Summary
Bu makale 1 için elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir çıkarılması için bir protokol), proteomik karakterizasyonu yapmak 2) zehir bezi gen ifadesini uyarmak, ve 3) zehirlerinin fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlar. Bu gen ifadesi çalışmaları için zehir bezi microdissections bir açıklama ile takip edilmektedir.
Abstract
Zehirleri kimyasal genellikle çeşitli fizyolojik faaliyetleri ile çok sayıda proteinler ve peptidler içeren karmaşık salgıları vardır. Zehir proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu hücresel reseptörlere ilaç potansiyel ya da prob belirlenmesi dahil önemli biyomedikal uygulamalar vardır. Örümcekler zehirli organizmaların çoğu türlerin zengin clade vardır, ama sadece birkaç türün zehirleri nedeniyle küçük hayvanların zehrinin dakika miktarlarda toplama ile ilgili zorluk kısmen, iyi anlaşılmaktadır. Bu kağıt Batı kara dul (Karadul) hakkında prosedürünü gösteren, elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir toplanması için bir protokol sunar. Toplanan zehir kütle spektrometresi ile doğrudan protein tanımlama, fonksiyon deneyleri ve transkriptomik çalışmalar için zehir gen ifadesinin uyarılması dahil çeşitli alt analizler için yararlıdır. Bu teknik o iso protokolleri üzerinde bir avantaja sahiptirzehirin bir parçası olarak salgılanan olmayan hücresel proteinlerden hakiki zehiri bileşenlerini ayıramazsınız kepekli bezi homojenatlarının, geç gelen zehir. Örnek sonuçlar kütle spektrometrisi kullanılarak, toplanmış numune bilinen venom peptidleri saptanmasını ortaya koymaktadır. Zehir toplama işlemi sonuçlar, bu sekansı düzeyinde venom ifade edilen proteinlerin ve peptidlerin karakterizasyonuna yol açtığını gösteren sahip örümcek zehir bezlerinin kesme için bir protokol takip eder.
Introduction
Zehirleri ağırlıklı predasyon ve savunma amaçlı başka bir hayvana enjekte hayvan salgılar, ve, aynı zamanda biyomedikal alaka 1-3 önemli biyolojik uygulamaya sahiptir. Sadece bazı hayvanlar zehir sentezler, ancak bu evrim bağımsız çünkü üretim, omurgasızlar (örneğin, cnidarians, konik salyangoz, akrep ve örümcek) ve omurgalıların (örneğin, yılan, bazı balık ve memeliler) arasında taxonomically yaygın birden çok kez 1,4 . Zehirlerinin biyokimyasal karakterizasyonu tipik olarak, büyük oranda hızla kimyasal maddeler, 1 sunmak için enjekte edilen hayvanların dolaşım ve sinir sistemleri üzerinde etki, protein ve peptid çok çeşitli oluşmaktadır göstermektedir. Hayvanların zehirli küçük bir kısmı insanlarda, synanthropic dağılımları 5 ile özellikle türler için bir tehdit oluşturabilir. Zehir kompozisyon ve fonksiyonel aktivitelerin çalışma önemli bir rol oynadığıOmurgalı hücresel bileşenlerin (özellikle nöronal iyon kanalları) 6 ve temel hücresel süreçleri (örn Nörosekresyon) 7 durulaştırmada fonksiyonel karakterizasyonu. Ayrıca, seçim venom peptidleri kanseri ve ağrı 8,9 için tedavi olarak kullanımları da dahil olmak üzere, biyomedikal bağlamlarda faydalı özelliklere sahiptir ve aday ilaç potansiyel ve antivenomu geliştirilmesi için çıkartılmaktadır. Zehirleri de böylece bu tehlikeli sekresyon toplanması birçok yarar vardır, ekolojik ve evrimsel araştırma 1,4,10,11 belirgin rol oynarlar.
