Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Utvinning av Venom och Venom Gland Microdissections från Spiders för proteomik och Transcriptomic Analyser

Published: November 3, 2014 doi: 10.3791/51618

Summary

Den här artikeln innehåller ett protokoll för utvinning av giftet från spindlar som använder elektrisk stimulering för att 1) ​​genomföra proteomic karakterisering, 2) stimulera gift körtel genuttryck, och 3) utföra funktionella studier av gifter. Detta följs av en beskrivning av giftkörtel microdissections för gen-expressionsstudier.

Abstract

Gifter är kemiskt komplexa sekret vanligtvis innefattar många proteiner och peptider med olika fysiologiska aktiviteter. Funktionell karakterisering av giftproteiner har viktiga biomedicinska tillämpningar, inbegripet identifieringen av läkemedels leads eller sonder för cellulära receptorer. Spindlar är de mest artrika klad av giftiga organismer, men de gifter om bara några få arter är väl förstådd, delvis på grund av svårigheten i samband med att samla in små mängder av giftet från små djur. Denna uppsats presenterar ett protokoll för insamling av giftet från spindlar som använder elektrisk stimulering, vilket visar proceduren på västra svarta änkan (Latrodectus hesperus). Den insamlade gift är användbar för olika nedströms analyser inklusive direkt proteinidentifiering via masspektrometri, funktionella analyser och stimulering av gift genuttryck för transcriptomic studier. Denna teknik har fördelen över protokoll som isosen giftet från hela körtelhomogenat, som inte separerar äkta giftkomponenter från cellulära proteiner som inte utsöndras som en del av giftet. Representativa resultat visar detektion av kända gift peptider från det insamlade provet med hjälp av masspektrometri. Förfarandet gift kollektionen följs av ett protokoll för dissekera spider giftkörtlar, med resultat som visar att detta leder till att en grundvattengiftuttryckt proteiner och peptider på sekvensnivå.

Introduction

Gifter är djursekret övervägande injiceras i ett annat djur i syfte att predation eller försvar, och har även viktiga biologiska tillämpningar med biomedicinsk relevans 1-3. Endast vissa djur syntetisera gift, men produktionen är taxonomiskt utbredd över ryggradslösa djur (t.ex., nässeldjur, kon sniglar, skorpioner och spindlar) och ryggradsdjur (t.ex. ormar, vissa fiskar och däggdjur), eftersom det har självständigt utvecklats flera gånger 1,4 . Biokemisk karakterisering av gifter visar vanligtvis de består av en mängd olika proteiner och peptider, som i stor utsträckning verkar på cirkulations och nervsystemet hos injicerade djur att snabbt leverera ingående gifter 1. En liten del av giftiga djur kan utgöra ett hot mot människor, särskilt arter med synanthropic fördel 5. Studiet av giftet sammansättning och funktionella aktiviteter har spelat en viktig roll iden funktionella karakteriseringen av ryggradsdjur cellulära komponenter (särskilt neuronala jonkanaler) 6 och belysa grundläggande cellulära processer (t.ex. neurosekre) 7. Dessutom väljer gift peptider har användbara egenskaper i biomedicinska sammanhang, inklusive deras användning som behandlingar för cancer och smärta 8,9, och bryts för läkemedelskandidat leder och motgift utveckling. Gifter också spela framträdande roller i ekologisk och evolutionär forskning 1,4,10,11, alltså insamling av dessa farliga sekret har många verktyg.

Det finns> 40.000 beskrivna arter av spindel (Order Araneae), och alla utom en av de mer än 100 spider familjer besitter parade giftkörtlar som avslutas i huggtänder 12. Den höga artrikedom av spindlar tyder på att de representerar den största kladen av giftiga organismer. Men biokemisk karakterisering av spindelgifter har largely koncentrerad till ett litet antal arter som oftast förknippas med mänsklig envenomation. Senaste proteomik och transcriptomic studier av spindel gift anger de innehåller oftast många unika proteiner och peptider 2,13,14. Framsteg inom high-throughput cDNA sekvensering och masspektrometri peptid fingeravtryck har i hög grad underlättat upptäckten av dessa giftproteiner 15. Ändå börjar detta arbete med insamling av tillräcklig gift och / eller giftkörtlar från spindlar, och detaljerad dokumentation för sådana tekniker är få 16.

