Summary
Een techniek om cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van neonatale muizen wordt beschreven. De kanalen zijn zorgvuldig ontleed en vervolgens cellen worden geïsoleerd door uitgroei in dikke collageen gels. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het bestuderen van extrahepatische galwegen ontwikkeling en pathologie.
Abstract
De intra-en extrahepatische galwegen van de lever zijn ontwikkelingsgebied onderscheiden, en kan verschillend worden beïnvloed door bepaalde ziekten. De verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en tussen neonatale en volwassen cellen, zijn niet goed begrepen.
Methoden voor de isolatie van cholangiocyten van intrahepatische galwegen zijn goed ingeburgerd 1-4. Isolatie van extrahepatische ductale cellen, vooral van de pasgeborene, nog niet beschreven, hoewel dit van groot nut zou zijn in het begrijpen van de verschillen tussen verschillende populaties cholangiocyte en bestuderen ziekten zoals biliaire atresie die lijken de extrahepatische kanalen richten. Hier beschreven is een geoptimaliseerde techniek om zowel neonatale en volwassen muis extrahepatische galwegen cellen te isoleren. Deze techniek levert een zuivere celpopulatie met minimale verontreiniging van mesenchymale cellen zoals fibroblasten.
Deze methodiekd is gebaseerd op de verwijdering van de extrahepatische leidingen en galblaas, gevolgd door zorgvuldige dissectie en schrapen om vet en fibroblast lagen te verwijderen. Structuren zijn ingebed in dikke lagen collageen en gekweekt gedurende ongeveer 3 weken tot uitgroei van cholangiocyten in monolagen, die vervolgens kunnen worden getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat voor experimenteel gebruik mogelijk.
Introduction
De oorsprong en de ontwikkeling van intra-en extrahepatische cholangiocyten aanzienlijk verschillen. De lever ontwikkelt uit een divertikel van de ventrale foregut endoderm 5. De caudale regio van de divertikel vormt de extrahepatische galwegen, terwijl de craniale regio genereert de intrahepatische galwegen 5. Intrahepatic kanaal cholangiocyten zijn afgeleid van stamcellen rond de ductale plaat in de peri portal regio 6. Deze cellen hebben het vermogen om te differentiëren in ofwel hepatocyten of cholangiocyten 6. Dit heeft belangrijke klinische implicaties aangezien cholangiopathies specifiek kan richten op een categorie cholangiocyten. Bijvoorbeeld, galgangatresie aanvankelijk van invloed op de extrahepatische leidingen van de pasgeborene, terwijl Alagille syndroom treft intrahepatic kanalen.
Zijn er meerdere beschrijvingen van de isolatie van intrahepatische cholangiocyten en galwegen eenheden van muizen en ratten. Investigators hebben enkele cellen geïsoleerd door kanaal isolatie en vervolgens uitgroei, of door de lever spijsvertering en antilichaam pull down van cholangiocyten expressie van specifieke celoppervlaktemerkers 1-4. Functionele en gepolariseerde galwegen units zijn geïsoleerd door de lever spijsvertering en grootte filtratie 7. Galgang eenheden kunnen reageren op stimuli secretoire en demonstreren vloeistofsecretie 7, terwijl geïsoleerd cholangiocyten is aangetoond ductulaire structuren in vitro 1,2. Beperkingen van deze methoden omvatten de behoefte aan gespecialiseerde technische expertise en speciale apparatuur voor leverperfusie met spijsverteringsenzymen. Bovendien is er een risico van besmetting met mesenchymale cellen 3.
Werkwijze voor extrahepatische galwegen cholangiocyten isoleren, in het bijzonder van neonatale extrahepatische galwegen, is niet eerder beschreven. Dit document schetst een vereenvoudigde methode om neonatale een isolerens en de meerderjarige extrahepatische galwegen cellen op een hoog niveau van zuiverheid. Deze techniek zal de studie van de verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en onderzoek naar de mechanismen van ziekten zoals galgangatresie dat de extrahepatische kanalen betrekken vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De gehele procedure wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Alle dierlijke werkzaamheden moeten onder menswaardige omstandigheden onder een protocol door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) zijn goedgekeurd.
