Summary
Une technique pour isoler cholangiocytes des voies biliaires extra-hépatiques de souris néonatale est décrite. Les conduits sont méticuleusement disséqués, puis les cellules sont isolées par l'excroissance dans des gels de collagène épaisses. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier extrahépatique bile développement conduit et la pathologie.
Abstract
Les canaux biliaires intra et extra-hépatiques du foie sont distincts de développement, et peuvent être affectés différemment par certaines maladies. Toutefois, les différences entre cholangiocytes intra et extra-hépatiques, et entre les cellules néonatales et adultes, ne sont pas bien comprises.
Méthodes pour l'isolement de cholangiocytes de canaux biliaires intra-hépatiques sont bien établis 1-4. Isolement de cellules canalaires extra-hépatiques, en particulier du nouveau-né, n'a pas encore été décrit, bien que ce serait d'une grande utilité dans la compréhension des différences entre les populations de cholangiocytes distinctes et dans l'étude des maladies telles que l'atrésie biliaire qui semblent cibler les canaux extra-hépatiques. Décrit ici est une technique optimisée pour isoler les cellules des voies biliaires extra-hépatiques deux nouveau-nés et de la souris adulte. Cette technique donne une population de cellules avec une contamination minimale pur à partir de cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes.
Cette méthod est basé sur l'enlèvement des canaux extra-hépatiques et de la vésicule biliaire, suivie par une dissection minutieuse et gratter pour enlever les couches de graisse et des fibroblastes. Les structures sont noyées dans des couches épaisses de collagène et cultivées pendant 3 semaines environ pour permettre excroissance de cholangiocytes en monocouches, qui peuvent ensuite être traitées à la trypsine et étalées re pour une utilisation expérimentale.
Introduction
L'origine et le développement de cholangiocytes intra et extra-hépatiques sont nettement différents. Le foie se développe à partir d'un diverticule de l'intestin antérieur endoderme ventral 5. La région caudale du diverticule forme l'arbre biliaire extra-hépatique, tandis que la région crânienne génère l'arbre biliaire intrahépatique 5. Cholangiocytes de conduits intrahépatiques sont dérivées de cellules progénitrices autour de la plaque canalaire dans les régions péri portail 6. Ces cellules ont la capacité de se différencier en hépatocytes ou soit des cholangiocytes 6. Cela a d'importantes implications cliniques étant donné que cholangiopathies peuvent cibler spécifiquement une catégorie de cholangiocytes. Par exemple, l'atrésie biliaire affecte d'abord les canaux extra-hépatiques du nouveau-né, alors que le syndrome d'Alagille affecte voies biliaires intrahépatiques.
Il existe des descriptions multiples de l'isolement des cholangiocytes intra-hépatiques et les unités de la voie biliaire à partir des souris et des rats. Dansinvestigateurs ont isolé des cellules individuelles par l'isolement de la gaine et l'excroissance subséquente, ou par digestion du foie et de la tirer vers le bas anticorps cholangiocytes exprimant des marqueurs de surface cellulaire spécifiques 4.1. Les unités des canaux biliaires fonctionnels et polarisés ont été isolées par digestion du foie et de la filtration de la taille 7. Biliaires unités de conduits sont capables de répondre à des stimuli de sécrétion et de démontrer la sécrétion de liquide 7, tandis que il a été démontré cholangiocytes isolés à développer des structures canalaire in vitro 1,2. Limites de ces méthodes comprennent la nécessité d'une expertise technique spécialisée et un équipement spécial pour la perfusion du foie avec des enzymes digestives. En outre, il existe un risque de contamination par des cellules mésenchymateuses 3.
Procédé pour isoler extrahépatiques cholangiocytes des canaux biliaires, en particulier de voies biliaires extra-hépatiques néonatales, n'a pas été précédemment décrit. Le présent document décrit une technique simplifiée pour isoler un nouveau-nés ainsi que des cellules des canaux biliaires extra-hépatiques adultes à des niveaux élevés de pureté. Cette technique facilitera l'étude des différences entre cholangiocytes et la recherche sur les mécanismes des maladies comme atrésie des voies biliaires qui impliquent les conduits extra-hépatiques et extra-hépatiques intra.
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Protocol
Toute la procédure est effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. Tous les travaux des animaux doit être effectué dans des conditions humaines en vertu d'un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection des locaux et l'utilisation des animaux (IACUC).