Denna uppsats presenterar ett protokoll för insamling av gift och giftkörtlar från svarta änkan, som kan tillämpas på liknande storlek spindlar. Insamlingen av giftet separat från körtlar möjliggör identifiering av proteiner som utsöndras i giftet i motsats till proteiner som utför andra cellulära funktioner. Svarta änkor och andra Latrodectus arter är allmänt erkända som bland de farligaste spindlar på grund av deras mycket neurotoxiska gift, som orsakar svår smärta hos människor, som ibland åtföljs av kraftig svettning, muskelsammandragningar, högt blodtryck, andningssvårigheter och ojämn förlamning 5. Giftet samling protokoll som presenteras här använder elektrostimulering för att leverera elektrisk ström till sövda spindlar att framkalla muskelsammandragningar och frisättning av gift. Venom droppar snabbt samlas med mikro kapillärer och fördelas i rör för frysförvaring. Eftersom protokollet omfattar farliga förfarandena bör det endast utföras av välutbildade individer och försiktighet uppmanas vid viktiga steg. Den insamlade giftet har många användningsområden, såsom karakterisering och isolering av ingående molekyler 2, för fysiologiska experiment eller funktionella analyser 18, och stimulera gift genuttryck 11. Protokollet avslutas med en description gift körtel dissektion och bevarande användbar för kloning av giftspecifika gener vars uttryck har visats förekomma 2-3 dagar efter gift utarmning i olika spindlar 10,11.

Protocol

1. Beredning av Electro-stimulator Apparatus

  1. Anslut elektro stimulator nätsladd till utlopp och bifoga extern fotpedal till den externa signalingång.
    Obs: Elektriska ledningar ska vara väl isolerade och utsatta metall levererar ström bör inte vidröras. Använd latex eller nitrilhandskar för skydd. Electro-stimulator strömbrytare ska vara i läge OFF när du sätter strömkabeln och fästa trådar.
  2. Anslut positiva elektroden till röd utgången på elektro stimulator (när polaritetsswitch är i normalläge) och anslut den negativa elektroden till den svarta utgång. Obs: Varje elektrodtråd ska sluta i en alligator klipp.
  3. Ställ stimulator till följande rekommenderade startinställningar: spänning = 7 V Frekvens = 1 pulser per sekund, fördröjning = 0 ms, varaktighet = 200 millisekunder, dubbla pulser växlar = regelbunden och lägesomkopplare = off.
  4. Test produktion av elektroder genom att fästa krokodilklämmor för att voltmeTER positiva och negativa testledningar. Slå på stimulator strömbrytaren och leverera ström med fotpedal.

2. Beredning av immobilisera Tång och andra material

  1. Doppa ena stift av fjäderlätta pincett till flytande plastbeläggning och vänta i fyra timmar för att låta beläggnings torka. Tätt linda 15 mm av spetsen på den motstående stift med ett enda lager av sömnad bomullstråd och säkra tråden genom att binda till slutet i en knut.
    Anm: Tråden används för att absorbera en applicerad saltlösning som befrämjar elektrisk ledningsförmåga, medan plastbeläggning ger isolering för att fördröja strömmen.
  2. Klipp spets trubbig kanyl med vass sax och jämna öppningen med sandpapper. Fäst nålen till en vakuumavfallsfälla (t.ex. vakuumfilterkolv) via slang.
    Obs: Nålen kommer suga bort vatten och spy, och kommer att användas för att slutföra kretsen skapas av stimulator elektroder. Nålöppningen must vara tillräckligt liten för att inte skada spindeln, men ändå tillräckligt stor för att vakuumlösning utan att täppa (t.ex. 25 G x 1 ½ i spårvidd, se Material List).
  3. Position fjäderlätta pincett horisontellt i en väl tillsluten position med hjälp av en plastöverdragen tvådelad klämma fäst vid en magnetisk bas eller fast stand-apparat under en dissekera mikroskop synfält, med plastbelagd stift av tång på toppen och gänga belagd stift på botten.
    Anmärkning: tvådelad klämma hålls i ett stationärt läge på den magnetiska basen medelst en klämma hållare (se Material lista). Ett gummiband kan vara tätt fäst runt stiften för fjäderlätta pincett, intill klämhållaren, för att lägga ytterligare tryck för att hålla fjäderlätta pincett i ett stängt läge runt spindeln när de har införts.
  4. Fäst positiva elektroden alligator klipp till pincett "botten stift uppströms tråd och bifoga negativ krokodilklämman till trubbiga metallvakuum nål. Testa lutningsström med voltmeter genom att pluskabeln på pincett stift mellan tråden och krokodilklämma och placera minusledningen på trubbig vakuum nål. Tryck fotpedal för att säkerställa tillräcklig ström upptäcks och ta bort ledningarna om tillräcklig ström upptäcks.
  5. Förbered flera mikrokapillär rör för gift samling. Håll en enda microcapillary slang i ena änden med en behandskade hand och i andra änden med sterila metall pincett, placera pincett-hålls änden horisontellt över en bunsenbrännarens låga. Dra på microcapillary med metall pincett bort från flamman att skapa en långsträckt spets, medan du håller den andra änden i ett stationärt läge.
    Obs: Använd skyddsglasögon som mikrokapillärer lätt kan spricka.
  6. Vila beredda mikrokapillärer på ett monterings kitt remsa i en petriskål. Undersök microcapillary slutar under ett dissekera mikroskop och skapa en liten, fasad öppning drog änden med steriliserade metall pincett.
  7. Label variabelt antal sterila 0,5 ml rör. Lägg sterilt, avjoniserat vatten till sterila rör (t ex 5 ^ autoklaveras avjoniserat vatten). Stäng rör och placera rören på is.
  8. Förbered koksaltlösning i en bägare och fylla en andra bägare med autoklaverat vatten.

