرد في أحسن الأحوال. الحصول على ما يكفي من السم لتطبيقات المصب، مثل البروتين والمواد الهلامية أو المقايسات الفنية قد تتطلب مزيج من السم من أفراد متعددين في أنبوب واحد. في مثل هذه الحالات، يجب فقط أن الجمع بين السم من الأفراد من نفس الجنس، مرحلة التخلق، وإعطاء السكان الاعتراف تقلب خنوثي، التنموي والجغرافي في بعض السموم 25 و 26. قد العناكب أيضا يحمل تباين كبير في كمية السم أنتجت بين الأفراد، حيث قد يعكس كميات أقل استنزاف مؤخرا للغدة. وبالتالي قد يكون من المستحسن لجمع السم بعد عدة أيام التغذية الآخيرة. إذا تم الإفراج السم قليلا، لا ينبغي أن يطبق التيار المفرط للعنكبوت، مما قد يتسبب في تمزق بشرة، مما يؤدي إلى تلوث السم مع الدملمف أو الموت.
تلوث عينات من سم العنكبوت مع سيوينبغي أيضا تجنب LK الإنسان أو مصادر من خلال استخدام معدات معقمة أو نظيفة. على الرغم من هذه التحديات، وجمع من السم النقي، وترك العنكبوت على قيد الحياة، هو أفضل من الأساليب التي تحصل السم من الخليط الغدة (التي لا فصل مكونات السم من البروتينات الخلوية الأخرى) وقتل العنكبوت. ومن الأهمية بمكان أيضا لضمان أن يتم تجميد العينات بسرعة لمنع تدهور البروتين.
استخراج السم يعزز إنتاج السم لاحقا، وبالتالي تحفيز السم التعبير الجيني في غدة السم. في وقت لاحق وهكذا، لأن هذا البروتوكول يسمح للالعناكب من أجل البقاء استنزاف السم، يمكن تشريح الغدد على عدة أيام (قتل العنكبوت) عند نقطة حيث من المتوقع أن تكون كافية للدراسات الجينية، مثل نسخة الاستنساخ 10،11 سم التعبير الجيني. يجب أيضا أن تؤخذ عدة احتياطات مهمة في تشريح غدة السم. وينبغي التركيز على استخدام المختبر equipmوالأنف والحنجرة والكواشف بحيث تكون خالية من RNases التي تحط من الحمض النووي الريبي. وبالتالي فمن المستحسن أن يمسح ملقط وغيرها من المعدات غير القابل للتصرف والسطوح مع الحلول التي تقضي على ريبونوكلياز الحمض النووي والتلوث. ينبغي إجراء التشريح في أسرع وقت ممكن والمجمدة مباشرة لزيادة ضمان سلامة الحمض النووي الريبي من الأنسجة. أخيرا، يجب فقط أن يؤديها على تشريح العناكب تخدير، بعد أن يتم فصل مقدمة الرأس والبطن بسرعة.
في الختام، تنص هذه المادة على بروتوكول التحقق من الحصول على العنكبوت السم السم والغدد. السم السم والغدد تسمح لعزل وتوصيف مكونات البروتين والببتيد وذلك باستخدام نهج البروتين وtranscriptomic. بالإضافة إلى ذلك، قد عينات السم تمثل نقطة الانطلاق من المقايسات الفنية، التي تحدد إمكانية الحيوية الطبية والدوائية من الجزيئات المكونة لها. ما يقرب من جميع العناكب تنتج السم، والغواص واسعةSITY مكونات السم توليفها من الأنواع الفردية يوحي وبعد أن اكتشف التنوع الهائل للجزيئات السم 13. وفقا لذلك، وهذا البروتوكول يوفر أدوات للتحقيق في مصدر غني من الجزيئات النشطة بيولوجيا الموجودة في سموم العنكبوت.
Disclosures
الكاتب ليس لديه ما تكشف ولا المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
أشكر الأشخاص التالية أسماؤهم لمساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول: تشاك كريستنسن، غريتا بينفورد، اليكس ك لانكستر، كونراد Zinsmaier، وميس عماد. تم الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي والبروتينات التي البروتيوميات اتحاد أريزونا بدعم من منحة ES06694 NIEHS إلى SWEHSC، منحة CA023074 المعاهد الوطنية للصحة / NCI إلى AZCC ومعهد BIO5 من جامعة أريزونا. وقدمت التمويل لهذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني للطب العام) من المنح 1F32GM83661-01 و1R15GM097714-01 لجيسيكا E. غارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305127 | |
| Vacuum filter flask 1 L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Joann fabric and craft store | 7245855 | similar product could be substituted |
References
- Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
- Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).
- Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).
- Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).
- Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
- Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).
- Silva, J. -P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).
- Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).
- Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).
- Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).
- Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).
- Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html (2013).
- Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).
- King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).
- Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).
- Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).
- Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).
- Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).
- Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).
- Foelix, R. Biology of Spiders. , Oxford University Press. (2010).
- Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366 (2014).
- Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).
- Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
- Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
- Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
- Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).
