Summary
Техника для изоляции холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков у новорожденных мышей описан. Воздуховоды являются тщательно препарировали, а затем клетки выделяют выроста в толстых гелей коллагена. Этот метод является полезным инструментом для изучения внепеченочных развитие протоков желчи и патологии.
Abstract
Интра и внепеченочных желчных протоках печени являются умственно различны, и может быть по-разному влияет на некоторых заболеваний. Тем не менее, различия между внутри-и внепеченочных холангиоцитах, а также между новорожденных и взрослых клеток, не до конца понятны.
Методы выделения холангиоцитах из внутрипеченочных желчных протоков, хорошо известны 1-4. Выделение внепеченочных протоков клеток, особенно из новорожденных, до сих пор не описано, хотя это было бы весьма полезным для понимания различия между различными популяциями cholangiocyte и в изучении таких заболеваний, как атрезия желчных путей, которые появляются целевой внепеченочных протоков. Описанный здесь является оптимизированная методика изолировать оба новорожденных и взрослых мышей внепеченочные клетки желчных протоков. Этот метод дает чистую популяцию клеток с минимальными загрязнения от мезенхимальных клеток, как фибробласты.
Это метод основан на удалении внепеченочных протоков и желчного пузыря, а затем тщательного вскрытия и выскабливание, чтобы удалить жир и фибробластов слоев. Структуры встроены в толстых слоев коллагена и культивировали в течение приблизительно 3 недель, чтобы разрастание холангиоцитах в монослоев, которые затем могут быть трипсином и повторно высевали для экспериментального использования.
Introduction
Происхождение и развитие внутри-и внепеченочных холангиоцитах заметно отличаются. Печень развивается из выпячивания вентральной энтодермы передней кишки 5. Хвостовой область дивертикула формирует внепеченочных желчных дерево, в то время как черепная область генерирует внутрипеченочный желчный дерево 5. Внутрипеченочные холангиоцитов воздуховодов выводятся из клеток-предшественников вокруг протоков пластины в пригородных портала регионах 6. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в либо гепатоцитов или холангиоцитах 6. Это имеет значительные клинические последствия, учитывая, что cholangiopathies может специально направлены одну категорию холангиоцитах. Например, атрезия желчных путей изначально влияет на внепеченочные протоки новорожденных, в то время как Alagille синдром влияет внутрипеченочные протоки.
Есть несколько описаний изоляции внутрипеченочных холангиоцитах и желчных протоков единиц от мышей и крыс. Вvestigators выделили отдельные клетки путем выделения канала и последующего вырост, или путем расщепления печени и антитела снести холангиоцитов выражающих конкретные маркеры клеточной поверхности, 1-4. Функциональные и поляризованные единиц желчных протоков были выделены расщеплением печени и размера фильтрации 7. Желчных протоков единиц способны реагировать на секреторные стимулы и продемонстрировать жидкости секрецию 7, в то время как изолированные холангиоцитов было показано, что развитие протоками структур в пробирке 1,2. Ограничения этих методов включают необходимость специализированной технической экспертизы и специального оборудования для перфузии печени с пищеварительными ферментами. Кроме того, существует риск загрязнения с мезенхимальных клеток 3.
Способ изолировать внепеченочные холангиоцитах желчных протоков, в частности, из новорожденных внепеченочных желчных протоков, ранее не была описана. В этом документе излагаются упрощенную технику, чтобы изолировать новорожденных Aы также взрослых внепеченочных желчных протоков клеток при высоких уровней чистоты. Этот метод будет способствовать изучение различий между внутри-и внепеченочных холангиоцитах и исследований в области механизмов болезней, как атрезия желчных путей, которые включают внепеченочных протоков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся процедура осуществляется при комнатной температуре, если не указано иное. Все животные работа должна проводиться в гуманных условиях по протоколу утвержденного местного комитета Институциональная уходу и использованию животных (IACUC) на.
1. Подготовка оборудования и решений
- Настройка мыши операционный стол в непосредственной близости от капота культуры ткани и инкубатора (рис. 1А). Примечание: Необходимое оборудование включает в себя рассекает микроскопом, источник света, длинные 12,5 см прямые ножницы Iris, 6 дюймовый без зубчатые изогнутых щипцов с прекрасными советами и 4 дюйма зубчатые щипцы с изогнутыми наконечниками (рис. 1б).