3. Immobilisering av Spindel i Tång

  1. Slå på CO2 tank och överföra spindel från stängt plast samla flaskan (se Material List) till CO 2 kammare med långa metall pincett.
    Obs: svarta änkan har farligt gift; alltid bära handskar under detta protokoll.
  2. Håll spindel i kammaren under 5-10 minuter eller tills bedövade och inte längre röra sig när försiktigt stack med långa pincett. Använd överföringspipett till våt tråd på pincett med koksaltlösning.
    Obs: För riktlinjer om CO 2 anestesiparametrar för svarta änkor, se Spagna och Moore 19.
  3. Hämta sövda spindel från CO2kammaren genom att ta upp det med sina främre ben med hjälp av trubbig dissekera pincett och handskar på händerna. Flytta sövda spindel till fjäder pincett apparat. Separata stift av slutna fjäderlätta pincett och placera spindelns cephalothorax mellan stiften och låta stiften att stänga stänga för att säkerställa spindel hålls tätt på plats men är inte krossas. Se till att spindeln är placerad ryggskölden dorsum sidan nedåt (se Foelix 20 för guide till spider anatomi), vilar på tråd belagd stift, och ryggskölden är ventrala sidan mot plastbeläggningen, medan den positiva elektroden förblir fäst till botten stift. Arbeta snabbt vid hantering av spindel.
  4. Justera dissekera mikroskop förstoring, fokus och ljuskällan tills spindelns chelicerae och huggtänder syns tydligt.

4. Venom Collection

  1. Slå på vakuum och spray spindel chelicerae med vattenlösning med hjälp av en andra trubbig spets spruta needle. Sug bort vatten med vakuum nål för att avlägsna föroreningar.
  2. Tryck på vakuum nålen med bifogad negativa elektroden till spider talarstol och leverera puls med fotpedal en eller flera gånger. Vakuum bort regurgitate om nödvändigt.
    Obs: spider talarstol är inuti munnen posteriort chelicerae på ryggytan mellan chelicerae och endites (se Foelix 20 för detaljerad spider anatomi). Obs: Med varje puls, kommer spindelns ben kontrakt, och giftet vara synlig som klara droppar som kommer från huggtänder.
  3. Samla venom droppar med mikrokapillär spets och överföring kapillär spets i 0,5 ml rör med vatten eller buffertlösning (lösning kommer att sugas in i kapillär).
    Obs: Undvik att punktera spindel med kapillär som kan leda till kontamine hemolymfa och död. Också undvika förorening av kapillär med silke och lim från spinndysor.
  4. Fäst överförings spruta med slang adapter till mikrokapillär (i slutet motsatt insamling tips) och dispense gift lösning tillbaka i röret. Ställ röret på kylning.
    Obs: Lämna avfalls kapillärer i en närliggande avfallsbehållare.
  5. Placera öppen plast samla flaska, tillsammans med sin mössa, nära spindeln. Försiktigt tag i spindelben med trubbiga dissekera pincett hållas i en hand och försiktigt öppna fjäder pincett stift med andra handen, glidande spindel till att samla flaska med trubbig pincett och snabbt stänga locket. Fortsätt med nästa spindel och lagra giftinnehållande rör i -80 ° C frys när du är klar.
    Obs: fortsätta att iaktta försiktighet när du flyttar spindeln från tången tillbaka in i flaskan. Se till att uppsamlingsflaskan och locket är i närheten till spindeln för dess snabba överföring och handskar.

