Summary
En teknik til at isolere cholangiocytes fra ekstrahepatiske galdegange af neonatale mus er beskrevet. Kanalerne er omhyggeligt dissekeret, og cellerne isoleres ved udvækst i tykke kollagengeler. Denne metode giver et nyttigt værktøj til at studere ekstrahepatisk galdegang udvikling og patologi.
Abstract
De intra-og ekstrahepatiske galdegange i leveren er udviklingsmæssigt forskellige og kan være differentielt påvirket af visse sygdomme. Men forskellene mellem de intra-og extrahepatic cholangiocytes og mellem neonatale og voksne celler, er ikke godt forstået.
Metoder til isolering af cholangiocytes fra intrahepatiske galdegangene er veletablerede 1-4. Isolering af ekstrahepatiske duktale celler, især fra den nyfødte, er endnu ikke blevet beskrevet, selv om dette ville være til stor gavn i at forstå forskellene mellem forskellige cholangiocyte befolkninger og i at studere sygdomme såsom galdeatresi der synes at målrette de extrahepatic kanalerne. Beskrevet her er en optimeret teknik til at isolere både neonatal og voksne mus ekstrahepatiske galdegang celler. Denne teknik giver en ren cellepopulation med minimal forurening af mesenchymale celler såsom fibroblaster.
Denne method er baseret på fjernelse af ekstrahepatiske kanaler og galdeblære, efterfulgt af omhyggelig dissektion og skrabning for at fjerne fedt og fibroblast lag. Strukturer er indlejret i tykke lag af collagen og dyrket i 3 uger for at tillade udvækst af cholangiocytes i monolag, som derefter kan trypsiniseret og re udpladet til eksperimentel brug.
Introduction
Oprindelsen og udviklingen af intra-og extrahepatic cholangiocytes er markant anderledes. Leveren udvikler sig fra en diverticulum af ventrale foregut endoderm 5. Den caudale region af divertikel danner ekstrahepatisk galdetræet, mens skallepartiet genererer intrahepatisk galdetræet 5.. Intrahepatiske kanal cholangiocytes er afledt af stamceller omkring duktalt plade i peri portal Regionsudvalget 6. Disse celler har evnen til at differentiere til enten hepatocytter eller cholangiocytes 6. Dette har betydelige kliniske implikationer idet cholangiopathies specifikt kan målrette én kategori af cholangiocytes. For eksempel, i første omgang galdeatresi påvirker extrahepatic kanaler i den nyfødte, mens Alagille syndrom påvirker intrahepatiske kanalerne.
Der er flere beskrivelser af isolering af intrahepatic cholangiocytes og galdegang enheder fra mus og rotter. Iundersøgere har isoleret enkeltceller ved kanalen isolation og efterfølgende udvækst eller ved leveren fordøjelse og antistof trække ned af cholangiocytes udtrykker specifikke celleoverflademarkører 1-4. Funktionelle og polariserede galdegang enheder er blevet isoleret af leveren fordøjelse og størrelse filtrering 7. Galdegangsceller enheder er i stand til at reagere på sekretoriske stimuli og demonstrere væske sekretion 7, mens isolerede cholangiocytes har vist sig at udvikle kanalsystem strukturer in vitro 1,2. Begrænsninger af disse metoder omfatter behovet for specialiseret teknisk ekspertise og specialudstyr til leveren perfusion med fordøjelsesenzymer. Desuden er der en risiko for kontaminering med mesenchymalceller 3.
En metode til at isolere ekstrahepatiske galdegang cholangiocytes, specifikt fra neonatale ekstrahepatiske galdegangene, ikke tidligere er blevet beskrevet. Dette papir skitserer en forenklet teknik til at isolere neonatal ens samt voksne ekstrahepatiske galdegang celler ved høje niveauer af renhed. Denne teknik vil lette undersøgelsen af forskelle mellem intra-og extrahepatic cholangiocytes og forskning i mekanismerne for sygdomme som galdeatresi der involverer extrahepatic kanalerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele proceduren udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Alle dyr arbejde skal udføres under humane forhold under en protokol godkendt af de lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1.. Udarbejdelse af udstyr og løsninger
- Opsætning af mus operationsbord i tæt nærhed til vævskultur hætte og inkubator (figur 1A). Bemærk: Nødvendigt udstyr omfatter et dissektionsmikroskop, en lyskilde, 12,5 cm lange lige iris saks, 6 tommer ikke savtakkede buede pincet med fine spidser, og 4 tommer savtakkede pincet med buede spidser (figur 1b).
