Summary
Eine Technik, um Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengänge von neugeborenen Mäusen zu isolieren, wird beschrieben. Die Kanäle sind sorgfältig seziert und dann Zellen werden durch Auswuchs in dicken Kollagen-Gelen isoliert. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium extrahepatischen Gallengang Entwicklung und Pathologie.
Abstract
Die intra-und extrahepatischen Gallengänge in der Leber sind entwicklungspolitisch deutlich und differentiell durch bestimmte Krankheiten betroffen sein. Jedoch Unterschiede zwischen intra-und extrahepatischen Cholangiozyten und zwischen Neugeborenen und Erwachsenen-Zellen, sind nicht gut verstanden.
Methoden zur Isolierung von Cholangiozyten von intrahepatischen Gallengänge sind gut etabliert 1-4. Isolierung von extrahepatischen Gangzellen, insbesondere aus der Neugeborenen ist noch nicht beschrieben worden, obwohl dies von großem Nutzen für das Verständnis der Unterschiede zwischen verschiedenen Bevölkerungsgruppen und Cholangiozyten bei der Untersuchung von Krankheiten wie Gallengangsatresie, die die extrahepatischen Zielkanäle erscheinen. Beschrieben wird hier eine optimierte Technik, um sowohl Neugeborenen und Erwachsenen Maus extrahepatischen Gallengangzellen zu isolieren. Diese Technik ergibt eine reine Zellpopulation mit minimaler Verunreinigung aus mesenchymalen Zellen wie Fibroblasten.
Diese method ist auf die Beseitigung der extrahepatischen Gallengänge und, gefolgt von sorgfältige Dissektion und Schaben, Fett und Fibroblastenschichten zu entfernen basiert. Strukturen werden in dicken Schichten von Kollagen und kultiviert für ca. 3 Wochen eingebettet Auswuchs Cholangiozyten in Monoschichten, die dann mit Trypsin behandelt werden kann und wieder überzogen für den experimentellen Einsatz zu ermöglichen.
Introduction
Die Entstehung und Entwicklung der intra-und extrahepatischen Cholangiozyten unterscheiden sich deutlich. Die Leber entwickelt sich aus einer Divertikel des ventralen Vorderdarm Endoderm 5. Die Schwanzbereich der Divertikel bildet die extrahepatischen Gallenwege, während der Oberkopf erzeugt die intrahepatischen Gallenwege 5. Intrahepatische Kanal Cholangiozyten werden aus Vorläuferzellen rund um den duktalen Platte in den peri-Portal Bereiche 6 abgeleitet. Diese Zellen haben die Fähigkeit, entweder in Hepatozyten und Cholangiozyten 6 unterscheiden. Dies hat erhebliche klinische Implikationen da cholangiopathies kann gezielt eine Kategorie von Cholangiozyten. Zum Beispiel Gallengangsatresie betrifft zunächst die extrahepatischen Kanäle des Neugeborenen, während Alagille Syndrom betrifft intrahepatischen Gänge.
Es gibt mehrere Beschreibungen der Isolierung der intrahepatischen Gallengänge und Cholangiozyten Einheiten von Mäusen und Ratten. Investigators haben einzelne Zellen durch Kanaltrennung und anschließender Auswuchs isoliert oder durch Leber und Verdauung Antikörper nach unten ziehen von Cholangiozyten Expression spezifischer Zelloberflächenmarker 4.1. Funktionelle und polarisiert Gallengang-Einheiten wurden von Leber Verdauung und Größe 7 Filtration isoliert. Gallengang-Einheiten in der Lage sind zu reagieren auf Reize sekretorischen und zeigen Fluidsekretion 7, während isoliert Cholangiozyten wurde gezeigt, ductularen Strukturen in vitro 1,2 zu entwickeln. Einschränkungen dieser Methoden sind die Notwendigkeit für spezialisierte technische Expertise und spezielle Ausrüstung für Leberperfusion mit Verdauungsenzymen. Darüber hinaus gibt es ein Risiko der Kontamination mit mesenchymalen Zellen 3.