1. Préparation de l'équipement et Solutions
- Mettre en place la table chirurgicale de la souris à proximité de la hotte de culture de tissu et l'incubateur (Figure 1A). Remarque: L'équipement nécessaire comprend un microscope de dissection, une source de lumière, de 12,5 cm de long ciseaux iris droites, 6 pouces pince courbe en dents de scie non avec des pointes fines, et 4 pouces de pince dents de scie avec des pointes courbes (figure 1B).
- Placez instruments stérilisés dans un bécher en verre de 70% d'alcool sur la table d'opération.
- Remplir trois 60 mm boîtes de Pétri stériles avec les médias de l'isolement stérile (tableau 1); placer deux sur la table chirurgicale et un dans le capot, le tout sur la glace.
- Placez collagène de queue de rat,stérile 10x tampon phosphate salin (PBS), de l'eau stérile, NaOH stérile 1 et biliaire cellules épithéliales (BEC) des médias (tableau 1) dans la hotte de culture de tissus. Remarque: Le collagène doit être sur la glace.
2. Cholagogue Isolement et culture
- Euthanasier les souris néonatale entre 0-3 jours de la vie, par exposition au dioxyde de carbone jusqu'à inconscient suivie par dislocation cervicale, conformément aux lignes directrices du IACUC (figure 1C).
Remarque: les souris plus âgées peuvent être utilisés en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. - Placer l'animal en décubitus dorsal et une petite incision horizontale traversant la ligne médiane dans la région du bassin. Étendre cette incision latéralement et vers le haut des deux côtés de l'abdomen, en formant un rabat en forme d'U. Tournez rabat pour exposer les organes abdominaux. Une fois que l'abdomen est ouvert, déplacer soigneusement les intestins hors de la cavité abdominale vers la droite de l'animal pour une meilleure visualisation du foie et de la voie biliaire principale. Remarque: il peut être nécessaire d'étendre les incisions latérales dans la cage thoracique d'obtenir une meilleure identification du foie.
- Utilisation du microscope à dissection, d'identifier la voie biliaire, du foie et des intestins. Identifier le canal cholédoque premier (figure 1D), en utilisant la prudence, car les structures sont très délicates. Avec les pinces dentelées et non dentelées, méticuleusement propre et enlever le tissu conjonctif y compris la graisse autour de la bile. Utiliser une pince pour maintenir le conduit et l'autre pour le nettoyage.
- Utiliser une technique similaire pour nettoyer la vésicule biliaire.
- Placer les conduits nettoyés et la vésicule biliaire dans le premier plat de milieux d'isolement sur la glace. Massez doucement les structures avec les forceps non dentelés tandis que dans les médias pour éliminer davantage le tissu conjonctif et enlever la bile de la vésicule biliaire.
- Transférer les conduits et la vésicule biliaire à la deuxième plat de milieux d'isolement.
- Après isolement de conduites et de la vésicule biliaire à partir de 5 animaux, transférer lepièces à la troisième boîte de Pétri, dans la hotte. Remarque: si les cellules doivent être isolé à partir de plus de cinq animaux, faire en lots, en utilisant des solutions fraîches pour chaque groupe de 5 animaux.
- Préparer des gels de collagène épais dans la hotte de culture de tissus:
Remarque: tous les plats de taille peut être utilisé. Une boîte de culture de 60 mm avec un volume final de 3 ml de collagène pour chaque groupe de 5 nouveau-nés fonctionne bien. Ce doit être préparé au moment de l'intégration conduits fraîchement isolés.- Placer rat tail collagène, 10x stérile saline tamponnée au phosphate (PBS 10x), dH 2 O stérile, et N NaOH stérile sur de la glace 1.
- Calculer les volumes de dH 2 0, 10x PBS, NaOH, et le collagène nécessaire pour des gels ayant une concentration finale de 2 mg / ml de collagène dans du PBS 1x, en utilisant un volume de 1 N de NaOH égale à 0,023 fois le volume de collagène ajoutée. Remarque: Si autre source de collagène est utilisé, suivre les instructions du fabricant pour la neutralisation et la formation de gel.
- Mélanger dH 2 0, 10x PBS, et 1 N NaOH, puis ajouter le collagène et pipette bien pour assurer un mélange homogène.
- Une fois que la solution de collagène est épaissie à une consistance de gel à la température ambiante, immédiatement incorporer les conduits dans le collagène.
- Placer à l'étuve à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 30 minutes pour permettre au collagène de se solidifier.
- Une fois gel a solidifié (couleur passe de transparent à blanc), superposition avec 3,5 ml de milieu BEC (tableau 1) et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Retirez le support BEC 3 fois par semaine et le remplacer par 3,5 ml de milieu frais.
