Summary
Una técnica para aislar cholangiocytes de los conductos biliares extrahepáticos de ratones recién nacidos se describe. Los conductos están meticulosamente disecados, y luego las células se aíslan por consecuencia en geles de colágeno gruesas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del desarrollo de vías biliares extrahepáticas y patología.
Abstract
Los conductos biliares intra y extrahepáticas del hígado son de desarrollo distinta, y puede ser diversamente afectados por ciertas enfermedades. Sin embargo, las diferencias entre cholangiocytes intra y extrahepáticas, y entre las células neonatales y de adultos, no están bien entendidas.
Los métodos para el aislamiento de cholangiocytes de conductos biliares intrahepáticos están bien establecidos 1-4. Aislamiento de células ductales extrahepáticos, especialmente desde el recién nacido, todavía no se ha descrito, aunque esto sería de gran beneficio en la comprensión de las diferencias entre las poblaciones cholangiocyte distintos y en el estudio de enfermedades tales como la atresia biliar que aparecen para apuntar a los conductos extrahepáticos. Se describe aquí es una técnica optimizada para aislar las células de las vías biliares extrahepáticas, tanto neonatal y del adulto del ratón. Esta técnica permite obtener una población de células puro con un mínimo de contaminación de las células mesenquimales como los fibroblastos.
Esta metod se basa en la eliminación de los conductos y de la vesícula biliar extrahepática, seguida de la disección meticulosa y raspado para remover capas de grasa y fibroblastos. Estructuras están incrustadas en capas gruesas de colágeno y se cultivaron durante aproximadamente 3 semanas para permitir el crecimiento de cholangiocytes en monocapas, que luego pueden ser tripsinizaron y re plateado para uso experimental.
Introduction
El origen y desarrollo de cholangiocytes intra y extrahepáticas son marcadamente diferentes. El hígado se desarrolla a partir de un divertículo del intestino anterior endodermo ventral 5. La región caudal del divertículo forma el árbol biliar extrahepático, mientras que la región craneal genera el árbol biliar intrahepático 5. Cholangiocytes conductos intrahepáticos se derivan de células progenitoras alrededor de la placa ductal en las regiones portal peri 6. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse en hepatocitos o colangiocitos 6. Esto tiene importantes implicaciones clínicas dado que cholangiopathies pueden dirigirse específicamente a una categoría de cholangiocytes. Por ejemplo, atresia biliar afecta inicialmente los conductos extrahepáticos del recién nacido, mientras que el síndrome de Alagille afecta conductos intrahepáticos.
Hay múltiples descripciones de la aislamiento de cholangiocytes intrahepáticos y unidades de conducto biliar de ratones y ratas. Entigadores han aislado células individuales mediante el aislamiento de conductos y la posterior derivación o por digestión del hígado y el anticuerpo desplegable de cholangiocytes que expresan marcadores de superficie celular específicos 1-4. Unidades funcionales de las vías biliares y polarizados se han aislado por digestión del hígado y la filtración de tamaño 7. Unidades de conductos biliares son capaces de responder a los estímulos secretora y demostrar la secreción de líquido 7, mientras cholangiocytes aislados se ha demostrado que el desarrollo de las estructuras ductular in vitro 1,2. Las limitaciones de estos métodos incluyen la necesidad de conocimientos técnicos especializados y equipos especiales para la perfusión del hígado con las enzimas digestivas. Además, hay un riesgo de contaminación con células mesenquimales 3.
Un método para aislar extrahepáticos cholangiocytes del conducto biliar, específicamente de los conductos biliares extrahepáticos neonatales, no se ha descrito previamente. En este trabajo se describe una técnica simplificada para aislar un neonatals así como las células de las vías biliares extrahepáticas adultos en los altos niveles de pureza. Esta técnica facilitará el estudio de las diferencias entre cholangiocytes y la investigación sobre los mecanismos de enfermedades como la atresia biliar que implican los conductos intra y extrahepáticas extrahepáticas.
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Protocol
Todo el procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo en condiciones humanas bajo un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso local (IACUC).
1. Preparación de Equipos y Soluciones
- Configuración de la mesa de operaciones del ratón en estrecha proximidad a la campana de cultivo de tejido y incubadora (Figura 1A). Nota: El equipo requerido incluye un microscopio de disección, una fuente de luz, 12,5 cm de largo tijeras iris recta, 6 pulgadas pinzas curvas dentadas no con puntas finas y 4 pulgadas pinzas dentadas con puntas curvas (fig. 1B).