40,000 tarif örümcek (Sipariş Araneae) türleri ve köpekdişlerimden 12 feshetme zehir bezleri eşleştirilmiş sahiptirler 100'den fazla örümcek ailelerinden birinin ancak tüm> vardır. Örümcekler yüksek tür çeşitliliği onlar zehirli organizmaların büyük clade temsil ettiğini göstermektedir. Ancak, örümcek zehirlerinin biyokimyasal karakterizasyonu vardır largely genellikle insan sokmalarının ile bağlantılı türlerin az sayıda konsantre edildi. Örümcek zehirlerinin son proteomik ve Transkriptomik çalışmalar bunlar genellikle birçok benzersiz proteinler ve peptidler 2,13,14 içerdiğini gösterir. Yüksek verimli cDNA dizileme ve kütle spektrometresi peptid parmak izi gelişmeler büyük ölçüde bu zehir proteinlerin 15 keşfini kolaylaştırdı. Yine de, böyle iş gibi tekniklere yönelik yeterli zehir ve / veya örümceklerin zehir bezlerinde ve detaylı belgelere koleksiyonu ile başlar 16 birkaçıdır.
Bu kağıt benzer büyüklükte örümcekler uygulanabilir kara dul örümcekleri gelen zehir ve zehir bezlerinin toplanması için bir protokol sunar. Ayrı bezlerinden venom toplanması diğer hücresel fonksiyonların gerçekleştirilmesi proteinlere karşı zehir salgılanan proteinlerin tanımlanmasını sağlar. Siyah dul ve diğer Latrodectus türler nedeniyle yaygın, bazen bol terleme, kas kasılmaları, hipertansiyon, nefes darlığı ve yamalı felç 5 eşlik insanlarda şiddetli ağrıya sebep olan son derece nörotoksik zehiri, en tehlikeli örümcekler arasında olmak olarak kabul edilmektedir. Burada sunulan zehir toplama protokolü kas kasılmaları ve zehir serbest bırakılmasını temin için anestezi örümcekler elektrik akımını sağlamak için elektro-stimülasyon kullanır. Zehir damlacıkları hızlı bir şekilde mikro-kapiller ile toplandı ve dondurucu depolama için tüpleri içine tevzi edilmiştir. Protokol tehlikeli prosedürleri gerektirdiğinden, sadece iyi eğitilmiş kişiler tarafından yapılmalıdır ve dikkatli kilit aşamada zorlanmaktadır. Toplanan zehir örneğin karakterizasyonu ve fizyolojik deneyler ya da işlevsel deneyler 18 oluşturan moleküllerin 2, izolasyonu gibi çok sayıda kullanımları vardır ve zehir gen ekspresyonunu 11 uyarmak için. Protokol descr ile sona eriyorzehir bezi diseksiyon ve venom özel genlerin klonlanması için yararlı koruma iption, sentezleme üzere, farklı örümcek 10,11 venom azalması takip eden 2-3 gün meydana geldiği gösterilmiştir.
Protocol
Elektro-stimülatör Aparatı 1. Hazırlık
- Çıkış ve harici sinyal girişi için harici ayak pedalı takmak için elektro-stimülatör güç kablosunu bağlayın.
Not: Elektrik telleri uygun şekilde yalıtılmış olmalıdır ve açıkta kalan metal teslim cari dokunulmaması gerekir. Koruma için lateks veya nitril eldiven giyin. Güç kablosunu bağlamadan ve telleri takarken Elektro-stimülatör güç anahtarı KAPALI konumunda olmalıdır. - Elektro-stimülatörü kırmızı çıkış terminaline pozitif elektrot bağlamak (kutupluluk anahtarı normal modda iken) ve siyah çıkış terminaline negatif elektrot bağlamak. Not: Her bir elektrot teli, bir timsah klibi sona gerekir.
- Aşağıdaki önerilen başlangıç ayarlarına uyarıcısı: gerilimi = 7 V, saniyede Frekans = 1 bakliyat, gecikme = 0 milisaniye, süresi = 200 milisaniye, ikiz bakliyat kapalı = düzenli geçiş ve mod anahtarı.
- Voltme için timsah klipleri takarak elektrotların Test çıkışıter pozitif ve negatif test iletkenleri. Uyarıcısı güç anahtarını açın ve ayak pedalı ile akım sağlamak.
Tutturma Forseps ve Diğer Malzemelerin 2. Hazırlık
- Sıvı plastik kaplama içine tüy forseps ayaklarından birini batırın ve kaplama kuruması için dört saat bekleyin. Sıkıca pamuk dikiş ipliğinin tek bir tabaka ile karşı dişin ucu 15 mm sarın ve bir düğüm ucunu bağlayarak konuyu sabitleyin.
