Summary
Questo articolo fornisce un protocollo per l'estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica.
Abstract
Veleni sono chimicamente secrezioni complesse in genere composto da numerose proteine e peptidi con varie attività fisiologiche. Caratterizzazione funzionale di proteine del veleno ha importanti applicazioni biomediche, tra cui l'identificazione di cavi di droga o sonde per i recettori cellulari. I ragni sono la maggior parte delle specie ricca clade degli organismi velenosi, ma i veleni di solo poche specie sono ben compresi, in parte a causa della difficoltà associata a raccogliere quantità di veleno minute da piccoli animali. Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno di ragni con stimolazione elettrica, deve dimostrare la procedura sulla vedova nera occidentale (Vedova nera). Il veleno raccolta è utile per varie analisi a valle, compresa l'identificazione diretta delle proteine tramite spettrometria di massa, saggi funzionali, e la stimolazione dell'espressione genica veleno per gli studi di trascrittomica. Questa tecnica ha il vantaggio rispetto protocolli che isotardi il veleno da intere omogenati delle ghiandole, che non separano i componenti originali veleno dalle proteine cellulari che non vengono secreti come parte del veleno. Rappresentante risultati dimostrano l'individuazione di noti peptidi del veleno del campione raccolto con la spettrometria di massa. La procedura di raccolta veleno è seguito da un protocollo per dissezione ghiandole velenifere ragno, con risultati dimostrano che questo porta alla caratterizzazione di proteine e peptidi-veleno espresso a livello di sequenza.
Introduction
Veleni sono secrezioni animali prevalentemente iniettate in un altro animale a fini di predazione o di difesa, e hanno anche importanti applicazioni biologiche di rilevanza biomedica 1-3. Solo alcuni animali sintetizzano il veleno, ma la sua produzione è tassonomicamente diffusa in tutta invertebrati (ad esempio, cnidari, lumache cono, scorpioni e ragni) e vertebrati (ad esempio, i serpenti, alcuni pesci e mammiferi), perché si è evoluto in modo indipendente più volte 1,4 . Caratterizzazione biochimica di veleni mostrano tipicamente sono composti da un'ampia varietà di proteine e peptidi, che agiscono principalmente sul sistema circolatorio e nervoso di animali iniettati per fornire rapidamente tossine costituenti 1. Una piccola frazione di animali velenosi può costituire una minaccia per gli esseri umani, in particolare specie con distribuzioni sinantropici 5. Lo studio della composizione del veleno e le attività funzionali ha svolto un ruolo importante nellala caratterizzazione funzionale di componenti cellulari vertebrati (in particolare i canali ionici neuronali) 6 e nel chiarire processi cellulari fondamentali (ad esempio neurosecrezione) 7. Inoltre, selezionare i peptidi del veleno hanno proprietà utili in contesti biomediche, compresi i loro usi come trattamenti per il cancro e il dolore 8,9, e sono estratti per candidati cavi di droga e lo sviluppo antiveleno. Veleni anche svolgere un ruolo di primo piano nella ricerca ecologica ed evolutiva 1,4,10,11, quindi la raccolta di queste secrezioni pericolose ha molte utility.
Ci sono> 40.000 specie descritte di ragno (Ordine Araneae), e tutti, ma uno dei più di 100 famiglie in possesso di ragno coppie ghiandole velenifere che terminano in zanne 12. La diversità delle specie di ragni alto suggerisce che essi rappresentano la più grande clade degli organismi velenosi. Tuttavia, caratterizzazione biochimica di ragno veleni ha largely concentrata su un numero limitato di specie più spesso associati avvelenamento umano. Recenti studi di proteomica e trascrittomica di ragno veleni indicano che in genere contengono molte proteine e peptidi unici 2,13,14. I progressi nella high-throughput sequencing cDNA e spettrometria di massa peptide fingerprinting ha notevolmente facilitato la scoperta di queste proteine veleno 15. Tuttavia, tale lavoro ha inizio con la raccolta di veleno sufficiente e / o ghiandole velenifere dei ragni, e la documentazione dettagliata per tali tecniche sono pochi 16.
Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno e veleno ghiandole di ragni vedova nera, che può essere applicato ai ragni di dimensioni simili. La collezione di veleno separatamente dalle ghiandole permette l'identificazione di proteine che sono secrete nel veleno al contrario di altre proteine che svolgono funzioni cellulari. Vedove nere ed altrospecie atrodectus sono ampiamente riconosciuti tra i ragni più pericolosi a causa della loro veleno altamente neurotossico, che causa un forte dolore negli esseri umani, che a volte è accompagnata da abbondante sudorazione, contrazioni muscolari, ipertensione, difficoltà respiratorie e paralisi chiazze 5. Il protocollo di raccolta veleno qui presentata utilizza elettro-stimolazione per fornire corrente elettrica ai ragni anestetizzati di suscitare contrazioni muscolari e il rilascio di veleno. Goccioline Venom sono rapidamente raccolti con micro-capillari e dispensati in provette per la conservazione congelatore. Dato che il protocollo prevede procedure pericolose, deve essere eseguito esclusivamente da personale ben addestrato e cautela è invitato a passaggi chiave. Il veleno raccolto ha numerosi usi, quali la caratterizzazione e l'isolamento di molecole costituenti 2, per gli esperimenti fisiologici o test funzionali 18, e per stimolare il veleno espressione genica 11. Il protocollo si conclude con una description della ghiandola del veleno dissezione e la conservazione utili per il clonaggio di geni specifici veleno, la cui espressione è stato verificato 2-3 giorni successivi veleno deplezione in diversi ragni 10,11.
Protocol
1. Preparazione di elettro-stimolatore Apparecchio
- Collegare il cavo di alimentazione elettro-stimolatore alla presa e collegare pedale esterno per l'ingresso del segnale esterno.
Nota: i cavi elettrici devono essere isolati ed erogare corrente metalliche esposte non devono essere toccati. Indossare guanti in lattice o nitrile per la protezione. Interruttore di alimentazione elettro-stimolatore deve essere in posizione OFF quando si collega il cavo di alimentazione e collegare i fili. - Collegare elettrodo positivo al terminale di uscita rosso su elettro-stimolatore (quando l'interruttore di polarità è in modalità normale) e collegare l'elettrodo negativo al terminale di uscita nera. Nota: Ogni filo elettrodo deve terminare con un coccodrillo.
- Impostare stimolatore per le seguenti impostazioni iniziali consigliate: tensione = 7 V, Frequenza = 1 impulsi al secondo, ritardo = 0 millisecondi, duration = 200 millisecondi, gli impulsi gemelli interruttore = regolare, e l'interruttore mode = off.
- Uscita di test di elettrodi da collegare morsetti a coccodrillo per voltmeter puntali positivo e negativo. Accendere l'interruttore di alimentazione stimolatore e fornire corrente con comando a pedale.
2. Preparazione di immobilizzare Pinze e altri materiali
- Immergere un polo di pinze in piuma rivestimento in plastica liquida e aspettare quattro ore per far asciugare il rivestimento. Strettamente avvolgere 15 mm di punta del polo opposto con un singolo strato di filati per cucire di cotone, e fissare filo legando l'estremità in un nodo.
Nota: Il filo viene utilizzato per assorbire una soluzione salina applicata che promuove la conducibilità elettrica, mentre il rivestimento in plastica fornisce isolamento per ritardare corrente. - Tagliare punta smussata dell'ago ipodermico con forbici affilate e lisciare l'apertura con carta vetrata. Applicare l'ago di un sifone di vuoto (ad esempio, beuta per filtrazione a vuoto) tramite un tubo.
Nota: L'ago aspirare via l'acqua e rigurgitare, e servirà a completare il circuito creato da elettrodi dello stimolatore. Il mu apertura dell'agost essere abbastanza piccolo da non danneggiare il ragno, ma abbastanza grande per soluzione di vuoto senza intasarsi (ad esempio, 25 G x 1 ½ in finezza, vedere Elenco materiali). - Pinze Posizione piuma orizzontale in una posizione ben chiuso con un morsetto a due punte rivestito in vinile fissato ad una base magnetica o di apparecchi supporto fisso in campo di un microscopio da dissezione di vista, con la plastica rivestito polo di pinze sulla parte superiore e filo rivestito polo sul fondo.