- Placer steriliserede instrumenter i et glas bæger på 70% alkohol på operationsbordet.
- Fyld tre sterile 60 mm petriskåle med sterilt isolation medier (tabel 1); placere to på kirurgisk bord og en i hætte, alle på is.
- Placer rotte hale kollagen,steril 10x phosphatpufret saltvand (PBS), sterilt vand, steril 1 N NaOH og biliær epitelcelle (BEC) medier (tabel 1) i vævskultur hætte. Bemærk: kollagen skal være på is.
2.. Bile Duct Isolering og Kultur
- Aflive neonatale mus mellem 0-3 dage af livet, ved udsættelse for carbondioxid indtil bevidstløs efterfulgt af cervikal dislokation, pr IACUC retningslinjer (figur 1C).
Bemærk: ældre mus kan bruges afhængigt af specifikke eksperimentelle behov. - Placer dyret i liggende stilling og lave et lille vandret snit krydser midterlinjen i regionen af bækkenet. Udvide denne indsnit sideværts og op på begge sider af maven, danner en U-formet klap. Slå klappen op for at afsløre de abdominale organer. Når maven er åben, omhyggeligt flytte tarmene ud af bughulen mod højre side af dyret til bedre visualisering af leveren og fælles galdegang. Bemærk: Det kan være nødvendigt at forlænge de laterale indsnit i brystkassen at opnå en bedre identifikation af leveren.
- Brug dissektionsmikroskop identificere den fælles galdegang, lever og tarme. Identificer den fælles galdegang først (figur 1D), ved hjælp af forsigtighed, da de strukturer er meget sarte. Med de savtakkede og ikke savtakkede pincet, grundigt rene og pluk fra bindevæv, herunder fedt omkring galde. Brug en pincet til at holde kanalen, og den anden at rengøre.
- Bruger en lignende teknik til at rense galdeblæren.
- Placer de rengjorte kabelkanaler og galdeblæren ind i den første skål af isolation medier på is. Masser blidt strukturerne med de ikke takkede pincet mens i medierne for yderligere at fjerne bindevæv og fjerne galde fra galdeblæren.
- Overfør kanaler og galdeblæren til andet skålen af isolation medier.
- Efter isolering af rør og gallbladders fra 5 dyr, overførebrikker til tredje petriskål, i hætte. Bemærk: Hvis celler skal isoleres fra mere end 5 dyr, gør i partier, ved hjælp af friske løsninger for hver gruppe på 5 dyr.
- Forbered tykke kollagengeler i vævskultur hætte:
Bemærk: enhver størrelse parabol kan anvendes. En 60 mm dyrkningsskål med et slutvolumen på 3 ml collagen for hver gruppe af 5 nyfødte fungerer godt. Dette bør være forberedt frisk på tidspunktet for indlejring frisk isolerede kanaler.- Placer rotte hale kollagen, steril 10x phosphatbufret saltvand (10x PBS) sterilt dH2O og steril 1 N NaOH på is.
- Beregn mængden af dH 2 0, 10x PBS NaOH og kollagen kræves for geler med en slutkoncentration på 2 mg / ml kollagen i 1x PBS under anvendelse af en mængde 1 N NaOH svarende til 0.023 gange volumenet af collagen tilsat. Bemærk: Hvis der anvendes alternativ kilde af kollagen, skal du følge producentens anvisninger for neutralisering og gel dannelse.
- Bland dH 2 0, 10x PBS, og 1 N NaOH, derefter tilføje kollagen og pipette godt for at sikre ensartet blanding.
- Når collagen løsning har fortykket til en gellignende konsistens ved stuetemperatur straks integrere kanalerne i kollagen.
- Placer i inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 minutter for at aktivere collagen størkne.
- Når gelen er størknet (farveskift fra klar til hvid), overlay med 3,5 ml BEC medier (tabel 1) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Fjern BEC medier 3 gange om ugen og erstatte med 3,5 ml frisk medie.