Not: Plastik kılıf, mevcut geciktirilmesi için yalıtımı sağlarken iplik, elektriksel iletkenlik teşvik uygulanan bir tuzlu su çözeltisi emmek için kullanılır. - Keskin bir makas ile künt derialtı iğne ucu kesilmiş ve zımpara kağıdı ile açılış pürüzsüz. Boru aracılığıyla bir vakum atık tuzak (örneğin, vakum filtre şişesi) için iğne takın.
Not: iğne suyunu emme ve kusar ve stimülatör elektrotlar tarafından oluşturulan devreyi tamamlamak için hizmet edecek edecektir. İğne açılış must tıkanma olmadan vakum çözüm henüz yeterince büyük, örümceğe zarar vermemesi için yeterince küçük olması (örneğin, 25 G göstergesi x 1 ½, Malzeme Listesi bakınız). - Pozisyon tüy gibi forseps yatay olarak üst üste forseps plastik kaplı dişli görünümünde bir kesme mikroskop alanının altında manyetik bir baz ya da sabit bir tek cihaz ile tespit edilen bir vinil kaplı iki uçlu bir kelepçe ile sıkıca kapalı bir pozisyonda, giriş ve iplik alt çatal kaplanır.
Not: iki uçlu bir kelepçe, bir kıskacı tutucusu ile manyetik tabanına sabit bir konumda muhafaza edilir (Malzeme listesi). Bir lastik bant sıkı bir kez ortaya örümcek çevresinde kapalı bir pozisyonda Hafif olan forseps tutmak için ek baskı eklemek için, kelepçe sahibine, tüy gibi hafif forseps sivri uçların yaklaşık tutturulabilir. - Ipliğin yukarı forseps 'alt çatal pozitif elektrot timsah klibi takın ve metal vakum iğne künt olumsuz timsah klip ekleyin. Iplik ve timsah klibi ve künt vakum iğne üzerinde olumsuz kurşun yerleştirerek arasında forseps çatal üzerinde olumlu kurşun koyarak voltmetre ile akım test devresi. Basın ayak pedalı yeterli akım tespit sağlamak ve yeterli akım tespit edilirse potansiyel kaldırmak için.
- Venom toplanması için birkaç microcapillary tüpleri hazırlayın. Bir Bunsen beki alev üzerinde yatay forseps tutulan ucunu yerleştirerek, eldivenli el ile bir ucunda ve steril metal forseps ile diğer ucunda bir tek microcapillary tüp tutun. Hareketsiz bir konumda diğer ucunu tutarak, uzakta uzun bir ipucu oluşturmak alevden metal forseps ile mikro-kılcal çekin.
Not: mikrokapillerler kolayca kırabilir gibi koruyucu gözlük takmalıdır. - Bir petri çanağı içinde bir montaj macun şeridi hazırlanmış mikrokapilerler bekletin. Microcapillary bir mikroskop altında biter incelemek ve sterilize metal forseps ile çekti sonunda küçük, eğimli açıklığı oluşturmak.
- Lasteril 0.5 ml tüp bel değişken sayısı. Tüpler, steril, steril, de-iyonize su ekleyin (örneğin, otoklavlanmış iyonu giderilmiş suyun 5 ul). Yakın tüpler ve buz üzerinde yer tüpler.
- Bir çanak içinde tuz çözeltisi hazırlayın ve otoklavlanmış su ile ikinci bir beher doldurun.
Forseps içinde Spider 3. İmmobilizasyonu
- CO 2 tankı açmak ve kapalı plastik toplama viyalden örümcek aktarmak uzun metal forseps kullanarak CO içine 2 odasını (Malzeme Listesi bakınız).
Not: kara dul örümcekleri tehlikeli zehir var; Her zaman bu protokol sırasında eldiven giyin. - 5-10 dakika kadar veya odasındaki örümcek tutmak anestezi ve hafifçe uzun forseps ile kışkırtılması artık hareket. Tuzlu su çözeltisi ile forseps iplik ıslak transfer pipet kullanın.