- Coloque los instrumentos esterilizados en un vaso de vidrio de 70% de alcohol en la mesa quirúrgica.
- Llenar tres 60 mm placas de Petri estériles con medios de aislamiento estéril (Tabla 1); colocar dos en la mesa quirúrgica y una en la capilla, todo en hielo.
- Coloque colágeno de cola de rata,estéril 10x tampón fosfato salino (PBS), agua estéril, estéril 1 N de NaOH y células epiteliales biliares (BEC) medios de comunicación (Tabla 1) en la campana de cultivo de tejido. Nota: El colágeno debe estar en hielo.
2. Aislamiento y cultivo del conducto biliar
- La eutanasia a los ratones neonatales entre 0-3 días de vida, por la exposición a dióxido de carbono hasta que inconsciente seguido por dislocación cervical, según las directrices del IACUC (Figura 1C).
Nota: Los ratones más viejos pueden ser utilizados en función de las necesidades experimentales específicas. - Coloque animal en decúbito supino y hacer una pequeña incisión horizontal que cruza la línea media en la región de la pelvis. Extienda esta incisión lateralmente y hacia arriba a ambos lados del abdomen, formando una aleta en forma de U. Gire la solapa hacia arriba para destapar los órganos abdominales. Una vez que el abdomen está abierto, mover cuidadosamente los intestinos de la cavidad abdominal hacia el lado derecho del animal para una mejor visualización del conducto biliar común y del hígado. Nota: puede ser necesario extender las incisiones laterales en la caja torácica para obtener una mejor identificación del hígado.
- Usando el microscopio de disección, identificar el conducto biliar común, el hígado y los intestinos. Identificar el conducto biliar común primero (Figura 1 D), utilizando cautela, ya que las estructuras son muy delicados. Con las pinzas dentadas de sierra y no gubernamentales, meticulosamente limpia y acaba con el tejido conectivo que incluye la grasa que rodea a la bilis. Utilice uno fórceps para sujetar el conducto y el otro para limpiar.
- Utilice una técnica similar para limpiar la vesícula biliar.
- Coloque los conductos limpios y la vesícula hasta el primer plato de medios de aislamiento en el hielo. Masajea suavemente las estructuras con los forceps no dentados, mientras que en los medios de comunicación para eliminar más tejido conectivo y eliminar la bilis desde la vesícula biliar.
- Traslado conductos y vesícula biliar con el segundo plato de medios de aislamiento.
- Después del aislamiento de los conductos y vesículas biliares de 5 animales, transferir elpiezas a la tercera placa de Petri, en el capó. Nota: Si las células han de ser aislado a partir de más de 5 animales, se puede hacer en lotes, utilizando soluciones frescas para cada grupo de 5 animales.
- Preparar geles de colágeno gruesas en la campana de cultivo de tejidos:
Nota: cualquier plato tamaño puede utilizarse. Una placa de cultivo de 60 mm con un volumen final de 3 ml de colágeno para cada grupo de 5 neonatos funciona bien. Esto debe ser preparado fresco en el momento de la incorporación de conductos recién aisladas.- Coloque colágeno de cola de rata, estéril 10x tampón fosfato salino (PBS 10x), dH 2 O estéril, y estéril de NaOH 1 N en hielo.
- Cálculo de los volúmenes de dH 2 0, 10x de PBS, NaOH, y el colágeno necesario para geles con una concentración final de 2 colágeno mg / ml en PBS 1x, utilizando un volumen de 1 N de NaOH igual a 0,023 veces el volumen de colágeno añadido. Nota: Si se utiliza una fuente alternativa de colágeno, siga las instrucciones del fabricante para la neutralización y la formación de gel.
- Mezcle dH 2 0, 10x PBS, y 1 N de NaOH, a continuación, añadir colágeno y así pipeta para garantizar una mezcla uniforme.
- Una vez solución de colágeno se ha espesado a un gel de consistencia similar a temperatura ambiente, inmediatamente incrustar los conductos en el colágeno.
- Coloque en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 min para permitir que el colágeno se solidifique.
- Una vez gel se ha solidificado (color cambia de transparente a blanco), overlay con 3,5 ml de medio BEC (Tabla 1) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Retire el medio de BEC 3 veces por semana y reemplazarla con 3,5 ml de medio fresco.