Nota: Il morsetto duplice viene mantenuta in una posizione stazionaria alla base magnetica da una porta pinze (vedi Elenco materiali). Un elastico può essere collegato saldamente attorno rebbi della pinza piuma, accanto al supporto del morsetto, per aggiungere ulteriore pressione per mantenere la pinza piuma in posizione chiusa attorno al ragno volta introdotto. - Fissare positivo Clip elettrodo coccodrillo di polo inferiore forcipe 'a monte del filo e collegare il morsetto a coccodrillo negativo per smussare ago vuoto di metallo. Circuito di prova corrente con voltmetro mettendo cavo positivo sulla pinza polo tra filo e morsetto a coccodrillo e l'immissione cavo negativo sul ferro vuoto smussato. Premere il pedale per garantire viene rilevata una corrente sufficiente e rimuovere i cavi in caso di rilevamento di corrente sufficiente.
- Preparare diversi tubi microcapillari per la raccolta veleno. Tenere un singolo microcapillare ad una estremità con una mano guantata e all'altra estremità con una pinza di metallo sterili, ponendo orizzontalmente fine pinza-detenuti su un becco Bunsen. Tirare la microcapillare con le pinze metalliche lontano dalla fiamma per creare una punta allungata, tenendo l'altra estremità in una posizione stazionaria.
Nota: indossare occhiali di protezione come microcapillari possono rompersi facilmente. - Resto microcapillari preparati su una striscia di stucco di montaggio in una capsula di Petri. Esamina microcapillare termina sotto un microscopio da dissezione e creare una piccola apertura smussata alla fine tirato con pinze metalliche sterilizzati.
- Label numero variabile di sterili da 0,5 ml provette. Aggiungi sterili, acqua deionizzata sterile per tubi (per esempio, 5 ml di acqua deionizzata in autoclave). Chiudere le provette e tubi posto su ghiaccio.
- Preparare la soluzione salina in un bicchiere e riempire un secondo bicchiere d'acqua in autoclave.
3. L'immobilizzazione di Spider in Pinze
- Accendere CO 2 serbatoio e trasferire ragno dal chiuso fiala di plastica raccolta (vedi elenco dei materiali) in CO 2 camera con pinze di metallo lunghi.
Nota: ragni vedova nera hanno veleno pericolosi; indossare sempre i guanti durante questo protocollo. - Tenere ragno in camera per 5-10 minuti o fino a quando anestetizzato e non muoversi quando dolcemente pungolati con lunghe pinze. Utilizzare trasferimento pipetta per bagnare il filo pinza con una soluzione salina.
Nota: Per le linee guida sulla CO 2 parametri di anestesia per le vedove nere, fare riferimento a Spagna e Moore 19. - Recupera ragno anestetizzato da CO 2da camera di raccoglierlo per le zampe anteriori con dissettore smussato e le mani guantate. Spostare ragno anestetizzato a piuma apparecchiature pinze. Poli separati di pinze piuma chiuse e pongono cefalotorace del ragno tra i denti e permettono i rebbi di chiudere chiusa per garantire ragno è tenuta saldamente in posizione, ma non viene schiacciato. Assicurarsi che il ragno è posto lato carapace dorso verso il basso (vedi Foelix 20 per la guida di ragno anatomia), che poggia su filo rivestito polo, e sul lato ventrale del carapace di fronte al rivestimento in plastica, mentre l'elettrodo positivo rimane attaccato al polo inferiore. Lavorare velocemente durante la manipolazione di ragno.
- Regolare dissezione microscopio ingrandimento, messa a fuoco, e la sorgente luminosa fino cheliceri del ragno e zanne sono chiaramente visibili.
4. Venom Collection
- Accendere vuoto e spruzzare ragno cheliceri con una soluzione di acqua con una seconda punta smussata siringa nEedle. Aspirare via l'acqua con l'ago a vuoto per rimuovere le impurità.
- Toccare l'ago vuoto con elettrodo negativo collegato a ragno tribuna e fornire impulsi con pedale una o più volte. Vacuum via rigurgitare se necessario.
Nota: ragno podio è dentro la bocca posteriore al cheliceri sulla superficie dorsale tra cheliceri e endites (vedi Foelix 20 per informazioni dettagliate ragno anatomia). Nota: Con ogni impulso, gambe contratto del ragno, e il veleno sarà visibile come gocce chiare emergono dalle zanne. - Raccogliere il veleno goccioline con punta microcapillare e mancia capillare trasferimento in 0,5 ml di tubo con acqua o soluzione tampone (soluzione sarà risucchiato nel capillare).