Not: kara dul CO 2 anestezi parametrelerle ilgili yönergeler için, Spagna ve Moore 19 bakın. - CO 2 anestezi örümcek AlKünt diseksiyon forseps ve eldivenli ellerini kullanarak ön bacakları bunu toplayıp odası. Forseps cihazı tüy siklet için anestezi örümcek taşıyın. Kapalı tüy forseps ayrı sivri uçların ve dişleri arasında örümceğin Cephalothoraks yerleştirin ve uçlarının yerinde sıkıca tutulur ama ezilmekten değil örümcek sağlamak için kapatma kapatmak için izin verir. Pozitif elektrot alt çatal bağlı kalırken, örümcek ipliğinin kaplı çatal dinlenme, (örümcek anatomisine kılavuz için Foelix 20) aşağı karapas Sırt tarafı yerleştirilir ve karapaksta en ventral tarafı plastik kaplama dönük olduğundan emin olun. Örümcek tutarken hızlı bir şekilde çalışın.
- Örümcek keliserin kadar mikroskop büyütme, odak ve ışık kaynağı diseksiyon ayarlayın ve dişlerini açıkça görülebilir.
4. Venom Koleksiyonu
- Vakum açın ve ikinci bir künt uçlu şırınga n kullanarak su çözeltisi ile örümcek keliserin spreyeedle. Kirleri çıkarmak için vakum iğne ile su uzakta emme.
- Örümcek kürsü bağlanmış negatif elektrotlu vakum iğne dokunun ve ayak pedalı, bir ya da daha çok kez darbe sağlar. Gerekirse Vakum uzak kusar.
Not: örümcek kürsü keliserin ve endites (ayrıntılı örümcek anatomi için Foelix 20) arasında dorsal yüzeyinde keliserin ağız posterior içindedir. Not: her darbenin ile örümceğin bacakları sözleşme ve zehir dişlerini ortaya çıkan berrak damlacıklar olarak görünür olacaktır. - Toplayın venom (çözüm kılcal emilecek) su veya tampon çözeltisi ile 0.5 ml tüp içine microcapillary ucu ve transfer kılcal ucu ile damlacıklar.
Not: Hemolimf kirlenme ve ölüme yol açabilir kılcal örümcek delinmesiyle önlemek. Ayrıca memecikten ipek ve tutkal ile kılcal kirlenmesini önlemek. - Ve d (son toplama ucu yanda) mikro-kılcal için tüp adaptörü ile transferi şırınga takıngeri tüpe ispense zehir çözüm. Buz üzerinde tüp koyun.
Not: yakındaki bir kabın içinde atık kılcal bertaraf edin. - Örümcek yakın olan kapağı ile birlikte, açık plastik toplama şişe yerleştirin. Künt diseksiyon forseps bir elle tutulacak ve dikkatle açık tüy künt forseps ve hızlı bir şekilde yakın kapakla şişeyi toplama içine örümcek kayar, diğer elinizle prongları forseps ile dikkatlice örümcek bacakları kavramak. Bittiğinde -80 ° C derin dondurucuda sonraki örümcek ve mağaza zehir içeren tüpler ile devam edin.
Not: geri şişenin içine forseps örümcek taşırken dikkatli kullanmaya devam etmektedir. Emin toplama şişe ve kapak hızla transferi için örümceğe yakın olduğundan emin olun ve eldiven giyin.
5. Venom Bezi Diseksiyonlar
- İki-üç gün zehir toplama sonra, CO 2 odasını (adım 3.1) örümcek uyutmak. Diseksiyon mikroskop yanında sıvı azot taşıyıcı ve yerini doldurmak.
Not: whtr sıvı azot, kullanımı göz koruması ve kriyojenik eldiven ile çalışıyor. - Temiz bir diseksiyon alanı ve RNaz ve DNA kontaminasyonu ortadan kaldırır çözeltisi ile diseksiyon forseps. Tampon (örneğin, 1x tuzlu-sodyum sitrat (SSC) tamponu) diseksiyon mikroskop diseksiyon altına yerleştirilen küçük bir petri doldurun.
- CO 2 odasından Transfer örümcek petri kabına ve hızlı bir şekilde karın Cephalothoraks ayırmak için forseps kullanın.