3. Aislamiento cholangiocytes primarias de grueso colágeno geles
Nota: en el plazo de 3 semanas, hojas de cholangiocytes (células con núcleo grande que se extiende directamente desde conductos integrados) serán visibles en el colágeno de espesor. Si hay un gran número de fibroblastos en el plato, debe desecharse. Si un par de regiones del plato tienende crecimiento de fibroblastos, éstos se puede cortar con un bisturí y se retira antes de la división de los colangiocitos.
- Preparar geles de colágeno delgadas:
- Diluir colágeno a una concentración de 1 mg / ml con PBS estéril. Nota: Utilice 1 ml por placa de 100 mm; ajustar en consecuencia para otros platos de tamaño.
- Corre la solución de colágeno de manera uniforme con un esparcidor de células (grandes platos) o puntas de pipeta (pequeños platos), a continuación, dejar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Cubrir la placa con DMEM/F12 y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min.
- Retirar la placa de la incubadora y lavar con PBS 1x. Inmediatamente aspirar el PBS 1x.
- Escudo con una segunda capa delgada de colágeno, la difusión mediante la rotación de la placa o la colocación de la placa en un agitador. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min.
- Después de colágeno se ha solidificado, la placa de cubierta con DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min.
- Dividir celdas de thgeles de colágeno ick:
- Con espátula de cultivo celular o rascador de células, raspar gel de colágeno suavemente la placa de modo que está flotando.
- Preparar la solución de colagenasa diluyendo Tipo XI colagenasa (vea la lista de materiales) a 10 mg / ml con DMEM/F12. Mezclar bien y filtrar de forma estéril.
- Añadir 1 ml de solución de colagenasa (arriba) por 60 mm de placa de células en colágeno de espesor. No extraiga el soporte BEC (que debe ser 3 ml). Incubar plato durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Retire la solución que contiene células, y el lugar en 15 ml tubo cónico.
- Centrifugar a 2200 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en volumen similar de DMEM/F12.
- Girar solución de nuevo en 2200 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento en 3 ml de 0,5% de tripsina, y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 min. Después de la incubación, la solución de la pipeta hacia arriba y abajo para romper las hojas de cholangiocytes. Añadir 5 ml de los medios de comunicación un BECsolución giro ª a 1500 × g durante 5 min.
- Extraer el sobrenadante, y resuspender el sedimento en DMEM/F12, a continuación, girar solución a 1500 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en medios BEC (Tabla 1). Las células de la placa en geles de colágeno delgadas hechas previamente.
4. Pasaje y almacenamiento de células
Nota: las células en geles de colágeno delgadas se pueden dividir según sea necesario.
- Lavar las placas con PBS estéril antes de la incubación en tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 10-15 min.
- Neutralizar con un volumen igual de medio de BEC, y sedimentar a 1500 xg durante 5 min. Enjuague de pellets con DMEM/F12, entonces sedimentar a 1500 xg durante 5 min.
- Resuspender las células en los medios de comunicación de BEC para la distribución de colágeno recubierto placas de cultivo celular.
Nota: Alternativamente, las células pueden ser resuspendieron en medios de almacenamiento y se almacenan en un congelador de -80 ° C o nitrógeno líquido (Tabla 1).
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Representative Results
El uso de este protocolo resulta en el aislamiento de una población de ratones cholangiocytes extrahepáticas neonatales con excelente pureza, como lo demuestra la tinción de inmunofluorescencia K19 (Figuras 2A y 2B); logramos resultados similares aislamiento de células a partir de ratones adultos. Hemos observado que se tarda 3 semanas para las células de los conductos biliares recién aisladas para formar monocapas sobre geles de colágeno gruesas. Los cholangiocytes crecen de forma lineal a lo largo del colágeno de espesor, formando capas de células de los conductos aislados. Las células deben dividirse y re-chapada en geles de colágeno delgadas antes de monocapas a ser cubiertos, ya que los agujeros aparecen en las hojas de células si los cultivos no se dividen antes de 3 semanas. Para el crecimiento celular óptimo y para minimizar la contaminación de fibroblastos, que es importante para eliminar el tejido conectivo que rodea los delicados conductos extrahepáticos cuidadosamente y meticulosamente durante la disección y de limpieza en los pasos (2.3, 2.4). Si hay crecimiento de fibroexplosiones, la eliminación de la zona afectada de colágeno de espesor con un bisturí o succión suave pueden reducir la transferencia de los fibroblastos antes de la división de celdas. Estas células se dividen rápidamente durante los tres primeros pasos, pero en los puntos de paso más altas, la tasa de crecimiento se ralentiza, y las células se hacen más grandes y vacuolado. Hemos logrado embargar muestras de cholangiocytes, y los re-chapada en épocas posteriores con una excelente viabilidad; cholangiocytes descongeladas, sin embargo, no se replican tan rápido como recién aisladas y dividir celdas.