Nota: evitare la puntura di ragno con capillare che può portare alla contaminazione emolinfa e la morte. Anche evitare la contaminazione del capillare con seta e colla da filiere. - Attaccare la siringa di trasferimento con adattatore tubo microcapillare (a parte opposta alla punta di raccolta) edsoluzione veleno ispense di nuovo nel tubo. Mettere la provetta in ghiaccio.
Nota: Smaltire capillari rifiuti in un apposito contenitore nelle vicinanze. - Luogo aperto fiala di plastica raccolta, insieme con il suo tappo, vicino al ragno. Cogliere attentamente le zampe di ragno con dissettore smussato tenute in una mano e con cura piuma aperta una pinza punte con l'altra mano, ragno scorrevole in raccolta flaconcino con una pinza smussato e chiudere rapidamente cap. Continuare con tubi-veleno contenente prossimo ragno e conservare in freezer -80 ° C una volta terminato.
Nota: continuare ad esercitare attenzione quando si sposta il ragno dalle pinze di nuovo nel flaconcino. Assicurarsi che la fiala di raccolta e il tappo è vicina al ragno per la sua rapidità di trasferimento e indossare i guanti.
5. Venom Gland Dissezioni
- Due-tre giorni dopo la raccolta veleno, anestetizzare ragno in CO 2 camera (vedere il punto 3.1). Riempire carrier azoto liquido e posto accanto al microscopio da dissezione.
Nota: whit lavora con l'azoto liquido, l'uso di protezione degli occhi e guanti criogenici. - Zona di dissezione pulito e dissettore con una soluzione che elimina la contaminazione RNasi e DNA. Riempire una piccola capsula di Petri posto sotto microscopio da dissezione con dissezione tampone (ad esempio, 1x citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) buffer).
- Trasferimento ragno dal CO 2 da camera di scatola di Petri e utilizzare pinze per separare rapidamente il cefalotorace con l'addome.
- Tenere il cefalotorace sotto il microscopio da dissezione con una pinza e posizionare il cheliceri nel campo visivo. Utilizza i taglienti estremità di una seconda coppia di pinze per tagliare cuticola unendo carapace agli aspetti laterali del cheliceri. Lateralmente cogliere il cheliceri con il secondo paio di pinze e tirare delicatamente avanti e indietro fino a ghiandole velenifere sono tirati fuori.
- Ghiandole separate dal cheliceri (o lasciare collegati al cheliceri se lo si desidera) e trasferirli in un cyrosafe tubo di 0,5 ml. Luogo clostubo ed in azoto liquido.
Nota: ogni dissezione non dovrebbe richiedere più di 15 minuti. - Ripetere dissezione con i ragni supplementari fino al termine. Tubi di trasferimento di azoto liquido in freezer -80 ° C.
Representative Results
La raccolta di veleno e di ghiandole del veleno dissezioni sono spesso eseguite per caratterizzare le proteine del veleno e peptidi a livello di sequenza 10,11,15. Raccolta veleno può essere utilizzato anche in saggi fisiologici per determinare le loro attività funzionali 18. La raccolta di veleno stimolerà veleno espressione genica della ghiandola, facilitando in tal modo la clonazione di specifici trascritti tossina tramite RT-PCR 10,11. Identificazione di proteine del veleno può essere eseguita in modo high-throughput, integrando tecniche di spettrometria di massa standard con le banche dati di sequenza generati dalle biblioteche ghiandola del veleno di cDNA 15,21. Un esempio di tale lavoro, partendo dal veleno e ghiandole raccolti utilizzando il protocollo descritto sopra, dimostrando la sua efficacia, è illustrato in Figura 1.