- Forseps ile mikroskop altında Cephalothoraks tutun ve görüş alanına keliserin yerleştirin. Keliserin lateral yönleri için kabuğunu katılmadan kütikül kesmek için forseps bir ikinci çift keskin uçları kullanın. Yanal forseps ikinci çifti kullanılarak keliserin kavramak, ve zehir bezleri çıkardı kadar yavaşça ileri ve geri çekiyorum.
- Keliserin ayrı bezleri cyrosafe 0.5 ml tüp ve transfer (veya ayrılmak istenirse keliserin bağlı). Yeri clossıvı nitrojen içinde ed tüpü.
Not: Her diseksiyon fazla 15 dakika sürer. - Bitene kadar ek örümcekler diseksiyon tekrarlayın. -80 ° C dondurucu içine sıvı azot transfer tüpleri.
Representative Results
Zehir ve zehir bezi diseksiyonların koleksiyon sık sık sekansı düzeyinde 10,11,15 de zehir proteinler ve peptidler karakterize etmek için yapılmaktadır. Toplanan zehiri da bunların fonksiyonel aktivitelerini 18 belirlemek için fizyolojik deneylerde kullanılabilmektedir. Venom koleksiyon suretle RT-PCR 10,11 aracılığıyla spesifik toksin transkript klonlama kolaylaştırılması, zehir bezi gen ifadesini teşvik edecektir. Zehir proteinlerinin tanımlanması da zehir bezi cDNA kütüphanelerinden 15,21 elde edilen dizi veri tabanları ile bir standart kütle spektrometre yöntemlerinin entegre bir yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir. İş, zehir ve yukarıda ayrıntılı protokol kullanılarak toplanan bezleri başlayarak etkinliğini gösteren bir örnek, Şekil 1 'de gösterilmektedir.
Zehir L. toplanan hesperus yetişkin dişiler çözelti içinde bir üzere tripsin ile sindirildi ve tabi tutuldu veTandem kütle spektrometrisi (MS / MS) HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) bağlanan mudpit analizi. İşte mudpit analiz Arizona Proteomiks Konsorsiyumu Üniversitesi tarafından gerçekleştirilmiştir. (Spektrumları anlaşıldığı kızı iyonlar) tespit edilmiştir peptitlerin kütleleri ve ayrışmış fragmanları teorik olarak L yapılmış bir gen sentezleme kütüphanesinden elde edilmiş cDNA dizilerine çevirilerinin tahmin peptid dizileri ile karşılaştırılmıştır hesperus zehir bezleri 21 (bezler diseksiyon protokolü tarafından satın alınmıştır yukarıda açıklanan). Bu deneyde, 36 proteinleri% 99.9 olasılık eşikte toplanan bütün spektrumu ile tespit edildi, ve en az bir peptidi tespit içeriyordu. Tespit edilen proteinlerden biri protein dizisinin (Şekil 1B),% 35 kapsayan, üç özel peptidlere karşılık gelen, 43 toplam spektrumu (Şekil 1A'da gösterilen örnek spektrumlan) tarafından desteklenmektedir. Bir collecte tercüme tespit proteini ( d cDNA) L. latrodectin bir üst BLASTP hit vardır Bu deneyde saptanan protein ile amino asit sekansı seviyesinde 2E-46, bir e-skoru tredecimguttatus (GenBank Erişim P49125.1) ve hisse% 80. Aynı zamanda, alfa-latrotoxin düşük molekül ağırlıklı bir protein olarak bilinen Latrodectin, kara dul bilinen bir zehir bileşeni sunulan protokolünün etkinliğini doğrulanması, 22, 23 örümcekler olup. Zehirinden Belirlenen bazı proteinler bu, BLAST isabet bulunursa olan serilerine tekabül etmektedir. Bilinmeyen protein zehir kirletici ifade etmekte ya da, çünkü nedeniyle örümcekler için mevcut olan sınırlı genomik kaynakların yanı sıra bunların proteinleri için sınırlı fonksiyonel bilgilere bir sonucu olup olmadığı açık değildir. Bununla birlikte, gen ya da protein ifadesi gerçek bir zehir bileşen olup olmadığını ortaya koymalıdır diğer dokulara göre zehir bezlerinde böyle bir roman proteinin bolluğu inceleyerek analiz eder.
