Summary
يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القناة وعلم الأمراض.
Abstract
القناة الصفراوية خارج الكبد وداخل الكبد تختلف تنمويا، ويمكن أن تتأثر بشكل مختلف عن أمراض معينة. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين cholangiocytes داخل وخارج الكبد، وبين الخلايا حديثي الولادة والكبار، ليست مفهومة جيدا.
طرق لعزل cholangiocytes القناة الصفراوية داخل الكبد من راسخة 1-4. عزل خلايا الأقنية خارج الكبد، خصوصا من حديثي الولادة، لم يتم بعد وصفها، على الرغم من أن هذا من شأنه أن تكون ذات فائدة كبيرة في فهم الاختلافات بين السكان cholangiocyte متميزة في دراسة والأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي يبدو أنها تستهدف القنوات خارج الكبد. الموصوفة هنا هو أسلوب الأمثل لعزل الخلايا القناة الصفراوية خارج الكبد على حد سواء حديثي الولادة والكبار الماوس. هذه التقنية تعطي السكان الخلية نقية مع الحد الأدنى من التلوث من خلايا اللحمة المتوسطة مثل الخلايا الليفية.
هذا methoويستند د على إزالة القنوات خارج الكبد والمرارة، تليها تشريح دقيق وتجريف لإزالة طبقات الدهون والخلايا الليفية. هي جزء لا يتجزأ الهياكل في طبقات سميكة من الكولاجين وتربيتها لمدة ما يقرب من 3 أسابيع للسماح ثمرة cholangiocytes في الطبقات الوحيدة، التي يمكن بعد ذلك إعادة trypsinized ومطلي للاستخدام التجريبي.
Introduction
أصل وتطور من داخل وخارج الكبد cholangiocytes تختلف بشكل ملحوظ. الكبد يتطور من رتج من المعى الأمامي الأديم الباطن بطني 5. المنطقة الذيلية من رتج تشكل الشجرة الصفراوية خارج الكبد، في حين أن المنطقة الجمجمة يولد الشجرة الصفراوية داخل الكبد 5. وتستمد cholangiocytes القناة داخل الكبد من الخلايا الاصلية في جميع أنحاء لوحة الأقنية في المناطق المحيطة البوابة 6. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا الكبد أو إما cholangiocytes 6. هذا له آثار سريرية كبيرة بالنظر إلى أن cholangiopathies قد تستهدف على وجه التحديد فئة واحدة من cholangiocytes. على سبيل المثال، يؤثر رتق القناة الصفراوية خارج الكبد في البداية القنوات من حديثي الولادة، في حين Alagille متلازمة يؤثر القنوات داخل الكبد.
هناك أوصاف متعددة من عزلة cholangiocytes داخل الكبد والقناة الصفراوية وحدات من الفئران والجرذان. فيvestigators عزلت الخلايا واحد عن طريق عزل مجاري الهواء وثمرة لاحقة، أو عن طريق الهضم والكبد الأجسام المضادة هدم من cholangiocytes معربا عن علامات محددة سطح الخلية 1-4. وقد تم عزل وحدات القناة الصفراوية الوظيفية والاستقطاب من قبل الهضم والكبد حجم الترشيح 7. وحدات القناة الصفراوية هي قادرة على الاستجابة للمحفزات إفرازية وإظهار إفراز السائل 7، في حين ثبت cholangiocytes معزولة لتطوير الهياكل ductular في المختبر 1،2. وتشمل القيود المفروضة على هذه الأساليب الحاجة إلى الخبرة الفنية المتخصصة ومعدات خاصة لنضح الكبد مع الإنزيمات الهضمية. بالإضافة إلى ذلك، هناك خطر التلوث مع خلايا اللحمة المتوسطة 3.
وهناك طريقة لعزل خارج الكبد cholangiocytes القناة الصفراوية، وتحديدا من القناة الصفراوية خارج الكبد حديثي الولادة، لم يتم وصفه سابقا. توضح هذه الورقة تقنية مبسطة لعزل الأطفال حديثي الولادةق كذلك خلايا القناة الصفراوية خارج الكبد الكبار على مستويات عالية من النقاء. وهذه التقنية تسهيل دراسة الاختلافات بين cholangiocytes والبحث في آليات الأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي تنطوي على القنوات خارج الكبد داخل وخارج الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية في ظل ظروف إنسانية في إطار بروتوكول وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المحلي (IACUC).