Verfahren extrahepatische Gallengang Cholangiozyten zu isolieren, und zwar von Neugeborenen extrahepatischen Gallenwege, ist bisher nicht beschrieben worden. Dieses Papier skizziert eine vereinfachte Methode für die Neugeborenen eine isolierens sowie erwachsene extrahepatischen Gallengangzellen bei hoher Reinheit. Diese Technik wird die Untersuchung der Unterschiede zwischen den intra-und extrahepatischen Cholangiozyten und Forschung in Mechanismen von Krankheiten wie biliäre Atresie, die extrahepatischen Kanäle beinhalten erleichtern.
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Protocol
Das gesamte Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Tier Arbeit sollte unter menschenwürdigen Bedingungen, unter einem Protokoll von der örtlichen Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen sind.
1. Herstellung von Ausrüstung und Lösungen
- Richten Sie die Maus OP-Tisch in der Nähe der Gewebekultur Kapuze und Inkubator (Abbildung 1A). Hinweis: Erforderliche Ausrüstung umfasst ein Binokular, eine Lichtquelle, 12,5 cm lange, gerade Iris Schere, 6 Zoll nicht gezackten gebogenen Pinzette mit feinen Spitzen, und 4-Zoll-gezähnt Zange mit gebogenen Spitzen (Abbildung 1B).
- Platzieren sterilisierten Instrumente in einem Becherglas von 70% Alkohol auf dem Operationstisch.
- In drei sterile 60 mm Petrischalen mit sterilen Isolationsmedien (Tabelle 1); legen Sie zwei am OP-Tisch und eine Kapuze, die alle auf dem Eis.
- Zeigen Rattenschwanz Kollagen,sterile 10 x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), sterilem Wasser, steriler 1 N NaOH und Gallen Epithelzellen (BEC)-Medien (Tabelle 1) in der Gewebekultur Haube. Hinweis: Das Kollagen sollte auf Eis.
2. Gallenwegs Isolierung und Kultur
- Euthanize neugeborenen Mäusen zwischen 0-3 Tagen des Lebens, durch die Einwirkung von Kohlendioxid bis zum Unbewussten durch Genickbruch, pro IACUC Richtlinien (1C), gefolgt.
Hinweis: ältere Mäuse können in Abhängigkeit von bestimmten experimentellen Anforderungen verwendet werden. - Zeigen Tier in Rückenlage und machen einen kleinen horizontalen Schnitt Überqueren der Mittellinie im Bereich des Beckens. Erweitern Sie dieses Schnitt seitlich und bis beide Seiten des Bauches, bilden eine U-förmige Klappe. Schalten Klappe bis die Bauchorgane aus. Sobald das Abdomen geöffnet ist, vorsichtig bewegen die Eingeweide aus der Bauchhöhle in Richtung der rechten Seite des Tieres zur besseren Visualisierung der Leber und der Gallengang. Hinweis: es kann notwendig sein, um die seitlichen Einschnitte in den Brustkorb zu verlängern, um eine bessere Identifikation der Leber zu erhalten.
- Verwendung der Präpariermikroskop mit den gemeinsamen Gallengang, Leber und Darm. Identifizieren Sie den Gallengang erste (1D), mit Vorsicht, da die Strukturen sind sehr empfindlich. Mit den gezackten und nicht gezackten Zangen, akribisch sauber und holen Sie das Bindegewebe, einschließlich Fett rund um die Galle. Verwenden Sie eine Zange, um den Kanal und die andere zu reinigen halten.
- Verwenden Sie eine ähnliche Technik, um die Gallenblase zu reinigen.
- Legen Sie die gereinigten Produkte und Gallenblase in den ersten Teller der Isolationsmedien auf Eis. Massieren Sie die Strukturen mit den nicht gezahnten Pinzette während in den Medien, um weiter zu entfernen Bindegewebe und Galle aus der Gallenblase zu entfernen.
- Übertragen Kanäle und Gallenblase in die zweite Schale der Isolation Medien.