3. Cholangiocytes à isolation primaire du collagène épais Gels
Remarque: dans les 3 semaines, feuilles de cholangiocytes (cellules avec de gros noyaux s'étendant directement à partir de conduits intégrés) seront visibles dans le collagène d'épaisseur. Si il ya un grand nombre de fibroblastes dans le plat, il doit être jeté. Si quelques régions du plat ontcroissance de fibroblastes, ceux-ci peut être découpé avec un scalpel et enlevée avant le fractionnement des cholangiocytes.
- Préparer minces gels de collagène:
- Diluer le collagène à une concentration de 1 mg / ml avec du PBS stérile. Remarque: utiliser 1 ml pour 100 plaque mm; ajuster en conséquence pour d'autres plats de taille.
- Fais la solution de collagène uniformément avec une spatule de cellule (grands plats) ou de la pointe de la pipette (petits plats), puis laisser à température ambiante pendant 10 min.
- Couvrir la plaque avec DMEM/F12 et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 10 min.
- Retirer la plaque de l'incubateur et laver avec du PBS 1X. Aspirer immédiatement 1x PBS.
- Manteau avec une seconde couche mince de collagène, d'étalement par rotation de la plaque ou plaque de placer sur un agitateur. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 10 min.
- Après collagène est solidifié, la plaque de couverture avec DMEM/F12 et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 30 min.
- Diviser les cellules de egels ick de collagène:
- Avec une spatule de culture cellulaire ou d'un grattoir de cellules, gratter doucement gel de collagène de la plaque de sorte qu'elle est flottant.
- Préparer une solution de collagénase en diluant de type XI collagénase (voir la liste des matériaux) à 10 mg / ml avec DMEM/F12. Mélangez bien et filtre stérile.
- Ajouter 1 ml de solution de collagénase (ci-dessus) par boîte de 60 mm de cellules en collagène d'épaisseur. Ne retirez pas le support BEC (qui devrait être de 3 ml). Incuber plat pendant 30 min à 37 ° C, 5% CO 2.
- Retirer la solution contenant des cellules, et placer dans 15 ml de tube conique.
- Isoler à 2200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre suspendre le culot dans un volume similaire de DMEM/F12.
- Spin nouveau solution à 2200 g pendant 5 min. Retirer le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 3 ml de trypsine à 0,5%, et les incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 5 min. Après incubation, la pipette la solution de haut en bas pour briser les feuilles de cholangiocytes. Ajouter 5 ml de BEC médias unesolution de filage ème à 1500 g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre le culot en DMEM/F12, puis tourner solution à 1500 g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et re suspendre le culot dans les médias BEC (tableau 1). Cellules de la plaque sur faites précédemment minces gels de collagène.
4. Passage et le stockage des cellules
Note: les cellules minces sur des gels de collagène peuvent être divisées selon les besoins.
- Laver les plaques avec du PBS stérile avant l'incubation dans 0,25% de trypsine à 37 ° C pendant 10 à 15 min.
- Neutraliser avec un volume égal de milieu BEC, et un culot à 1500 g pendant 5 min. Rincer culot avec DMEM/F12, alors culot à 1500 g pendant 5 min.
- Resuspendre les cellules dans des milieux BEC pour la distribution de collagène revêtu des boîtes de culture cellulaire.
Remarque: En variante, les cellules peuvent être remises en suspension dans un support de stockage et stockées dans un congélateur C -80 ° ou de l'azote liquide (tableau 1).
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Representative Results
L'utilisation de ce protocole les résultats dans l'isolement d'une population de nouveau-nés cholangiocytes extra-hépatiques de souris avec une excellente pureté, tel que démontré par K19 immunofluorescence (Figures 2A et 2B); nous obtenons des résultats similaires à isoler des cellules de souris adultes. Nous avons observé que cela prend 3 semaines pour les cellules de canaux biliaires fraîchement isolées pour former des monocouches sur des gels de collagène épais. Les cholangiocytes croître de façon linéaire tout au long de l'épaisseur du collagène, en formant des feuilles de cellules provenant des conduits isolés. Les cellules doivent être divisés et ré-étalées sur de minces gels de collagène avant monocouches envahies par la végétation, car des trous apparaissent dans les feuilles de cellules si les cultures ne sont pas divisés avant trois semaines. Pour une croissance cellulaire optimale et pour réduire au minimum la contamination des fibroblastes, il est important de retirer le tissu conjonctif environnant soigneusement et méticuleusement les canaux extrahépatiques délicats pendant les étapes de nettoyage et de dissection (2.3, 2.4). Si il ya une croissance de fibroexplosions, la suppression de la zone affectée de collagène épaisse avec un scalpel ou une aspiration douce peuvent réduire le transfert des fibroblastes avant fractionnement de cellules. Ces cellules se divisent rapidement au cours des trois premiers passages, mais à des points de passage plus élevées, le taux de croissance ralentit et les cellules deviennent plus grandes et vacuoles. Nous avons gelé avec succès des échantillons de cholangiocytes, et les ré-plaqué au temps plus tard avec une excellente viabilité; cholangiocytes décongelés, cependant, ne se reproduisent pas aussi vite que fraîchement isolé et fractionner des cellules.