5. Venom Gland Dissektioner

  1. Två till tre dagar efter giftsamling, söva spindel i CO2 kammare (se steg 3.1). Fylla flytande bärare kväve och plats bredvid dissektionsmikroskop.
    Notera: whsv arbetar med flytande kväve, använda skyddsglasögon och kryogena handskar.
  2. Ren dissektion området och dissekera pincett med lösning som eliminerar RNas och DNA-kontaminering. Fyll en liten petriskål placeras under dissekera mikroskop med dissekera buffert (t.ex. 1x saltlösning-natriumcitrat (SSC) buffert).
  3. Transfer spindel från CO2 kammare till petriskål och använda pincett för att snabbt separera cephalothorax från buken.
  4. Håll cephalothorax under dissekera mikroskop med pincett och placera chelicerae i synfältet. Använd de vassa ändarna av ett andra par av pincett för att skära ytterhud sammanfogning carapacen till de laterala aspekterna av chelicerae. Sidled tag i chelicerae med den andra pincett och försiktigt ryck fram och tillbaka tills giftkörtlar dras ut.
  5. Separata körtlar från chelicerae (eller lämna bifogas chelicerae om så önskas) och överför till en cyrosafe 0,5 ml rör. Placera closed rör i flytande kväve.
    Obs: Varje dissektion bör inte ta mer än 15 minuter.
  6. Upprepa dissektion med ytterligare spindlar till färdigt. Överför rör från flytande kväve till -80 ° C frys.

Representative Results

Insamlingen av gift och giftkörteln dissektioner ofta utförs för att karaktärisera gift proteiner och peptider på sekvensnivå 10,11,15. Uppsamlades gift kan också användas i fysiologiska analyser för att bestämma deras funktionella aktiviteter 18. Insamlingen av gift kommer att stimulera giftkörteln genexpressionen och därigenom underlätta kloning av specifika toxintranskript via RT-PCR 10,11. Identifiering av giftproteiner kan också åstadkommas i en hög genomströmning sätt genom att integrera standard masspektrometriska metoder med sekvensdatabaser som genereras från giftkörteln cDNA-bibliotek 15,21. Ett exempel på sådant arbete, från gift och körtlar samlas in med hjälp av protokoll som beskrivs ovan, som visar dess effektivitet, illustreras i figur 1.

Venom in från L. hesperus vuxna honor digererades med trypsin och underkastades en i lösningMuDPIT analys, som länkar HPLC (högupplösande vätskekromatografi) till tandem-masspektrometri (MS / MS). Här MuDPIT analys genomfördes av University of Arizona proteomik Consortium. Massor av upptäckta peptider och deras dissocierade fragment (dotterjoner, härledas ur spektra) jämfördes med peptidsekvenser teoretiskt förutsagda från översättningar av cDNA-sekvenser som erhållits från ett genuttryck bibliotek från L. Hesperus giftkörtlar (körtlar förvärvats av dissektion protokoll som beskrivs ovan) 21. I detta experiment var 36 proteiner detekteras från alla insamlade spektra, vid sannolikhetströskelvärdet 99,9%, och innehöll minst ett upptäckta peptid. En av de detekterade proteinerna stöds av 43 totala spektra (exemplar-spektra som visas i figur 1 A), vilket motsvarar tre exklusiva peptider, som täcker 35% av proteinsekvensen (Figur 1B). Det detekterade proteinet (översatt från en Collecte d cDNA) har en topp BLASTP hit för att latrodectin från L. tredecimguttatus (GenBank Accession P49125.1), med ett e-poäng av 2e-46, och delar 80% identitet på aminosyrasekvensnivå med proteinet detekteras i detta experiment. Latrodectin, som också är känd som alfa-Latrotoxin lågmolekylärt protein, är ett erkänt gift komponent av svart änkaspindlar 22, 23, verifiera effektiviteten av det presenterade protokollet. Vissa proteiner som identifierats från giftet motsvarar sekvenser för vilka ingen BLAST träff hittades. Det är oklart om ett sådant resultat beror på de begränsade iska resurser som finns tillgängliga för spindlar samt begränsade funktionell information för att de proteiner, eller på grund av det okända proteinet är en gift förorening. Ändå gen eller proteinexpression analyser undersöker överflödet av sådant nytt protein i giftkörtlar i förhållande till andra vävnader bör avslöja om det är en äkta giftkomponent.

ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1: Latrodectin peptid identifierats från svarta änkan gift med hjälp av masspektrometri (A) representant spektra (en av 43) detekteras via MS / MS del av MuDPIT analys av L.. hesperus gift som tilldelats förutsagda translation av en samlas cDNA-sekvens som visas i del B. Spectra visar massa till laddningsförhållande (m / z) av detekterade dotterjoner på den horisontella axeln producerade genom fragmentering av moderpeptiden (CGEEDFGEEIVK), med bokstäver vid toppen indikerande peptidsekvensen baserat på dotter jonmassorna. (B) Protein sekvens till vilken spektra i del A tilldelades, och visar i rött, fetstil och understruken text motsvarande sekvens från de spektra som visas i del A, ytterligare röd text (ej fet stil) representerar en annan peptid i detta protein detekteras med andra insamlade spECTRA. Proteinsekvensen translateras från en cDNA-sekvens erhållen från dissekerade giftkörtlar.

Discussion

Gifter utgör en viktig källa till fysiologiskt reaktiva proteiner, peptider och andra molekyler med tillämpningar för läkemedelsutveckling, samt för grundläggande aspekter av cellulär och ekologisk forskning 1-3. Men insamlingen av giftet, särskilt från farliga eller små djur, är en utmanande uppgift. Detta protokoll visar hur gift och giftkörtlar kan samlas in från svarta änkan, och bekräftar framgången för denna strategi genom en kombination av MuDPIT analys av giftet och en proteindatabas härlett från cDNA klonad från giftkörtlar 21. Även om detta protokoll fungerar bra för svarta änkor och medelstora spindlar, andra tekniker gift insamling har använts för större mygalomorph (tarantel-liknande) spindlar, till exempel direkt aspiration av giftet från huggtänder i glas pipetter t.ex. 24. Detta senare synsätt, men , inte kommer att fungera bra för mindre stora spindlar som inte är aggressive.

En särskilt viktig aspekt av giftet uppsamlings protokoll som beskrivs här är de inledande faserna av utarbetande och optimering av insamlingen så att det blir mer rutin, konsekvent och snabbare. Protokollet är inledningsvis utmanande att bemästra, men med upprepade försök, blir det lättare och snabbare. Försiktighet uppmanas också vid alla kritiska moment som innefattar hantering av farliga spindlar, användning av elektrisk ström, fin-punkt glasmikro kapillärer och kanyler. Det är viktigt att bära lämplig personlig skyddsutrustning som nitrilhandskar, en labbrock, långa byxor och stängda skor, liksom glasögon vid utformningen mikro kapillärer.

En annan utmanande aspekt gift samling är den lilla mängden gift som produceras av någon spindel, särskilt Latrodectus arter, från vilken de belopp som samlas in kan vara limited till 1-2 mikroliter per individ i bästa fall. Att få tillräckligt med gift för tillämpningar efter, till exempel protein geler eller funktionella analyser kan kräva en kombination av giftet från flera personer i ett rör. I sådana fall bör gift endast kombineras från individer av samma kön, ontogenetiska skede, och befolkningen med tanke på erkännandet av intersexuell, utvecklande och geografisk variation i vissa gifter 25, 26. Spindlar kan också uppvisa stor variation i mängden gift som produceras mellan individer, där mindre mängder kan återspegla den senaste tidens utarmning av körteln. Således kan det vara lämpligt att samla gift flera dagar efter sin sista utfodring. Om lite gift släpps, bör överström inte tillämpas på spindeln, som kan orsaka nagelbanden att brista, vilket leder till förorening av giftet med hemolymfa eller död.

Förorening av giftprover med spindel silk eller mänskliga källor bör också undvikas genom användning av sterila eller ren utrustning. Trots dessa utmaningar, insamling av ren gift, lämnar spindel vid liv, är att föredra framför metoder som erhåller giftet från körtelhomogenat (som inte separerar giftkomponenter från andra cellulära proteiner) och dödar spindeln. Det är också viktigt att se till att prover snabbt fryses för att förhindra proteinnedbrytning.