hep ">:" keep-together.within-page = fo "ent
Şekil 1: kütle spektrometrisi kullanılarak kara dul venomundan tanımlanan Latrodectin peptit (A) 'Örnek spektrumları (43 biri) L. mudpit analizi, MS / MS kısmı ile tespit edildi. hesperus B bölümündeki Spectra gösterilen toplanan cDNA dizisinin tahmin edilen çeviri atandı zehiri kütle üstünde harflerle (CGEEDFGEEIVK) ana peptidi parçalanması ile üretilen yatay eksende tespit kız iyonların oranı (m / z) şarj etmek için göstermektedir bölüm A'da spektrumları için kızı iyon kitleler dayalı peptid sırasını gösteren. (B) Protein dizisi, kırmızı kalın göstererek, atanan ve metnin bölüm A'da gösterildiği spektrumları, ek kırmızı metin (kalın değil) dan gelen dizisi vurgulandı Bu protein, bir diğer peptit diğer toplanmış sp ile tespit temsil eder,ECTRA. Protein dizisi kesilmiş zehir bezlerinde elde edilen bir cDNA dizisinden çevrilmiştir.
Discussion
Zehirleri bir fizyolojik açıdan reaktif proteinler, peptidler ve ilaç keşfi için uygulamaları ile diğer moleküllerin önemli bir kaynak, yanı sıra hücre ve ekolojik araştırma 1-3 temel alanlarını temsil etmektedir. Bununla birlikte, özellikle tehlikeli veya küçük hayvanların zehir toplama, zor bir iştir. Bu protokol zehir ve zehir bezleri kara dul örümcekleri alınabilir nasıl gösteriyor ve zehirinden klonlanmış zehir mudpit analizi ve cDNA'lann türetilen bir protein veritabanının bir kombinasyonu yoluyla, bu yaklaşımın başarısını 21 bezleri doğruluyor. Bu protokol kara dul ve orta ölçekli örümcekler, için iyi çalışırken diğer zehirlerden toplama teknikleri ancak, bu pipetler örneğin, 24. Bu ikinci yaklaşım bardağa köpekdişlerimden zehir direkt aspirasyon gibi büyük mygalomorph (tarantula gibi) örümcekler için istihdam edilmiştir , aggressi olmayan küçük ölçekli örümcekler için iyi çalışmazA.Ş..
Daha rutin, tutarlı ve hızlı olur böylece burada anlatılan zehir toplama protokolünün bir özellikle kritik yönü toplama sürecinin hazırlanması ve optimizasyonu başlangıç yılıdır. Protokol master başlangıçta zor olduğunu, ancak tekrarlanan denemeler ile, daha kolay ve daha hızlı hale gelir. Dikkat da tehlikeli örümcekler işleme, elektrik akımı, ince nokta cam mikro kılcal damarlar, ve şırınga iğneleri ve kullanımını içeren tüm kritik aşamalarında zorlanmaktadır. Bu mikro kılcal damarları şekillendirirken gözlük yanı sıra, nitril eldiven, laboratuvar önlüğü, uzun pantolon ve kapalı ayakkabı gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giymek önemlidir.
Zehir toplama bir başka zorlu yönü tutarları li olabilir topladığı herhangi bir örümcek, özellikle Latrodectus türler tarafından üretilen zehirin az miktardaen iyi kişi başına 1-2 mikrolitre çokluğundan. Böyle bir protein jeller ya da işlevsel tahlilleri gibi alt uygulamalar için yeterlidir zehir elde edilmesi bir tüp içine birden fazla bireyden zehrin kombinasyonu da gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, zehir sadece aynı cinsiyetten, ontogenetik sahnenin kişilerden kombine edilmeli ve nüfus bazı zehirlerinin 25, 26 yılında, interseks gelişimsel ve coğrafi değişkenlik tanınmalı. Örümcekler de az miktarda bezinin son tükenmesi yansıtıyor olabilir bireyler, arasında üretilen zehir miktarı ciddi çeşitlilik gösterebilir. Böylece son beslenmeden sonra zehiri birkaç gün toplamak için tavsiye edilebilir. Biraz zehir bırakılırsa, aşırı akım hemolimfi veya ölüm zehir kirlenmeye yol, manikür yırtılmasına neden olabilir örümcek, uygulanan olmamalıdır.