1. إعداد المعدات وحلول
- إعداد جدول الجراحية الماوس في مقربة من نسيج الثقافة هود والحاضنة (الشكل 1A). ملاحظة: تشمل المعدات المطلوبة مجهر تشريح، مصدر الضوء، 12.5 سم مقص القزحية على التوالي، 6 بوصة ملقط المنحني غير مسننة مع نصائح غرامة، و 4 بوصة ملقط مسنن مع نصائح المنحنية (الشكل 1B).
- وضع الأدوات المعقمة في كوب كوب من الكحول 70٪ على الطاولة الجراحية.
- ملء ثلاثة 60 ملم أطباق بتري معقمة مع وسائل الاعلام العزلة العقيمة (الجدول 1)؛ وضع اثنين على طاولة العمليات الجراحية وواحدة في غطاء محرك السيارة، كل على الجليد.
- وضع الفئران الذيل الكولاجين،10X الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، الماء المعقم، المعقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم والخلايا الظهارية الصفراوي (BEC) وسائل الاعلام (الجدول 1) في نسيج الثقافة هود. ملاحظة: يجب أن يكون الكولاجين على الجليد.
2. عزل القناة الصفراوية والثقافة
- الموت ببطء الفئران حديثي الولادة بين 0-3 أيام للحياة، من خلال التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون حتى يتبع اللاوعي من قبل خلع عنق الرحم، في المبادئ التوجيهية IACUC (الشكل 1C).
ملاحظة: الفئران الأكبر سنا يمكن استخدامها تبعا للاحتياجات تجريبية محددة. - وضع الحيوان في موقف ضعيف وجعل شق أفقي صغير عبور خط الوسط في منطقة الحوض. توسيع هذا الشق أفقيا ويصل كلا الجانبين من البطن، وتشكيل رفرف U الشكل. بدوره رفرف تصل لفضح أعضاء البطن. مرة واحدة في البطن مفتوحا، تحرك بحذر الامعاء من تجويف البطن نحو الجانب الأيمن من الحيوان لرؤية أفضل من الكبد والقناة الصفراوية المشتركة. ملاحظة: قد يكون من الضروري لتوسيع الشقوق الجانبية في القفص الصدري للحصول على التعرف بشكل أفضل على الكبد.
- باستخدام مجهر تشريح، وتحديد القناة الصفراوية المشتركة، والكبد، والأمعاء. تحديد القناة الصفراوية المشتركة الأولى (الشكل 1D)، وذلك باستخدام الحذر، حيث أن الهياكل هي حساسة جدا. مع ملقط مسنن مسنن وغير نظيفة بدقة وسلخ النسيج الضام بما في ذلك الدهون المحيطة الصفراء. استخدام ملقط لعقد واحد القناة وغيرها لتنظيف.
- استخدام تقنية مماثلة لتنظيف المرارة.
- وضع القنوات تنظيفها والمرارة في طبق أول من وسائل الإعلام العزلة على الجليد. التدليك بلطف الهياكل مع ملقط مسنن غير بينما في وسائل الإعلام إلى مزيد من إزالة الأنسجة الضامة وإزالة الصفراء من المرارة.
- نقل القنوات والمرارة إلى الطبق الثاني من وسائل الإعلام العزلة.
- بعد عزل مجاري الهواء والمرارة من 5 الحيوانات، ونقلقطع إلى طبق بيتري ثالث، في غطاء محرك السيارة. ملاحظة: إذا الخلايا هي أن تكون معزولة أكثر من 5 حيوانات، والقيام على دفعات، وذلك باستخدام حلول جديدة لكل مجموعة من الحيوانات 5.