1. Voorbereiding van apparatuur en oplossingen
- Stel de muis operatietafel dicht bij de weefselkweek kap en incubator (figuur 1A). Opmerking: Vereist apparatuur omvat een dissectie microscoop, een lichtbron, 12,5 cm lange rechte iris schaar, 6 inch niet gekartelde gebogen pincet met fijne tips, en 4 inch gekarteld pincet met gebogen tips (Figuur 1B).
- Plaats gesteriliseerde instrumenten in een bekerglas van 70% alcohol op de operatietafel.
- Vul drie steriele 60 mm petrischalen met steriele isolatiemedia (tabel 1); plaats twee op chirurgische tafel en een in kap, alle op het ijs.
- Plaats rattenstaart collageen,steriel 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), steriel water, steriel 1 N NaOH en biliaire epitheelcellen (BEC) media (tabel 1) in de weefselkweek kap. Opmerking: Het collageen moet op ijs.
2. Bile Duct Isolatie en Cultuur
- Euthanaseren neonatale muizen tussen 0-3 dagen van het leven, door blootstelling aan kooldioxide tot onbewuste gevolgd door cervicale dislocatie, per IACUC richtlijnen (figuur 1C).
Let op: oudere muizen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de specifieke experimentele behoeften. - Plaats dier in rugligging en maak een kleine horizontale incisie oversteken van de middellijn in de regio van het bekken. Verlengen incisie zijdelings en omhoog weerszijden van de buik, die een U-vormige flap. Zet flap tot de buikorganen bloot. Zodra de buik geopend voorzichtig bewegen de ingewanden uit de buikholte naar de rechterkant van het dier voor een betere visualisatie van de lever en galbuis. Opmerking: het kan noodzakelijk zijn om de zijdelingse insnijdingen uitstrekken in de ribbenkast betere identificatie van de lever te verkrijgen.
- Met de microscoop ontleden, wat de gemeenschappelijke galkanaal, lever en darmen. Identificeer de galbuis eerst (figuur 1D), met voorzichtigheid, omdat de structuren zeer delicaat. Met de gekartelde en niet gekartelde tang, zorgvuldig schoon en kies uit het bindweefsel met inbegrip van vet rondom de gal. Gebruik een tang om de buis en de andere schoon te houden.
- Gebruik een soortgelijke techniek om de galblaas reinigen.
- Plaats de gereinigde leidingen en galblaas in de eerste schotel van isolatie media op ijs. Masseer zachtjes de structuren met de niet getande tang, terwijl in de media om verder te verwijderen bindweefsel en verwijder gal uit de galblaas.
- Transfer leidingen en galblaas naar de tweede gerecht van isolatie media.
- Na isolatie van leidingen en gallbladders uit 5 dieren, de overdracht van destukjes op de derde petrischaal, in de kap. Opmerking: Als cellen worden geïsoleerd van meer dan 5 dieren doen batches met verse oplossingen voor elke groep van 5 dieren.
- Bereid dikke collageen gels in de weefselkweek kap:
Opmerking: elke maat schotel kan worden gebruikt. Een 60 mm kweekschaal met een eindvolume van 3 ml collageen voor elke groep van 5 pasgeborenen werkt goed. Dit moet vers worden bereid bij de inbedding vers geïsoleerde leidingen.- Plaats rattenstaart collageen, 10x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (10x PBS), steriele dH 2 O en steriel 1 N NaOH op ijs.
- Bereken het volume van dH 2 0, 10x PBS, NaOH en collageen nodig gels met een eindconcentratie van 2 mg / ml collageen in 1x PBS, met een volume van 1 N NaOH gelijk aan 0,023 keer het volume van collageen toegevoegd. Opmerking: Als alternatieve bron van collageen wordt gebruikt, volg dan de instructies van de fabrikant voor neutralisatie en gelvorming.
- Meng dH 2 0, 10x PBS, en 1 N NaOH, voeg dan collageen en pipet goed te zorgen voor een gelijkmatige menging.
- Zodra collageenoplossing is ingedikt tot een gel-achtige consistentie bij kamertemperatuur onmiddellijk insluiten de kanalen in het collageen.
- Plaats in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 minuten aan het collageen mogelijk te stollen.
- Zodra gel (kleur verandert van helder tot wit), overlay met 3,5 ml van BEC media (tabel 1) is gestold en incubeer bij 37 ° C, CO 5% 2.
- Verwijder BEC media 3 keer per week en te vervangen door 3,5 ml vers medium.