Venom raccolti da L. Hesperus femmine adulte è stato digerito con tripsina e sottoposti ad un in soluzioneAnalisi MudPIT, che collega HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) per spettrometria di massa tandem (MS / MS). Qui l'analisi MudPIT è stata effettuata dalla University of Arizona Proteomica Consortium. Le masse dei peptidi rilevati e loro frammenti dissociati (ioni figlia, desunti dagli spettri) sono stati confrontati con sequenze peptidiche teoricamente previsti da traduzioni di sequenze di cDNA ottenuti da una libreria di espressione genica costruito da L. Hesperus ghiandole velenifere (ghiandole sono stati acquisiti dal protocollo di dissezione descritto sopra) 21. In questo esperimento, 36 proteine sono state rilevate da tutti gli spettri raccolti, sulla soglia di probabilità del 99,9%, e contenevano almeno un peptide rilevato. Una delle proteine rilevate è supportato da 43 spettri totale (spettri esemplare mostrato in Figura 1A), corrispondenti a tre peptidi esclusive, che copre il 35% della sequenza della proteina (Figura 1B). La proteina rilevata (tradotto da un collecte d cDNA) è un successo BLASTP superiore per latrodectin dalla L. tredecimguttatus (GenBank adesione P49125.1), con un e-punteggio 2e-46, e condivide 80% di identità a livello di sequenza aminoacidica della proteina rilevata in questo esperimento. Latrodectin, che è anche conosciuto come proteina a basso peso molecolare alfa-latrotoxin, è un componente veleno riconosciuta di vedova nera ragni 22, 23, verifica dell'efficacia del protocollo presentato. Alcune proteine identificate dal veleno corrispondono a sequenze per le quali si trova nessun colpo BLAST. Non è chiaro se tale risultato è dovuto alle limitate risorse genomiche disponibili per ragni, nonché le informazioni funzionali limitata per le proteine, o perché la proteina sconosciuta rappresenta un contaminante veleno. Tuttavia, gene o l'espressione della proteina analisi esaminando l'abbondanza di una proteina simile romanzo in ghiandole velenifere rispetto ad altri tessuti dovrebbero rivelare se si tratta di un componente del veleno vero e proprio.
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Figura 1: peptide Latrodectin identificato dal nero vedova veleno mediante spettrometria di massa (A) spettri Rappresentante (uno dei 43) rilevata tramite porzione MS / MS di analisi MudPIT di L.. hesperus veleno che è stato assegnato a una versione prevista una sequenza di cDNA raccolto mostrato nella parte B. Spectra mostra massa per caricare il rapporto (m / z) degli ioni figlia rilevati sull'asse orizzontale prodotta dalla frammentazione peptide controllante (CGEEDFGEEIVK), con lettere in alto che indica la sequenza di peptidi sulla base di masse di ioni figlia. (B) sequenza della proteina a cui spettri nella parte A è stato assegnato, mostrando in rosso, grassetto e testo sottolineato la corrispondente sequenza dal spettri di cui alla parte A, ulteriore testo rosso (non in grassetto) rappresenta un altro peptide in questa proteina rilevato con altre sp raccolteECTRA. La sequenza della proteina è tradotto da una sequenza di cDNA ottenuto da ghiandole velenifere sezionati.
Discussion
Venoms rappresentano una fonte importante di proteine fisiologicamente reattivi, peptidi e altre molecole con applicazioni per la scoperta di farmaci, così come per gli aspetti fondamentali della ricerca cellulare e ecologica 1-3. Tuttavia, la raccolta di veleno, in particolare da animali pericolosi o di piccole dimensioni, è un compito impegnativo. Questo protocollo dimostra come veleno e veleno ghiandole possono essere raccolti da ragni vedova nera, e conferma il successo di questo approccio tramite una combinazione di analisi MudPIT del veleno e un database di proteine derivate da cDNA clonato da veleno di ghiandole 21. Anche se questo protocollo funziona bene per le vedove nere e ragni di medie dimensioni, altre tecniche di raccolta del veleno sono state impiegate per la più grande mygalomorph ragni (tarantola-simili), come ad esempio l'aspirazione diretta di veleno da denti in vetro pipette ad esempio, 24. Quest'ultimo approccio, tuttavia , non funziona bene per i ragni più piccoli di dimensioni che non sono aggressive.
Un aspetto particolarmente critico del protocollo di raccolta veleno qui descritto è la fase iniziale di preparazione e ottimizzazione del processo di raccolta in modo che diventi più di routine, coerente e veloce. Il protocollo è inizialmente difficile da padroneggiare, ma con prove ripetute, diventa più facile e più veloce. Cautela è inoltre invitata a tutte le fasi critiche che comportano la manipolazione di ragni pericolosi, l'uso di corrente elettrica, messa a punto in vetro micro capillari, e aghi da siringa. E 'importante indossare adeguati dispositivi di protezione individuale, come guanti di nitrile, un camice, pantaloni lunghi e scarpe chiuse, così come occhiali di protezione durante modellare micro capillari.