- إعداد المواد الهلامية الكولاجين سميكة في نسيج الثقافة هود:
ملاحظة: يمكن استخدام أي طبق الحجم. طبق ثقافة 60 ملم مع الحجم النهائي من 3 مل الكولاجين لكل مجموعة من 5 الولدان يعمل بشكل جيد. وهذا ينبغي أن يكون مستعدا جديدة في وقت التضمين القنوات معزولة حديثا.- وضع الفئران الكولاجين ذيل، 10X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS 10X)، DH 2 O معقمة، ومعقمة 1 N هيدروكسيد الصوديوم على الجليد.
- واضاف حساب كميات درهم 2 0، 10X PBS، هيدروكسيد الصوديوم، والكولاجين اللازمة لالهلام مع تركيز النهائي من 2 ملغ / مل الكولاجين في برنامج تلفزيوني 1X، وذلك باستخدام وبلغ حجم التداول 1 N هيدروكسيد الصوديوم يساوي 0.023 أضعاف حجم الكولاجين. ملاحظة: إذا تم استخدام مصدر بديل الكولاجين، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحييد وتشكيل هلام.
- مزيج معا درهم 2 0، 10X برنامج تلفزيوني، و1 N هيدروكسيد الصوديوم، ثم تضاف الكولاجين وماصة جيدا لضمان حتى الاختلاط.
- مرة واحدة وقد سميكة حل الكولاجين لهلام مثل الاتساق في درجة حرارة الغرفة، تضمين فورا القنوات في الكولاجين.
- وضع في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لتمكين الكولاجين ليصلب.
- مرة واحدة وقد عزز الجل (يتغير لونها من الأبيض واضحة ل)، تراكب مع 3.5 مل من وسائل الإعلام BEC (الجدول 1)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- إزالة وسائل الاعلام BEC 3 مرات في الأسبوع واستبدالها مع 3.5 مل سائل الإعلام الجديدة.
3. عزل الابتدائية Cholangiocytes من الهلام الكولاجين سميكة
ملاحظة: في غضون 3 أسابيع، وسوف رقة من cholangiocytes (الخلايا مع نواة كبيرة تمتد مباشرة من القنوات جزءا لا يتجزأ) تكون مرئية في الكولاجين سميكة. إذا كانت هناك أعداد كبيرة من الخلايا الليفية في طبق، يجب التخلص منه. إذا كان عدد قليل من مناطق طبق ديكنمو الخلايا الليفية، ويمكن خفض هذه خارجا مع مشرط وإزالة قبل تقسيم cholangiocytes.
- إعداد المواد الهلامية الكولاجين رقيقة:
- تمييع الكولاجين لتركيز 1 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة. ملاحظة: استخدام 1 مل لمدة 100 مم لوحة؛ ضبط وفقا لحجم الأطباق الأخرى.
- نشر الحل الكولاجين بالتساوي مع رش الخلية (أطباق كبيرة) أو تلميح ماصة (أطباق صغيرة)، ثم ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- تغطية لوحة مع DMEM/F12 واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة.
- إزالة لوحة من الحاضنة ويغسل مع برنامج تلفزيوني 1X. نضح على الفور برنامج تلفزيوني 1X.
- معطف مع طبقة رقيقة الثاني من الكولاجين، ونشر عن طريق تناوب لوحة أو وضع لوحة على شاكر. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة.
- بعد أن عزز الكولاجين، لوحة الغلاف مع DMEM/F12 واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- تقسيم الخلايا من الإك المواد الهلامية الكولاجين:
- مع ملعقة ثقافة الخلية أو مكشطة الخلية، وتتخلص من هلام الكولاجين بلطف من لوحة بحيث يتحرك.
- إعداد الحل كولاجيناز عن طريق تمييع نوع كولاجيناز الحادي عشر (انظر قائمة المواد) إلى 10 ملغ / مل مع DMEM/F12. تخلط جيدا وتصفية العقيمة.
- إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز (أعلاه) في 60 ملم طبق من الخلايا في الكولاجين سميكة. لا تقم بإزالة وسائل الإعلام BEC (التي ينبغي أن تكون 3 مل). احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- إزالة محلول يحتوي على الخلايا، ووضع في أنبوب 15 مل المخروطية.