3. Isoleren Primaire cholangiocyten van Dik collageengels
Opmerking: binnen 3 weken, zal vellen cholangiocyten (cellen met grote kernen rechtstreeks uitstrekt van ingebedde leidingen) zichtbaar in de dikke collageen. Als er grote aantallen van fibroblasten in de schaal moet worden weggegooid. Als een enkele regio's van het gerecht hebbenfibroblastgroeifactor, kunnen deze worden uitgesneden met een scalpel en voor het splitsen van de cholangiocyten verwijderd.
- Bereid dunne collageen gels:
- Verdun collageen tot een concentratie van 1 mg / ml met steriele PBS. Merk op: 1 ml voor 100 mm plaat; dienovereenkomstig aan te passen voor andere grootte gerechten.
- Spreid het collageen oplossing gelijkmatig met een mobiele spreader (grote borden) of pipet (kleine gerechten), dan laat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Afdekplaat met DMEM/F12 en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 minuten.
- Verwijder de plaat uit incubator en wassen met 1x PBS. Onmiddellijk zuig het 1x PBS.
- Jas met een tweede laagje collageen, verspreiding door het draaien van de plaat of het plaatsen van bord op een shaker. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 minuten.
- Nadat collageen gestold, afdekplaat met DMEM/F12 en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Splits cellen van thick collageengels:
- Met celkweek spatel of celschraper, schraap collageen gel voorzichtig van de plaat, zodat het drijft.
- Bereid collagenase oplossing door verdunnen Type XI collagenase (zie materialen) tot 10 mg / ml met DMEM/F12. Meng goed en steriel filter.
- Voeg 1 ml collagenase oplossing (hierboven) per 60 mm schaal cellen in dikke collageen. Raak de BEC media (die moet worden 3 ml) niet verwijderen. Incubeer schotel voor 30 min bij 37 ° C, 5% CO2.
- Verwijder oplossing bevattende cellen en plaatsen in 15 ml conische buis.
- Spin down bij 2200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en opnieuw pellet op te schorten in eenzelfde volume DMEM/F12.
- Spin oplossing opnieuw bij 2200 g gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant.
- Resuspendeer pellet in 3 ml 0,5% trypsine en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 minuten. Na incubatie pipet de oplossing op en neer te breken van de bladen van cholangiocyten. Voeg 5 ml BEC media eennd rotatie oplossing bij 1500 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet in DMEM/F12, dan draaien oplossing bij 1500 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en opnieuw pellet schorsen BEC media (tabel 1). Plaat cellen op eerder gemaakte dunne collageen gels.
4. Passage en opslag van cellen
Opmerking: cellen op dunne collageen gels kan worden gesplitst indien nodig.
- Was platen met steriele PBS vóór incuberen in 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 10-15 minuten.
- Neutraliseren met een gelijk volume BEC media en pellet bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Spoel pellet met DMEM/F12, dan pellet bij 1500 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer cellen in BEC media voor distributie aan collageen gecoate celkweekschalen.
Opmerking: Als alternatief kunnen cellen worden geresuspendeerd opslagmedium en opgeslagen in een -80 ° C vriezer of vloeibare stikstof (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van dit protocol resulteert in de isolatie van een populatie van neonatale muis extrahepatische cholangiocyten met uitstekende zuiverheid, zoals aangetoond door K19 immunofluorescentiekleuring (Figuren 2A en 2B); we vergelijkbare resultaten isoleren van cellen van volwassen muizen te bereiken. We hebben waargenomen dat het duurt 3 weken voor de cellen van vers geïsoleerde galwegen om monolagen op dikke collageen gels te vormen. De cholangiocyten groeien lineair hele dikke collageen, die vellen van cellen van de geïsoleerde buizen. De cellen moeten worden gesplitst en opnieuw uitgeplaat op dunne collageengels voordat monolagen overwoekerd, daar verschijnen er gaten in de bladen van cellen als culturen niet worden gesplitst vóór 3 weken. Voor optimale celgroei en fibroblast besmetting te minimaliseren, is het belangrijk dat het bindweefsel rond de delicate extrahepatische leidingen zorgvuldig en nauwkeurig tijdens de dissectie en reinigingsstappen (2.3, 2.4) te verwijderen. Als er groei van fibroontploffing, verwijdering van het getroffen gebied van dikke collageen met een scalpel of zachte afzuiging kan de overdracht van fibroblasten vóór splitsing cellen verminderen. Deze cellen delen zich snel tijdens de eerste drie passages maar bij hogere passage punten, de groei vertraagt, en de cellen worden groter en gevacuoliseerde. We hebben met succes ingevroren monsters van cholangiocyten, en opnieuw verguld ze op latere tijdstippen met uitstekende levensvatbaarheid; ontdooid cholangiocyten echter niet zo snel als vers geïsoleerde en splitsen cellen repliceren.