Figura 1. Equipo quirúrgico debe establecerse en las proximidades de un aparato de cultivo de tejidos. (A) Fuente de luz se coloca detrás del microscopio de disección. (B) Equipo quirúrgico incluye sc agudoissors, hemostático, una curva pinzas dentadas, y unas pinzas curvas un-dentados (C);.. Del tamaño de un ratón de 3 días de edad utilizado para aislamientos (D) Pinzas son la celebración de la vía biliar en el ratón neonatal.
Figura 2. Poblaciones puras de cholangiocytes extrahepáticas son aislados con la mínima contaminación con células mesenquimales. Cholangiocytes se tiñeron con K19 (verde) con imagen nuclear DAPI (azul). Las barras de escala, 25 micras.
| Medios de comunicación | Componente | Cantidad |
| Gentamicina | 0,5 ml | |
| Penicilina-estreptomicina | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (01:01) | 5 ml | |
| Biliar células epiteliales (BEC) Medios de comunicación | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (01:01) | 500 ml | |
| M EM aminoácidos no esenciales | 5 ml | |
| La insulina-transferrina-selenio | 5 ml | |
| Na piruvato | 5 ml | |
| Concentrado de lípidos químicamente definido | 5 ml | |
| Penicilina-estreptomicina | 5 ml | |
| Gentamicina | 0,2 ml | |
| Etanolamina | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Inhibidor de tripsina de soja * | 5 ml | |
| L-glutamina | 5 ml | |
| Extracto de pituitaria bovina | 1,1 ml | |
| Dexametasona * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-triyodo-L-tironina * | 0,5 ml | |
| Factor de crecimiento epidérmico * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Medios de almacenamiento (para la congelación de células) | Biliar células epiteliales (BEC) los medios de comunicación | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Estéril FBS | 2 ml | |
| * Los ingredientes deben estar preparados a concentraciones apropiadas antes de añadir en los medios de comunicación. Consulte la lista de materiales para la instrucción adicional. | ||
Cuadro 1. Componentes de medios.
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Discussion
Aquí se describe es una técnica para aislar cholangiocytes puros a partir de las vías biliares extrahepáticas de los ratones de los ratones de todas las edades, incluidos los recién nacidos. La técnica ofrece la ventaja de que cholangiocytes extrahepáticos se pueden estudiar por separado de cholangiocytes intrahepáticas, y puede facilitar los estudios para identificar las diferencias clave entre estas poblaciones de células. Hemos publicado recientemente un estudio que demuestra disminuyó cilios en cholangiocytes extrahepáticas aislados mediante este método y infectados con rotavirus rhesus 8. Las desventajas son que la técnica es mano de obra intensiva, y se requiere la disección meticulosa para evitar la contaminación de los fibroblastos; Además, consecuencia y al menos 3 semanas en cultivo se requieren para obtener células suficientes para la mayoría de los experimentos. Por lo tanto, estas células pueden reflejar los cambios asociados con la cultura de dos dimensiones. Todavía no se ha determinado si las poblaciones de células obtenidas incluyen un número significativo de células madre o célulass de las glándulas peribiliary 9,10.
Hemos tratado de utilizar este método para aislar cholangiocytes extrahepáticas de ratas; Sin embargo, las células no crecen en cultivo. Ya sea un factor clave de crecimiento no se encuentra en el medio de cultivo o si otras condiciones deben modificarse está actualmente bajo investigación.
En última instancia, este método para aislar cholangiocytes extrahepáticos puede contribuir a la comprensión de las diferencias en las formas intra y extrahepáticas de la fibrosis biliar, así como las diferencias entre las células neonatales y adultos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Patología Molecular and Imaging Core del NIDDK Centro de la Universidad de Pensilvania de Estudios Moleculares de las Enfermedades Digestivas y Hepáticas (DK50306 P30) para la asistencia con la imagen. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (R01 DK-092111) y de la Fred y Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW) y por una beca de la Red de Investigación de Enfermedades del hígado infantil y Educación (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