- تدور باستمرار في 2،200 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق بيليه في حجم مماثل من DMEM/F12.
- تدور الحل مرة أخرى في 2200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
- بيليه resuspend في 3 مل من التربسين 0.5٪، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. بعد الحضانة، ماصة الحل صعودا وهبوطا لتفريق ورقة من cholangiocytes. إضافة 5 مل من BEC سائل الإعلامالحل الثاني تدور في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف، و resuspend بيليه في DMEM/F12، ثم تدور حل في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف واعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام BEC (الجدول 1). خلايا لوحة على المواد الهلامية التي سبق الكولاجين رقيقة.
4. ممر وتخزين الخلايا
ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا على المواد الهلامية الكولاجين رقيقة حسب الحاجة.
- غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني العقيمة قبل يحتضنها 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- تحييد مع حجم مساو من وسائل الإعلام BEC، وبيليه في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. شطف بيليه مع DMEM/F12، ثم بيليه في 1500 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام BEC لتوزيعها على الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن الخلايا معلق في وسائط التخزين وتخزينها في الفريزر -80 ° C أو النيتروجين السائل (الجدول 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام هذا البروتوكول النتائج في عزل السكان من الأطفال حديثي الولادة الماوس cholangiocytes خارج الكبد مع نقاء ممتازة، كما يتبين من K19 المناعي تلطيخ (أرقام 2A و 2B)؛ نحقق نتائج مماثلة عزل خلايا من فئران بالغة. وقد لاحظنا أن يستغرق 3 أسابيع لخلايا من القناة الصفراوية المعزولة حديثا لتشكيل الطبقات الوحيدة على المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وcholangiocytes تنمو بطريقة خطية في جميع أنحاء الكولاجين سميكة، وتشكيل ورقة من الخلايا من القنوات معزولة. ينبغي تقسيم الخلايا وإعادة مطلي على الكولاجين والمواد الهلامية رقيقة قبل أن تصبح الطبقات الوحيدة متضخمة، منذ ظهور ثقوب في صحائف من الخلايا إذا لم يتم تقسيم الثقافات قبل 3 أسابيع. لنمو الخلايا والأمثل للحد من التلوث الليفية، فمن المهم لإزالة الأنسجة الضامة المحيطة القنوات خارج الكبد حساسة بعناية وبدقة أثناء تشريح والتنظيف الخطوات (2.3، 2.4). إذا كان هناك نمو الليفييمكن الانفجارات، وإزالة المنطقة المصابة من الكولاجين سميكة مع مشرط أو المص لطيف لحد من نقل الخلايا الليفية إلى خلايا قبل تقسيم. هذه انقسام الخلايا بسرعة خلال المقاطع الثلاثة الأولى ولكن عند نقاط العبور العالي، ويبطئ معدل النمو، والخلايا تصبح أكبر والرغوة. قمنا بتجميد بنجاح عينات من cholangiocytes، وإعادة مطلي لهم في أوقات لاحقة مع قابلية ممتازة؛ cholangiocytes إذابة، ومع ذلك، لا تكرار بأسرع المعزولة حديثا وتقسيم الخلايا.
يجب تعيين الرقم 1. المعدات الجراحية حتى في القرب من الأنسجة جهاز الثقافة. (A) يتم وضع مصدر الضوء وراء مجهر تشريح. (B) وتشمل المعدات الجراحية الشوري حادةissors، مرقئ، ملاقط مسننة المنحني، ومنحني ملاقط غير مسننة (C)؛. حجم ماوس لمدة 3 أيام القديمة المستخدمة لالعزلة (D) الملقط تحتجز القناة الصفراوية المشتركة في الماوس حديثي الولادة.