Figuur 1. Chirurgische apparatuur moet worden ingesteld in de nabijheid van weefselkweek apparatuur. (A) Lichtbron wordt geplaatst achter de dissectiemicroscoop. (B) Chirurgische apparatuur omvat scherpe scissors, hemostaat, een gebogen gekartelde pincet en een gebogen un-getande pincet (C);.. Grootte van een 3 dagen oude muis gebruikt voor isolaties (D) pincet houden de galbuis in de neonatale muis.
Figuur 2. Zuivere populaties van extrahepatische cholangiocyten zijn geïsoleerd met minimale besmetting met mesenchymale cellen. Cholangiocyten werden gekleurd met K19 (groen) met DAPI nucleaire beeldvorming (blauw). Schaalbalken, 25 urn.
| Media | Bestanddeel | Bedrag |
| Gentamicine | 0,5 ml | |
| Penicilline-streptomycine | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (01:01) | 5 ml | |
| Biliaire epitheelcellen (BEC) Media | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (01:01) | 500 ml | |
| M EM niet-essentiële aminozuren | 5 ml | |
| Insuline-transferrine-selenium | 5 ml | |
| Na Pyruvaat | 5 ml | |
| Chemisch gedefinieerde lipide concentraat | 5 ml | |
| Penicilline-streptomycine | 5 ml | |
| Gentamicine | 0,2 ml | |
| Ethanolamine | 0.13 ml | |
| 5 ml | ||
| Sojaboontrypsineremmer * | 5 ml | |
| L-glutamine | 5 ml | |
| Runder-extract | 1.1 ml | |
| Dexamethason * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-trijood-L-thyronine * | 0,5 ml | |
| Epidermale groeifactor * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Storage Media (voor het invriezen van cellen) | Biliaire epitheelcellen (BEC) media | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Steriel FBS | 2 ml | |
| * Ingrediënten moeten bereid zijn om geschikte concentraties voor het toevoegen van in de media. Raadpleeg de lijst van materialen voor verdere instructies. | ||
Tabel 1. Media componenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven is een techniek om zuivere cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van muizen muizen van elke leeftijd, inclusief pasgeborenen. De techniek biedt het voordeel dat extrahepatische cholangiocyten afzonderlijk kunnen worden bestudeerd vanuit intrahepatische cholangiocyten en kan studies belangrijkste verschillen tussen deze populaties van cellen te identificeren vergemakkelijken. We hebben onlangs een studie gepubliceerd demonstreren afgenomen cilia in extrahepatic cholangiocyten geïsoleerd door deze methode en geïnfecteerd met rhesus rotavirus 8. Nadelen zijn dat de techniek arbeidsintensief en zorgvuldige dissectie moet fibroblast voorkomen; bovendien uitgroei en minstens 3 weken in kweek moeten voldoende cellen voor de meeste experimenten te verkrijgen. Aldus kunnen deze cellen veranderingen geassocieerd met twee dimensionale cultuur weerspiegelen. Het is nog niet vastgesteld of de celpopulaties verkregen zijn grote aantallen stamcellen of cellens van peribiliary klieren 9,10.
We hebben geprobeerd om deze methode te gebruiken om extrahepatische cholangiocyten isoleren van ratten; echter cellen niet groeien in kweek. Of het nu een belangrijke groeifactor ontbreekt in de cultuur media en of andere voorwaarden moeten worden veranderd wordt momenteel onderzocht.
Uiteindelijk kan deze methode extrahepatische cholangiocyten isoleren bijdragen aan het begrijpen van verschillen in intra-en extrahepatische vormen van biliaire fibrose, en de verschillen tussen neonatale en volwassen cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de Moleculaire Pathologie en Imaging Core van de UPenn NIDDK Center for Molecular Studies in Digestive en Leverziekten (P30 DK50306) voor hulp bij beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 DK-092111) en uit de Fred en Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (tot RGW) en door een beurs van de Childhood Liver Disease Research and Education Network (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