- Nach der Isolierung von Leitungen und Gallenblasen aus 5 Tieren, übertragen Sie dieStücke mit dem dritten Petrischale, in der Haube. Hinweis: Wenn Zellen von mehr als 5 Tieren isoliert werden sollen, tun in den Reihen, die mit frischen Lösungen für jede Gruppe von 5 Tieren.
- Bereiten dicken Kollagengelen in der Gewebekultur Haube:
Hinweis: jeder Größe Gericht verwendet werden können. Eine 60-mm-Kulturschale mit einem Endvolumen von 3 ml Kollagen für jede Gruppe von 5 Neugeborenen funktioniert gut. Dies sollte frisch zubereitet werden, zum Zeitpunkt der Einbettung frisch isolierten Leitungen.- Platzieren Rattenschwanzkollagen, sterile 10 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (10x PBS), steril dH 2 O und 1 N NaOH sterile auf Eis.
- Berechnung der Volumina von dH 2 0, 10x PBS, NaOH und Kollagen für Gele mit einer Endkonzentration von 2 mg / ml Kollagen in 1 × PBS erforderlich, mit einem Volumen von 1 N NaOH gleich 0,023 mal dem Volumen des Kollagens zugesetzt. Hinweis: Wenn alternative Quelle von Kollagen verwendet wird, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Neutralisation und Gel-Bildung.
- Mix zusammen dH 2 0, 10x PBS und 1 N NaOH, dann fügen Kollagen und Pipette auch, um sicherzustellen, sogar Vermischung.
- Sobald Kollagenlösung hat zu einer gelartigen Konsistenz bei Raumtemperatur verdickt, die sofort einbetten Kanäle im Kollagen.
- Legen in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min, um das Kollagen zu ermöglichen sich zu verfestigen.
- Sobald Gel (Farbwechsel von klar bis weiß), Überlagerung mit 3,5 ml BEC Medien (Tabelle 1) verfestigt und bei 37 ° C, 5% CO 2.
- BEC Medien entfernen 3 mal pro Woche und ersetzen mit 3,5 ml frischem Medium.
3. Isolaprimär Cholangiozyten von Dick Kollagengele
Hinweis: innerhalb von 3 Wochen, werden Blätter Cholangiozyten (Zellen mit großen Kernen, die sich direkt von Embedded-Kanäle) in der dicken Kollagen sichtbar sein. Wenn es eine große Zahl von Fibroblasten in die Schüssel, sollte sie verworfen werden. Wenn ein paar Regionen der Schüssel habenFibroblasten-Wachstums, können diese mit einem Skalpell geschnitten und vor der Aufspaltung der Cholangiozyten entfernt werden.
- Bereiten dünnen Kollagengelen:
- Verdünnen Kollagen in einer Konzentration von 1 mg / ml mit steriler PBS. Hinweis: Verwenden Sie 1 ml für 100-mm-Platte; entsprechend für andere Gerichte Größe anpassen.
- Verbreiten Sie die Kollagenlösung gleichmäßig mit einer Zelle Treuer (große Geschirr) oder Pipettenspitze (kleine Gerichte), dann lassen bei Raumtemperatur für 10 min.
- Platte mit DMEM/F12 und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 min.
- Entfernen Platte von Inkubator und waschen mit 1x PBS. Unmittelbar absaugen 1x PBS.
- Mantel mit einem zweiten dünnen Schicht aus Kollagen, die Verbreitung durch Drehen der Platte oder Platzierung Platte auf einem Schüttler. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 min.
- Nach Kollagen verfestigt hat, Abdeckplatte mit DMEM/F12 und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min.
- Split-Zellen von thick Kollagengelen:
- Mit Zellkulturzellschaber oder Spachtel, kratzen Kollagengel vorsichtig von der Platte, so daß sie schwimmt.
- Bereiten Collagenase-Lösung durch Verdünnen Typ XI Kollagenase (siehe Materialliste) auf 10 mg / ml mit DMEM/F12. Gut mischen und Sterilfilter.