Figure 1. Équipement chirurgical doit être mis en place à proximité de l'appareil de culture de tissu. (A) Source de lumière est placé derrière la loupe binoculaire. (B) Matériel chirurgical comprend sc forteissors, hémostatique, une pince à épiler courbes en dents de scie, et une pince à épiler courbes non dentelés (C);.. taille d'une souris de 3 jour utilisé pour les isolations (D) Pince à épiler tiennent le canal cholédoque chez la souris néonatale.
Figure 2. Populations pures des cholangiocytes extra-hépatiques sont isolées avec une contamination minimale par les cellules mésenchymateuses. Cholangiocytes ont été colorées avec K19 (vert) avec l'imagerie nucléaire DAPI (bleu). Barres d'échelle, 25 um.
| Médias | Composant | Montant |
| Gentamicine | 0,5 ml | |
| Pénicilline-streptomycine | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 ml | |
| Biliaire cellules épithéliales (BEC) Médias | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 ml | |
| M EM acides aminés non essentiels | 5 ml | |
| Insuline-transferrine-sélénium | 5 ml | |
| Na pyruvate | 5 ml | |
| Concentré de lipides chimiquement définis | 5 ml | |
| Pénicilline-streptomycine | 5 ml | |
| Gentamicine | 0,2 ml | |
| Éthanolamine | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Inhibiteur de trypsine de soja * | 5 ml | |
| L-glutamine | 5 ml | |
| Extrait pituitaire bovin | 1,1 ml | |
| Dexaméthasone * | 0,5 ml | |
| La 3,3 ',5-triiodo-L-thyronine * | 0,5 ml | |
| le facteur de croissance épidermique * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Support de stockage (pour la congélation des cellules) | Biliaire cellules épithéliales (BEC) médias | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| FBS stérile | 2 ml | |
| * Ingrédients doivent être préparés à des concentrations appropriées avant d'ajouter dans les médias. Reportez-vous à la liste matériau pour obtenir des instructions. | ||
Tableau 1. Composants des médias.
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Discussion
Décrite ici est une technique pour isoler cholangiocytes pures à partir des voies biliaires extra-hépatiques de souris de souris de tous les âges, y compris les nouveau-nés. La technique offre l'avantage que cholangiocytes extra-hépatiques peuvent être étudiés séparément cholangiocytes intra-hépatiques, et peut faciliter les études pour identifier les principales différences entre ces populations de cellules. Nous avons récemment publié une étude démontrant diminué cils dans cholangiocytes extra-hépatiques isolés par cette méthode et infectés par le rotavirus rhésus 8. Les inconvénients comprennent que la technique est de main-d'œuvre, et la dissection méticuleuse est nécessaire pour éviter la contamination des fibroblastes; en outre, l'excroissance et au moins 3 semaines de culture sont nécessaires pour obtenir suffisamment de cellules pour la plupart des expériences. Ainsi, ces cellules peuvent refléter les changements liés à la culture de deux dimensions. Il n'a pas encore été déterminé si les populations cellulaires obtenues comprennent un nombre important de cellules souches ou de celluless à partir de glandes péribiliaires 9,10.
Nous avons tenté d'utiliser cette méthode pour isoler cholangiocytes extra-hépatiques de rats; Cependant, les cellules n'ont pas réussi à croître en culture. Que ce soit un facteur de croissance clé est manquante dans les milieux de culture ou si d'autres conditions doivent être modifiés est actuellement à l'étude.
En fin de compte, cette méthode pour isoler cholangiocytes extra-hépatiques peut contribuer à la compréhension des différences dans les formes intra et extra-hépatiques de la fibrose biliaire, ainsi que les différences entre les cellules néonatales et adultes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à la pathologie moléculaire et imagerie de base du Centre NIDDK UPenn d'études moléculaires dans des maladies digestives et hépatiques (P30 DK50306) pour l'aide à l'imagerie. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (R01 DK-092111) et de Fred et Suzanne Biesecker pédiatrique foie Center (à PBE) et par une bourse de recherche sur les maladies du foie et de l'éducation de la petite enfance réseau (à SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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