3.. Isolating Primære Cholangiocytes fra Tyk kollagengeler
Bemærk: inden for 3 uger, vil ark cholangiocytes (celler med store kerner strækker direkte fra indlejrede kanaler) være synlig i den tykke kollagen. Hvis der er et stort antal af fibroblaster i skålen, skal det kasseres. Hvis nogle få regioner af skålen harfibroblastvækstfaktor, kan disse skæres ud med en skalpel og fjernes forud for opdeling cholangiocytes.
- Forbered tynde kollagengeler:
- Fortynd kollagen til en koncentration på 1 mg / ml med sterilt PBS. Bemærk: Brug 1 ml til 100 mm plade; justere i overensstemmelse hermed for andre størrelse retter.
- Spred kollagenopløsningen jævnt med en celle sprederen (store retter) eller pipettespids (små retter), derefter forlade ved stuetemperatur i 10 min.
- Dæk pladen med DMEM/F12 og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 min.
- Fjern pladen fra inkubatoren og vask med 1x PBS. Umiddelbart aspirér 1x PBS.
- Coat med et andet tyndt lag af kollagen, spredning ved at dreje pladen eller anbringelse plade på en ryster. Inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter.
- Efter kollagen er størknet, dækpladen med DMEM/F12 og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 minutter.
- Split celler fra thick kollagengeler:
- Med cellekultur spatel eller celleskraber, skrab kollagengel forsigtigt fra pladen, så det er flydende.
- Forbered collagenase ved fortynding type XI kollagenase (se materialer liste) til 10 mg / ml med DMEM/F12. Bland godt og sterilt filter.
- Der tilsættes 1 ml collagenaseopløsning (ovenfor) per 60 mm skål af celler i tyk kollagen. Fjern ikke BEC medier (som bør være 3 ml). Inkuber skålen i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Fjern opløsning indeholdende celler, og placere i 15 ml konisk rør.
- Spin ned ved 2.200 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og re suspendere pellet i lignende mængde DMEM/F12.
- Spin opløsning igen ved 2.200 x g i 5 min. Fjern supernatanten.
- Resuspender pellet i 3 ml 0,5% trypsin, og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 minutter. Efter inkubation pipette løsningen op og ned for at bryde op ark cholangiocytes. Der tilsættes 5 ml BEC medier etnd spin-opløsning ved 1500 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet i DMEM/F12, og derefter spinde opløsning ved 1500 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og re suspendere pellet i BEC medier (tabel 1). Plate celler på tidligere foretagne tynde kollagengeler.
4.. Passage og opbevaring af celler
Bemærk: celler på tynde kollagengeler kan opdeles efter behov.
- Pladerne skylles med sterilt PBS inden inkubation i 0,25% trypsin ved 37 ° C i 10-15 min.
- Neutraliseres med et lige volumen af BEC medier og pelletere ved 1500 xg i 5 min. Skyl pellet med DMEM/F12, så pellet ved 1.500 xg i 5 min.
- Resuspender cellerne i BEC medier til distribution til collagen belagt cellekultur retter.
Bemærkning: Alternativt kan celler resuspenderet i lagermedier og opbevares i en -80 ° C fryser eller i flydende nitrogen (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den brug af denne protokol resulterer i isolation af en population af neonatale mus extrahepatic cholangiocytes med fremragende renhed, som det fremgår af K19 immunfluorescensfarvning (figur 2A og 2B); vi opnå lignende resultater isolere celler fra voksne mus. Vi har observeret, at det tager 3 uger for celler fra frisk isolerede galdegangene til dannelse af monolag på tykke kollagengeler. De cholangiocytes vokse lineært i hele tyk kollagen, danner ark celler fra de isolerede kanaler. Cellerne bør opdeles og re-belagte på tynde kollagengeler før monolag gror, da huller synes i plader af celler, hvis kulturerne ikke er delt før 3 uger. For at opnå optimal cellevækst og for at minimere fibroblast kontaminering, er det vigtigt at fjerne bindevævet omkring sarte ekstrahepatiske kanalerne omhyggeligt og omhyggeligt under dissektion og rensningstrin (2.3, 2.4). Hvis der er vækst af fibroeksplosioner, fjernelse af det ramte område af tyk collagen med en skalpel eller blid sugning kan reducere overførslen af fibroblaster før opdele celler. Disse celler deler sig hurtigt i løbet af de første tre passager, men ved højere grænseovergangssteder, bremser væksten, og cellerne bliver større og vakuoliserede. Vi har med succes frosne prøver af cholangiocytes, og re-belagte dem på senere tidspunkter med fremragende levedygtighed; optøede cholangiocytes, dog ikke kopiere så hurtigt som frisk isolerede og opdele celler.
Figur 1.. Kirurgisk udstyr skal oprettes i nærhed til apparat vævskultur. (A) Lyskilde er placeret bag dissektionsmikroskop. (B) Kirurgisk udstyr omfatter skarp scissors, hemostat, en buet savtakkede pincet, og et buet un-savtakkede pincet (C);.. størrelse af en 3 dage gammel mus anvendt til isolationer (D) pincet holder den fælles galdegang i den neonatale mus.
Figur 2. Pure populationer af ekstrahepatiske cholangiocytes isoleres med minimal forurening med mesenchymal-celler. Cholangiocytes blev farvet med K19 (grøn) med DAPI nukleare imaging (blå). Skalapanelerne, 25 um.
| Medier | Component | Beløb |
| Gentamicin | 0,5 ml | |
| Penicillin-streptomycin | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 ml | |
| Biliær epitelcelle (BEC) Media | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 ml | |
| M EM ikke-essentielle aminosyrer | 5 ml | |
| Insulin-transferrin-selen | 5 ml | |
| Na Pyruvate | 5 ml | |
| Kemisk definerede lipid koncentrat | 5 ml | |
| Penicillin-streptomycin | 5 ml | |
| Gentamicin | 0,2 ml | |
| Ethanolamin | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Sojabønnetrypsininhibitor * | 5 ml | |
| L-glutamin | 5 ml | |
| Oksehypofyseekstrakt | 1,1 ml | |
| Dexamethason * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-triiod-L-thyronin * | 0,5 ml | |
| Epidermal vækstfaktor * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Lagringsmedier (til frysning celler) | Biliær epitelcelle (BEC) medier | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Sterile FBS | 2 ml | |
| * Ingredienser skal være forberedt til passende koncentrationer før du tilføjer i medierne. Der henvises til materialeliste for yderligere vejledning. | ||
Tabel 1. Media komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en teknik til at isolere rene cholangiocytes fra ekstrahepatiske galdegange fra mus fra mus i alle aldre, inklusive nyfødte. Teknikken har den fordel, at extrahepatic cholangiocytes kan studeres separat fra intrahepatiske cholangiocytes og kan lette undersøgelser for at identificere de vigtigste forskelle mellem disse populationer af celler. Vi har for nylig offentliggjort en undersøgelse, der påviser nedsat cilier i extrahepatic cholangiocytes isoleret ved denne metode, og inficeret med rhesus rotavirus 8. Ulemper omfatter, at teknikken er arbejdskrævende, og omhyggelig dissektion er nødvendig for at forhindre fibroblast forurening; derudover kræves udvækst og mindst 3 uger i kultur at opnå tilstrækkelige celler for de fleste forsøg. Således kan disse celler afspejle ændringer associeret med todimensional kultur. Det er endnu ikke fastslået, om cellepopulationerne opnåede omfatter et betydeligt antal stamceller eller celles fra peribiliary kirtler 9,10.
Vi har forsøgt at bruge denne metode til at isolere extrahepatic cholangiocytes fra rotter; imidlertid ikke celler til at vokse i kultur. Hvorvidt en vigtig vækstfaktor mangler i dyrkningsmedier, eller om andre forhold skal ændres, er i øjeblikket under efterforskning.
I sidste ende kan denne metode til at isolere extrahepatic cholangiocytes bidrage til forståelsen af forskelle i intra-og extrahepatic former for galde fibrose, samt forskelle mellem neonatale og voksne celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Molekylær Patologi og Imaging Core for UPenn NIDDK Center for Molekylær Studier i Digestive og leversygdomme (P30 DK50306) for assistance med billeddannelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01 DK-092.111), og fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (til RGW) og ved et stipendium fra Childhood Leversygdom forskning og uddannelse Network (til SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