Un altro aspetto difficile da collezione veleno è la piccola quantità di veleno prodotto da qualsivoglia ragno, in particolare le specie Latrodectus, da cui gli importi raccolti possono essere litata a 1-2 microlitri per ogni individuo al meglio. Ottenere il veleno sufficiente per applicazioni a valle, come ad esempio gel di proteine o test funzionali può richiedere la combinazione di veleno da più individui in un tubo. In questi casi, il veleno dovrebbe essere combinato solo dagli individui dello stesso sesso, lo stadio ontogenetico, e la popolazione dato il riconoscimento di intersessuale, dello sviluppo e la variabilità geografica in alcuni veleni 25, 26. I ragni si possono presentare anche variare notevolmente la quantità di veleno prodotta tra gli individui, in cui importi inferiori può riflettere il recente esaurimento della ghiandola. Così può essere opportuno raccogliere veleno di alcuni giorni dopo la loro ultima poppata. Se poco veleno viene rilasciato, eccessiva corrente non deve applicare al ragno, che può causare la rottura della cuticola, portando alla contaminazione del veleno con emolinfa o la morte.
La contaminazione dei campioni di veleno con ragno SIfonti lk o umani dovrebbero essere evitati attraverso l'uso di materiale sterile o pulito. Nonostante queste sfide, la raccolta di veleno puro, lasciando vivo il ragno, è preferibile ai metodi che ottengono il veleno da omogenati delle ghiandole (che non separano i componenti del veleno da altre proteine cellulari) e uccidono il ragno. E 'anche fondamentale per garantire che i campioni siano rapidamente congelati per evitare la degradazione delle proteine.
L'estrazione di veleno promuove la successiva produzione di veleno, stimolando in tal modo l'espressione genica veleno nella ghiandola del veleno. Quindi, perché questo protocollo permette di ragni di sopravvivere veleno esaurimento, le loro ghiandole possono essere sezionati alcuni giorni dopo (uccidendo il ragno) in un punto in cui l'espressione del gene veleno dovrebbe essere sufficiente per gli studi genetici, come trascrizione clonazione 10,11. Diversi importanti precauzioni devono essere prese in dissezioni ghiandola del veleno. Occorre porre l'accento sull'utilizzo di laboratorio equipment e reagenti che sono privi di RNasi che degradano l'RNA. Pertanto si raccomanda di pulire pinze e altri materiali riutilizzabili e superfici con soluzioni che eliminano la contaminazione RNasi e DNA. Le dissezioni devono essere eseguite più rapidamente possibile e direttamente congelato per garantire ulteriormente l'integrità dell'RNA del tessuto. Infine, dissezioni devono essere eseguiti solo su ragni anestetizzati, dopo la loro cefalotorace e l'addome sono rapidamente separati.
In conclusione, questo articolo fornisce un protocollo di verifica per ottenere ragno veleno e veleno ghiandole. Venom e veleno ghiandole consentono l'isolamento e la caratterizzazione dei componenti proteici e peptidici mediante approcci di proteomica e trascrittomica. Inoltre, campioni veleno possono rappresentare il punto di partenza di saggi funzionali, che determinano il potenziale biomedico e farmacologico delle loro molecole costituenti. Quasi tutti i ragni producono il veleno, e l'ampia subacqueosità di componenti veleno sintetizzati da singole specie suggerisce una grande diversità di molecole di veleno sono ancora da scoprire 13. Di conseguenza, questo protocollo fornisce gli strumenti per studiare la ricca fonte di molecole biologicamente attive presenti in ragno veleni.
Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare e senza interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringrazio le seguenti persone per la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, e Mays Imad. Dati di spettrometria di massa e proteomica sono stati acquisiti dal Consorzio Arizona Proteomica supportato da NIEHS concessione ES06694 al SWEHSC, NIH / NCI concessione CA023074 al AZCC e dall'Istituto BIO5 della University of Arizona. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal National Institutes of Health (Istituto Nazionale di Medicina Generale) da sovvenzioni 1F32GM83661-01 e 1R15GM097714-01 a Jessica E. Garb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305127 | |
| Vacuum filter flask 1 L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Joann fabric and craft store | 7245855 | similar product could be substituted |
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