Örümcek si ile zehir örneklerin kirlenmesilk veya insan kaynakları da steril veya temiz ekipman kullanımı ile kaçınılmalıdır. Bu zorluklara rağmen, saf zehir toplama, canlı örümcek bırakarak, (diğer hücresel proteinlerden zehiri bileşenleri ayrı değil) ve örümcek öldürmek bezi homojenatlarından zehir elde yöntemler tercih edilir. Bu örnekleri hızlı bir şekilde protein parçalanmasını önlemek için dondurulmuş sağlamak için de önemlidir.
Venom ekstraksiyon, böylelikle zehir bezlerinde zehir gen ifadesini uyarıcı, sonraki zehir yapımını arttırır. Örümcekler zehir tükenmesi hayatta kalmak için bu protokol sağlar çünkü, bu nedenle, bezler disseke edilebilir birkaç gün sonra zehir gen ifadesi böyle transkript 10,11 klonlama gibi genetik çalışmalar için yeterli olması beklenen bir noktada (örümcek öldürme). Birçok önemli tedbirler de zehir bezi disseksiyonlarında alınmalıdır. Vurgu laboratuar donatı kullanılarak konulmalıdırent ve RNA aşağılamak RNases ücretsizdir reaktifler. Böylece RNaz ve DNA kontaminasyonu tamamen ortadan kaldırmak çözümler forseps ve diğer non-tek cihaz ve yüzeylerin silinmesi için tavsiye edilir. Disseksiyonları ayrıca doku RNA bütünlüğünü sağlamak için mümkün olduğunca çabuk ve doğrudan donmuş olarak yapılmalıdır. Bunların cephalothoraks ve karın hızlı bir şekilde ayrılır sonra son olarak, diseksiyon sadece anestezi örümcek üzerinde gerçekleştirilmelidir.
Sonuç olarak, bu makalede örümcek zehir ve zehir bezleri elde etmek için doğrulanmış bir protokol sağlar. Zehir ve venom bezleri proteomik ve transkriptomik yaklaşımlar kullanılarak, protein ve peptid bileşenlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için izin verir. Buna ek olarak, zehir numuneler bileşen moleküllerinin biyomedikal ve farmakolojik potansiyelini belirlemek fonksiyon deneyleri, başlangıç noktasını temsil edebilir. Neredeyse bütün örümcekler zehir üretirler ve geniş dalgıçbireysel türler tarafından sentezlenen zehiri bileşenlerinin versitesi zehir moleküllerin geniş bir çeşitlilik henüz 13 keşfedilmeyi ileri sürüyor. Bu duruma göre, bu protokol, örümcek zehirleri bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin zengin bir kaynak araştırmak için araçlar sağlar.
Disclosures
Yazar ifşa hiçbir şey ve hiçbir rakip mali çıkarları vardır.
Acknowledgments
Ben bu protokolün geliştirilmesi onların yardım için aşağıdaki kişilere teşekkür: Chuck Kristensen, Greta binford'un, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier ve Mays Imad. Kütle spektrometresi ve proteomik verileri AZCC için SWEHSC, NIH / NCI hibe CA023074 için NIEHS hibe ES06694 tarafından desteklenen Arizona Proteomiks Konsorsiyumu tarafından ve Arizona Üniversitesi BIO5 Enstitüsü tarafından satın alındı. Bu iş için fon Jessica E. garb hibe 1F32GM83661-01 ve 1R15GM097714-01 gelen Sağlık Ulusal Enstitüleri (Genel Ulusal Tıp Enstitüsü) sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305127 | |
| Vacuum filter flask 1 L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Joann fabric and craft store | 7245855 | similar product could be substituted |
References
- Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
- Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).
- Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).
- Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).
- Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
- Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).
- Silva, J. -P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).
- Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).
- Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).
- Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).
- Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).
- Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html (2013).
- Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).
- King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).
- Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).
- Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).
- Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).
- Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).
- Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).
- Foelix, R. Biology of Spiders. , Oxford University Press. (2010).
- Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366 (2014).
- Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).
- Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
- Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
- Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
- Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).