الشكل 2. يتم عزل السكان نقية من cholangiocytes خارج الكبد مع التلوث مع الحد الأدنى من خلايا اللحمة المتوسطة. كانت ملطخة Cholangiocytes مع K19 (الأخضر) مع دابي التصوير النووي (الازرق). أشرطة النطاق، 25 ميكرومتر.
| وسائل الإعلام | عنصر | مبلغ |
| جنتاميسين | 0.5 مل | |
| البنسلين، الستربتوميسين | 0.5 مل | |
| Fungizone | 0.5 مل | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 مل | |
| الصفراوي الظهارية الخليوي (BEC) وسائل الاعلام | FBS | 25 مل |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 مل | |
| M EM الأحماض الأمينية غير الأساسية | 5 مل | |
| الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم | 5 مل | |
| غ البيروفات | 5 مل | |
| تركز الدهون تعريفها كيميائيا | 5 مل | |
| البنسلين، الستربتوميسين | 5 مل | |
| جنتاميسين | 0.2 مل | |
| ايثانول | 0.13 مل | |
| 5 مل | ||
| فول الصويا التربسين المانع * | 5 مل | |
| L-الجلوتامين | 5 مل | |
| استخراج الغدة النخامية البقري | 1.1 مل | |
| ديكساميثازون * | 0.5 مل | |
| 3،3 '،5-triiodo-L-ثيرونين * | 0.5 مل | |
| عامل نمو البشرة * | 0.5 مل | |
| 5 مل | ||
| Fungizone | 1 مل | |
| وسائط التخزين (لتجميد الخلايا) | الصفراوي الظهارية الخليوي (BEC) وسائل الاعلام | 7 مل |
| DMSO | 1 مل | |
| العقيمة FBS | 2 مل | |
| * المكونات تحتاج إلى أن تكون مستعدة لتركيزات المناسبة قبل إضافة إلى وسائل الإعلام. الرجوع إلى قائمة المواد لمزيد من التعليمات. | ||
الجدول 1. مكونات وسائل الإعلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الموصوفة هنا هي تقنية لعزل cholangiocytes نقية من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران من الفئران من جميع الأعمار، بما في ذلك حديثي الولادة. تقدم هذه التقنية ميزة أن cholangiocytes خارج الكبد يمكن دراستها بمعزل عن cholangiocytes داخل الكبد، ويمكن أن تسهل دراسات لتحديد الاختلافات الرئيسية بين هؤلاء السكان من الخلايا. نشرنا مؤخرا انخفضت إلى التظاهر الدراسة أهداب في cholangiocytes خارج الكبد معزولة بواسطة هذه الطريقة والمصابين فيروس الروتا ريسوس 8. وتشمل مساوئ هذه التقنية التي هي كثيفة العمالة، ومطلوب تشريح دقيق لمنع التلوث الليفية؛ بالإضافة إلى ذلك، يطلب من ثمرة و 3 أسابيع على الأقل في الثقافة للحصول على خلايا كافية لمعظم التجارب. وبالتالي، قد تعكس هذه الخلايا التغييرات المرتبطة ثقافة الأبعاد. ولم يتم بعد تحديد ما إذا كان السكان الخلية التي تم الحصول عليها وتشمل أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية أو خلاياق من الغدد peribiliary 9،10.
حاولنا استخدام هذا الأسلوب لعزل cholangiocytes خارج الكبد من الفئران؛ ومع ذلك، فشلت الخلايا لتنمو في الثقافة. ما إذا كان عامل النمو الرئيسية في عداد المفقودين في وسائل الإعلام أو الثقافة أو ما إذا كانت تحتاج إلى أن تتغير الظروف الآخر هو حاليا قيد التحقيق.
في نهاية المطاف، وهذه الطريقة لعزل cholangiocytes خارج الكبد قد تسهم في فهم الاختلافات في أشكال داخل وخارج الكبد التليف الصفراوي، فضلا عن الاختلافات بين الخلايا حديثي الولادة والكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون لعلم الأمراض الجزيئية والتصوير الأساسية لمركز جامعة بنسلفانيا NIDDK للدراسات الجزيئية في أمراض الجهاز الهضمي والكبد (P30 DK50306) للحصول على المساعدة مع التصوير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK-092111) ومن Biesecker مركز سوزان أطفال الكبد وفريد (لRGW) وزمالة من شبكة الطفولة أمراض الكبد البحوث والتعليم (لSK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