- 1 ml der Collagenase-Lösung (oben) pro 60 mm-Schale von Zellen in dicken Kollagen. Die BEC-Medien (3 ml, das sollte sein) nicht entfernen. Inkubieren Schale für 30 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Entfernen Lösung, die Zellen und legen in 15 ml konischen Röhrchen.
- Spin down bei 2.200 xg für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet erneut aussetzen ähnliches Volumen von DMEM/F12.
- Spinnlösung erneut bei 2200 · g für 5 min. Überstand entfernen.
- Pellet in 3 ml 0,5% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min. Nach der Inkubation Pipette die Lösung auf und ab, brechen die Blätter Cholangiozyten. 5 ml BEC Medien einnd Spinnlösung bei 1.500 × g für 5 min.
- Überstand entfernen und Pellet in DMEM/F12, dann spinnen Lösung bei 1.500 xg für 5 min.
- Überstand entfernen und Pellet erneut aussetzen BEC Medien (Tabelle 1). Teller Zellen auf bisherigen dünnen Kollagen Gele.
4. Passage und Lagerung von Zellen
Hinweis: bei Bedarf können die Zellen auf dünnen Kollagengelen aufgeteilt werden.
- Vor der Inkubation in 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 10-15 min waschen Platten mit sterilem PBS.
- Neutralisieren mit einem gleichen Volumen von BEC Medien und pelletieren bei 1.500 × g für 5 min. Mit DMEM/F12 spülen Pellet, dann pelletieren bei 1.500 × g für 5 min.
- Die Zellen in BEC Medien für die Verteilung an Kollagen beschichtete Zellkulturschalen.
Hinweis: Alternativ können die Zellen in Speichermedien resuspendiert und in einem -80 ° C Gefrierschrank oder flüssiger Stickstoff (Tabelle 1) gespeichert werden.
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Representative Results
Die Verwendung dieses Protokoll Ergebnisse bei der Isolierung von einer Bevölkerung von neonatalen Maus extrahepatischen Cholangiozyten mit ausgezeichneter Reinheit, wie von K19 Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen (2A und 2B); wir ähnliche Ergebnisse erzielen Isolierung von Zellen aus erwachsenen Mäusen. Wir haben beobachtet, dass es dauert 3 Wochen für Zellen aus frisch isolierten Gallengänge zu Monoschichten auf dicken Kollagen-Gele bilden. Die Cholangiozyten wachsen in einer linearen Weise in der ganzen dicken Kollagen, Blattbildung von Zellen aus den isolierten Kanälen. Zellen sollten geteilt und werden auf dünnen Kollagengelen Re-Monoschichten überzogen, bevor überwuchert, da Löcher in den Blättern erscheinen von Zellen, wenn Kulturen nicht vor 3 Wochen aufgeteilt. Für ein optimales Zellwachstum und Fibroblasten Verunreinigung zu minimieren, ist es wichtig, die rund um die empfindlichen extrahepatischen Kanäle sorgfältig und genau während der Präparation und Reinigung der Schritte (2.3, 2.4) Bindegewebe zu entfernen. Wenn es das Wachstum von FibroblastenBlasten, die Entfernung von den betroffenen Bereich des dicken Kollagen mit einem Skalpell oder sanfte Absaugen kann die Übertragung von Fibroblasten vor der Aufspaltung Zellen zu reduzieren. Diese Zellen teilen sich schnell während der ersten drei Durchgänge bei höheren Durchtrittsstellen, verlangsamt sich die Wachstumsrate und die Zellen größer und Vakuolen werden. Wir haben erfolgreich eingefroren Proben Cholangiozyten und erneut plattiert sie zu einem späteren Zeitpunkt mit ausgezeichneter Durchführbarkeit; Cholangiozyten aufgetaut, aber nicht so schnell wie frisch isolierte und getrennte Zellen replizieren.