Utvinningen av giftet främjar senare gift produktion, vilket stimulerar gift genuttryck i giftet körteln. Således, eftersom detta protokoll möjliggör spindlar att överleva gift utarmning, deras körtlar kan dissekerade flera dagar senare (döda spindeln) vid en punkt där gift genuttryck förväntas vara tillräcklig för genetiska studier, som avskrift kloning 10,11. Flera viktiga försiktighetsåtgärder måste också tas i giftkörteln dissektioner. Tyngdpunkten bör läggas på att använda lab equipment och reagens som är fria från RNaser som bryter ned RNA. Det rekommenderas därför att torka pincett och annan återanvändbar utrustning och ytor med lösningar som eliminerar RNas och DNA kontaminering. De dissektioner bör utföras så snabbt som möjligt och direkt fryst för att ytterligare säkerställa RNA integritet vävnaden. Slutligen bör dissektioner endast utföras på sövda spindlar, efter deras Kroppen och buken snabbt separeras.

Sammanfattningsvis här artikeln ger en verifierad protokoll för att få spindel gift och giftkörtlar. Venom och giftkörtlar möjliggöra isolering och karaktärisering av deras protein- och peptidkomponenter som använder proteomik och transcriptomic tillvägagångssätt. Dessutom kan giftprover representerar startpunkten för funktionella analyser, som bestämmer det biomedicinska och farmakologiska möjligheterna för deras ingående molekyler. Nästan alla spindlar producerar gift, och det breda dykarefald av giftkomponenter syntetiserade av enskilda arter antyder en stor mångfald av giftmolekylerna ännu inte upptäckt 13. Följaktligen tillhandahåller detta protokoll verktyg för att undersöka rik källa av biologiskt aktiva molekyler som är närvarande i spindelgifter.

Disclosures

Författaren har inget att lämna ut och inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Jag tackar följande personer för deras hjälp i utvecklingen av detta protokoll: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier och Mays Imad. Masspektrometri och proteomikdata förvärvades av Arizona Proteomics konsortiet stöds av NIEHS bidrag ES06694 till SWEHSC, NIH / NCI bidrag CA023074 till AZCC och av BIO5 Institute vid University of Arizona. Finansieringen av detta arbete lämnades från National Institutes of Health (National Institute of General Medicine) från bidrag 1F32GM83661-01 och 1R15GM097714-01 till Jessica E. Garb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)  Grass Technologies SD9 http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html
Voltmeter RadioShack 22-223 any generic voltmeter/multimeter can be substituted
Pointed Featherweight Forceps Bioquip 4748
Plasti Dip Performix Available at Ace Hardware
25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle BD Medical 305127
Vacuum filter flask 1 L Nalgene DS4101-1000 smaller flask sizes may also work
Buchner Two Piece funnel, 90 mm Nalgene 4280-0900
5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) VWR 53508-375
Mounting putty strip  Loctite Available at Ace Hardware
Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. Fisher 10-316C
SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade Promega V4261 can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) Eppendorf 22363611
Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask Thermo Scientific 4150-1000
Rnase Away VWR 53225-514
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) EMS 78310-0 similar high-quality fine point forceps can be substituted
Foot switch/pedal Linemaster Switch Corp. 491-S
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches VWR 21570-007 similar models could be substituted
Clamp Holder VWR 89084-746 similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) VWR 300042-270 similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) Bioquip 8940
Cotton sewing thread Joann fabric and craft store 7245855 similar product could be substituted

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
  2. Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).
  3. Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).
  4. Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).
  5. Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
  6. Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).
  7. Silva, J. -P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).
  8. Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).
  9. Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).
  10. Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).
  11. Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).
  12. Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html (2013).
  13. Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).
  14. King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).
  15. Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).
  16. Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).
  17. Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).
  18. Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).
  19. Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).
  20. Foelix, R. Biology of Spiders. , Oxford University Press. (2010).
  21. Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366 (2014).
  22. Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).
  23. Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
  24. Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
  25. Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
  26. Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).

Tags

Genetics spindel toxin proteomik transkriptomik elektrisk stimulering,
Utvinning av Venom och Venom Gland Microdissections från Spiders för proteomik och Transcriptomic Analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garb, J. E. Extraction of Venom andMore

Garb, J. E. Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses. J. Vis. Exp. (93), e51618, doi:10.3791/51618 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter