Summary
一种技术，从新生小鼠的肝外胆管胆管隔离描述。管道正在认真解剖，然后细胞被生长在厚厚的胶原凝胶中分离。该方法为研究肝外胆管发育和病理的有用工具。
Abstract
肝脏内和肝外胆管发育是不同的，并且可能会不同程度地影响某些疾病。然而，区域内和肝外胆管，新生儿和成人细胞之间的差异，都不能很好地理解。
方法从肝内胆管胆管的隔离是源远流长1-4。肝外导管细胞，特别是从新生儿的隔离，还没有被描述，尽管这将是有很大好处的理解不同的胆管群体之间的差异，并在研究的疾病，如胆道闭锁，似乎靶向肝外导管。这里描述的是一个优化的技术来隔离两个新生和成年小鼠肝外胆管细胞。这种技术产生一个纯粹的细胞群与细胞间质成纤维细胞样污染最小。
这METHOD基于切除肝外管和胆囊，其次是细致的解剖和刮去除脂肪和成纤维细胞层。结构被嵌入在胶原和培养的厚层为大约3周，以允许在胆管上皮细胞单层，然后可以用胰蛋白酶消化并重新接种于实验使用的产物。
Introduction
的内部和肝外胆管的起源和发展是明显不同的。肝脏从腹侧前肠内胚层5的憩室发展。憩室的尾部区域形成肝外胆管树，而颅区域产生肝内胆管树5。肝内胆管结石胆管是从祖细胞在围门 地区6得出周围的胆管板。这些细胞具有分化成肝细胞或胆管6的能力。这给了cholangiopathies可能专门针对一类胆管的显著临床意义。例如，胆道闭锁最初影响到新生儿的肝外管道，而Alagille综合征会影响肝内管道。
有肝内胆管和胆管单元从小鼠和大鼠的分离的多描述。在vestigators已经分离出单个细胞通过管道隔离和随后的产物，或者通过肝脏的消化和抗拔胆管表达特定的细胞表面标志物1-4下来。功能和偏光胆管单位已分离肝脏的消化和大小过滤7。胆管单元能够响应与分泌刺激物，并证明分泌液7，而孤立胆管细胞已被证明开发导管结构体外 1,2。这些方法的局限性包括需要专门的技术知识和专用设备肝脏灌注消化酶。此外，存在污染与间充质细胞3的危险。
阿来分离肝外胆管胆管，特别是从新生儿肝外胆管方法，过去一直没有被描述。本文概述了一个简化的技术来隔离一个新生儿结果好，成人肝外胆管细胞在高水平的纯度。这种技术将促进区域内和肝外胆管和研究像胆道闭锁的疾病，涉及肝外管机制之间的差异研究。
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Protocol
整个过程是在室温下，除非另有规定。所有的动物工作应经当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的协议下，人道的条件下进行。
设备1。制备及解决方案
- 在靠近所述组织培养罩和孵化器（ 图1A）设置在鼠标手术台。注：需要的设备包括一个解剖显微镜，光源，12.5厘米长的直虹膜剪，6寸非锯齿弯钳细的技巧，以及4英寸的锯齿钳尖端弯曲（ 图1B）。
- 放置消毒过的工具中的手术台70％酒精的玻璃烧杯中。
- 填3无菌60毫米培养皿用无菌隔离介质（ 表1）;将两个上手术台，一个在引擎盖，所有冰上。
- 将鼠尾胶原，无菌的10×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，无菌水，无菌1N NaOH中，并在组织培养罩胆管上皮细胞（BEC）的介质（ 表1）。注：胶原应在冰上。
2，胆道分离和培养
- 安乐死新生小鼠0-3天生活之间，通过暴露于二氧化碳直到无意识颈椎脱位，每IACUC准则（ 图1C）。
注：年纪较大的老鼠可以根据具体的实验需要使用。 - 将动物仰卧位，并作一个小切口横向穿越在骨盆区域的中线。横向和向上扩展此切口在腹部两侧，形成U形瓣。打开盖朝上，露出腹部器官。一旦腹部是开放的，小心地移动肠内，向着右侧的动物的腹腔内，以便更好地可视化在肝脏和胆总管。注意：这可能是必要的横向切口延伸进入胸腔，以获得更好的识别肝脏。
- 使用解剖显微镜，识别胆总管，肝和肠。确定胆总管第一（图1D），谨慎使用，因为结构非常细腻。随着锯齿和非锯齿钳，认真清洁，摘下结缔组织包括脂肪周围的胆汁。用一个镊子保持管道和清洁等。
- 使用类似的技术来清洁胆囊。
- 将清洗管和胆囊陷入孤立媒体对冰的第一道菜。轻轻按摩与非锯齿钳结构，同时在媒体上进一步去除结缔组织和胆囊胆汁中移除。
- 输送管和胆囊隔离介质的第二盘。
- 从5只动物管和胆囊的分离后，转移件到第三培养皿中，在通风橱中。注意：如果细胞是从超过5只动物中分离，做到分批，使用新鲜的解决方案，每组5只动物。
- 准备厚厚的胶原凝胶中的组织文化引擎盖：
注：任何尺寸的菜都可以使用。 60毫米培养皿用3毫升胶原每组5例新生儿的最终体积效果很好。这应该是在嵌入新鲜分离管道的时间准备新鲜。- 放置鼠尾胶原，无菌的10×磷酸盐缓冲盐水（10×PBS）中，无菌DH 2 O和无菌1N的NaOH在冰上。
- 计算DH 2 0，10倍PBS，NaOH和所需的凝胶用2毫克/毫升的胶原蛋白在1x PBS的终浓度的胶原蛋白的量，使用量的1N NaOH等于胶原的0.023倍的体积加入。注意：如果胶原蛋白的替代来源时，请遵循制造商的中和，形成凝胶的说明。
- 混合在一起DH 2 0，10X PBS中，加入1N NaOH，再加入胶原蛋白和吸管以及确保混合均匀。
- 一旦胶原溶液变稠到像在室温下稠度的凝胶，立刻嵌入到胶原的管道。
- 放置在培养箱中在37℃，5％CO 2中30分钟，使胶原蛋白固化。
- 一旦胶凝固后（由清晰到白的颜色变化），覆盖用3.5ml BEC媒体（ 表1），并在37℃，5％CO2。
- 删除BEC媒体，每周3次，并更换用3.5ml新鲜培养基中。
3，隔离主从粗胶原凝胶胆管
注：3个星期内，胆管（细胞直接从管道嵌入细胞核大延长）的表将在厚厚的胶原可见。如果有大量的盘成纤维细胞，它应该被丢弃。如果菜的少数地区有成纤维细胞生长，这些都可以切出用解剖刀和前分裂胆管中移除。
- 准备薄胶原凝胶：
- 胶原稀释至1毫克/毫升的浓度用无菌PBS。注：使用1毫升100毫米的钢板;因此对于其它尺寸的菜肴调整。
- 均匀分布的胶原蛋白溶液与细胞片（大菜）或移液管尖（小碟），然后在室温下放置10分钟。
- 盖板用DMEM/F12和孵化在37℃，5％CO2 10分钟。
- 从孵化器中取出盘子，洗用1×PBS。立即吸出的1X PBS。
- 涂层与第二薄层的胶原蛋白，通过旋转盘或在振荡器上放置板扩散。在37℃，5％CO 2的10分钟。
- 胶原蛋白后，已经凝固，盖板用DMEM/F12和孵化在37℃，5％CO2 30分钟。
- 从日拆分单元格ICK胶原凝胶：
- 用细胞培养抹刀或细胞刮刀，刮去胶原凝胶轻轻地落板，以便它是浮动的。
- 通过稀释式XI胶原酶（见材料清单），以10毫克/毫升用DMEM/F12制备胶原酶溶液。拌匀，无菌过滤器。
- 加入1 ml的胶原酶溶液（以上）每细胞的胶原厚60毫米菜。请勿移除BEC媒体（这应该是3毫升）。孵化培养皿30分钟，在37℃，5％CO 2。
- 除去溶液中含有的细胞，并将其放置在15ml锥形管中。
- 降速为2200×g离心5分钟。弃上清，重新悬浮颗粒的DMEM/F12类似的体积。
- 再纺丝溶液在2,200×g离心5分钟。除去上清液。
- 重悬沉淀在3毫升0.5％的胰蛋白酶，并在37℃，5％CO 2中5分钟。孵育后，吸取的溶液向上和向下打破了胆管的片材。加入5毫升BEC媒体在1500×g离心5分钟，第二纺丝溶液。
- 除去上清，重悬沉淀在DMEM/F12，然后旋溶液在1500×g离心5分钟。
- 除去上清液，并重新悬浮颗粒在BEC媒体（ 表1）。板细胞先前由薄胶原凝胶。
4，传代细胞和存储
注：细胞上薄胶原凝胶可以根据需要被分割。
- 用无菌PBS孵育在0.25％胰蛋白酶在37℃下10-15分钟之前洗平板。
- 中和与BEC媒体等体积的，并且沉淀在1500×g离心5分钟。冲洗沉淀用DMEM/F12，然后沉淀在1500×g离心5分钟。
- 悬浮细胞在BEC媒体分发到胶原蛋白包被细胞培养皿。
注意：可替换地，细胞可以被重悬浮在存储介质和存储在-80℃冰箱或液氮（ 表1）。
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Representative Results
在具有优良的纯度新生小鼠肝外胆管，具体表现为K19免疫荧光染色（ 图2A和2B）人口的隔离使用此协议的结果;我们实现了类似的结果从成年小鼠中分离细胞。我们观察到，它需要3周的时间从新鲜分离的胆管细胞形成的厚胶原凝胶单层。在胆管以线性方式增长整个厚胶原，形成细胞从分离的管道片。细胞应该分开并重新镀上很薄的胶原凝胶前单层变得杂草丛生，因为孔出现在细胞的表，如果培养前3周都没有分裂。为了获得最佳的细胞生长，并减少成纤维细胞的污染，它以去除认真细致地周围娇嫩的肝外管道在清扫和清洗步骤（2.3，2.4）的结缔组织是很重要的。如果存在成纤维生长爆炸，去除厚胶原蛋白的患处用手术刀或温柔吸痰可以减少成纤维细胞的细胞分裂前的转移。在最初的三段这些细胞快速分裂，但在更高的通道点，增长速度减慢，细胞变大，空泡化。我们已经成功地冻结胆管的样品，并在稍后的时间与优秀的生存能力再镀他们;解冻胆管，但是，不要复制一样快，新鲜分离和分裂的细胞。
图1。手术设备应设置在靠近组织培养装置（A）光源放置在解剖显微镜后面。（二）手术设备包括锋利的SCissors，止血钳，弯曲的锯齿形镊子，以及一个弯曲的非锯齿镊子（C）;。大小的3日龄小鼠用于隔离（D）的镊子夹持胆总管在新生小鼠。
图2。肝外胆管的纯种群隔离与间充质细胞污染最小。胆管沾满K19（绿色）用DAPI核成像（蓝色）。比例尺为25微米。
| 媒体 | 元件 | 量 |
| 庆大霉素 | 0.5毫升 | |
| 青霉素，链霉素 | 0.5毫升 | |
| 两性霉素B | 0.5毫升 | |
| DMEM/F12（1:1） | 5毫升 | |
| 胆管上皮细胞（BEC）媒体 | FBS | 25毫升 |
| DMEM/F12（1:1） | 500毫升 | |
| M EM非必需氨基酸 | 5毫升 | |
| 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 | 5毫升 | |
| 丙酮酸钠 | 5毫升 | |
| 化学上定义的脂质的浓缩 | 5毫升 | |
| 青霉素，链霉素 | 5毫升 | |
| 庆大霉素 | 0.2毫升 | |
| 乙醇胺 | 0.13毫升 | |
| 5毫升 | ||
| 大豆胰蛋白酶抑制剂* | 5毫升 | |
| L-谷氨酰胺 | 5毫升 | |
| 牛垂体提取物 | 1.1毫升 | |
| 地塞米松* | 0.5毫升 | |
| 3,3'，5 - 三碘-L-甲状腺原氨酸* | 0.5毫升 | |
| 表皮生长因子* | 0.5毫升 | |
| 5毫升 | ||
| 两性霉素B | 1毫升 | |
| 存储介质（冷冻细胞） | 胆管上皮细胞（BEC）媒体 | 7毫升 |
| DMSO | 1毫升 | |
| 无菌胎牛血清 | 2毫升 | |
| *成份需要添加到媒体前要准备适当的浓度。请参阅材料清单作进一步说明。 | ||
表1。媒体组件。
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Discussion
这里描述的是一种技术，从各年龄段，包括新生儿的小鼠的小鼠的肝外胆管分离出纯的胆管。该技术的优点是肝外胆管可分别从肝内胆管细胞进行研究，并可能促进研究，以确定细胞的这些人群之间的主要区别。我们最近发表了一份研究报告，证明在肝外胆管分离这种方法和感染恒河猴轮状病毒8下降纤毛。缺点包括该技术是劳动密集，细致的解剖要求，以防止成纤维细胞污染;另外，生长和至少3周的文化都需要获得足够的细胞大多数实验。因此，这些细胞可以反映与二维培养相关的变化。它尚未确定获得的细胞群中是否包括显著量的干细胞或细胞的S来自胆管周围腺体9,10。
我们试图用此方法从大鼠分离肝外胆管;然而，细胞不能在文化增长。一个关键生长因子是否缺少在文化传媒，还是其他条件需要修改，目前正在调查中。
最后，该方法以分离肝外胆管可能有助于理解在胆道纤维化的帧内和肝外形式的差异，以及新生和成年细胞之间的差异。
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Disclosures
作者宣称自己有没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢宾夕法尼亚大学NIDDK中心分子生物学研究中消化的分子病理学和影像核心和肝脏疾病（P30 DK50306）与成像协助。这项工作是由赠款从美国国立卫生研究院（R01 DK-092111）和弗雷德和Suzanne比泽克小儿肝病中心（以RGW），并从儿童肝脏疾病研究和教育网络（向SK）的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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