Abbildung 1. Chirurgische Ausrüstung sollte in der Nähe der Gewebekultur Gerät (A) eingestellt werden. Lichtquelle hinter dem Binokular gelegt. (B) Chirurgische Ausrüstung umfasst scharfe scissors, Gefäßklemme, eine gekrümmte Wellenschliff Pinzette, und eine gekrümmte un-gezahnten Pinzette (C);.. Größe einer 3 Tage alten Maus für Isolierungen verwendet (D) Pinzette halten den Gallengang in der Neugeborenen-Maus.
Abbildung 2. Reine Populationen von extrahepatischen Cholangiozyten mit minimaler Kontamination mit mesenchymalen Zellen isoliert. Cholangiozyten wurden mit K19 (grün) mit DAPI Kerndarstellung (blau) gefärbt. Maßstabsbalken, 25 um.
| Medien | Komponente | Menge |
| Gentamicin | 0,5 ml | |
| Penicillin-Streptomycin | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 ml | |
| Biliäre Epithelzellen (BEC) Medien | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 ml | |
| M EM nicht-essentielle Aminosäuren | 5 ml | |
| Insulin-Transferrin-Selen | 5 ml | |
| Na Pyruvat | 5 ml | |
| Chemisch definierte Lipidkonzentrat | 5 ml | |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml | |
| Gentamicin | 0,2 ml | |
| Ethanolamine | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor * | 5 ml | |
| L-Glutamin | 5 ml | |
| Rinderhypophysenextrakt | 1,1 ml | |
| Dexamethason * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-Triiod-L-Thyronin * | 0,5 ml | |
| Epidermalen Wachstumsfaktor * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Speichermedien (zum Einfrieren von Zellen) | Biliäre Epithelzellen (BEC) Medien | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Sterile FBS | 2 ml | |
| * Zutaten müssen auf geeignete Konzentrationen vor der Zugabe in Medien vorbereitet werden. Siehe Materialliste für weitere Anweisungen. | ||
Tabelle 1. Media-Komponenten.
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Discussion
Beschrieben wird hier eine Technik, um reine Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallenwege von Mäusen Mäuse aller Altersgruppen, einschließlich Neugeborenen zu isolieren. Die Technik bietet den Vorteil, dass extrahepatischen Cholangiozyten getrennt von intrahepatischen Cholangiozyten untersucht werden, und können Studien zu wichtigen Unterschiede zwischen diesen Populationen von Zellen identifizieren zu erleichtern. Wir haben vor kurzem eine Studie veröffentlicht, demonstrieren verringert Flimmerhärchen in extrahepatischen Cholangiozyten durch dieses Verfahren isoliert und mit Rhesusrotavirus 8 infiziert. Nachteile sind, dass die Technik ist arbeitsintensiv, und sorgfältige Präparation erforderlich ist, um Fibroblasten-Kontamination zu verhindern; Zusätzlich Auswuchs und mindestens 3 Wochen in Kultur erforderlich sind, um genügend Zellen für die meisten Experimente erhalten. So können diese Zellen mit Veränderungen zweidimensionalen Kultur auftreten können. Es ist noch nicht bestimmt worden, ob die erhaltenen Zellpopulationen enthalten erhebliche Zahl von Stammzellen oder Zells aus peribiliären Drüsen 9,10.
Wir haben versucht, diese Methode zu verwenden, um extrahepatische Cholangiozyten von Ratten isolieren; jedoch fehlerhaften Zellen in Kultur zu wachsen. Ob ein wesentlicher Wachstumsfaktor im Kulturmedium fehlt oder ob andere Bedingungen geändert werden müssen, wird derzeit untersucht.
Letztlich kann diese Methode zu extrahepatischen Cholangiozyten zu isolieren, um zu verstehen, Unterschiede in der intra-und extrahepatischen Gallen Formen der Fibrose, sowie Unterschiede zwischen Neugeborenen und Erwachsenen-Zellen beitragen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Molekularpathologie und Bildgebung Kern der UPenn NIDDK-Centrum für Molekulare Studien in Verdauungs-und Lebererkrankungen (P30 DK50306) für die Unterstützung bei Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01 DK-092111) und von der Fred und Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (zu RGW) und durch eine Gemeinschaft aus der Kindheit Liver Disease Research and Education Network (SK) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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