- Поместите стерильных инструментов в стеклянном стакане с 70% спиртом на операционном столе.
- Заполните три стерильные 60 мм чашки Петри стерильной изолирующей среды (табл. 1); разместить два на операционном столе и один в капюшоне, все на льду.
- Наведите крысиный хвост коллагена,стерильный 10x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), стерильную воду, стерильный 1 N NaOH и желчных эпителиальных клеток (БЭК) Медиа (табл. 1) в капот культуры ткани. Примечание: коллаген должен быть на льду.
2. Желчных протоков Выделение и Культура
- Усыпить новорожденных мышей между 0-3 дней жизни, под воздействием углекислого газа до потери сознания не последовало смещением шейных позвонков, в IACUC принципов (рис. 1в).
Примечание: старые мыши могут быть использованы в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей. - Поместите животное в положении лежа на спине и сделать небольшой горизонтальный разрез пересечения средней линии в районе таза. Продлить этот разрез в поперечном направлении и вверх обе стороны живота, образуя U образный клапан. Поверните клапан до подвергайте органы брюшной полости. После того, как живот открыта, тщательно перемещать кишечник из брюшной полости в направлении правой стороны животного для лучшей визуализации печени и общего желчного протока. Примечание: это может быть необходимым продлить боковые разрезы в грудную клетку, чтобы получить лучшую идентификацию печени.
- Использование рассекает микроскопом, определить общий желчный проток, печень и кишечник. Определить общий желчный проток первый (рис. 1D), используя осторожность, так как структуры очень деликатный. С зубчатыми и неправительственных зубчатыми щипцами, придирчиво чистый и обрывать соединительной ткани, включая жир, окружающий желчь. Используйте один пинцет, чтобы удерживать канал, а другой для очистки.
- Используйте подобную технику для очистки желчного пузыря.
- Поместите очищенные каналы и желчного пузыря в первую блюдо изоляции СМИ на льду. Мягко массируйте структуры с не зубчатыми щипцами в то время как в средствах массовой информации для дальнейшего удаления соединительной ткани и удалить желчь из желчного пузыря.
- Трансфер протоки и желчный пузырь, чтобы второй блюдо изоляции СМИ.
- После выделения каналов и желчные пузыри из 5 животных, трансферчасти к третьей чашке Петри, в капюшоне. Примечание: Если клетки должны быть изолированы от более чем 5 животных, делать периодически, с использованием свежих решения для каждой группы по 5 животных.
- Подготовка толстые гели коллагена в капот культуры ткани:
Примечание: любой размер блюдо можно использовать. 60 мм чашки для культивирования с конечным объемом 3 мл коллагена для каждой группы из 5 новорожденных работает хорошо. Это следует приготовить свежую во время погружения свежеизолированных протоки.- Поместите коллагена хвоста крысы, стерильную 10x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) 10x, стерильную дН 2 O, и стерильной 1 N NaOH на льду.
- Рассчитать объемы дН 2 0, 10х PBS, NaOH, и коллагена, необходимого для гелей с конечной концентрацией 2 мг / мл коллагена в 1х PBS, используя объем 1 N NaOH, равную 0,023 кратного объема коллагена добавлен. Примечание: Если альтернативный источник коллагена используется, следуйте инструкциям производителя по нейтрализации и образования геля.
- Смешать дН 2 0, 10x PBS, и 1 N NaOH, затем добавить коллагена и пипетки хорошо, чтобы обеспечить равномерное смешивание.
- После того, как коллаген раствор загустел в гель консистенции при комнатной температуре, немедленно вставлять каналы в коллагена.
- Место в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы позволить коллагена затвердеть.
- После того, как гель затвердевает (изменения цвета от прозрачного до белого), с наложением 3,5 мл БЭК СМИ (табл. 1) и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
- Удалить BEC СМИ 3 раза в неделю и заменить 3,5 мл свежей среды.
3. Изоляция Первичные холангиоцитах из толстого Коллаген Гели
Примечание: в течение 3 недель, листы холангиоцитах (клеток с большими ядрами расширения непосредственно из встроенных каналов) будут видны в густой коллагена. Если есть большое количество фибробластов в чашке, он должен быть отброшен. Если несколько регионов блюдо естьроста фибробластов, их можно вырезать скальпелем и удалены до расщепления холангиоцитах.
- Подготовка тонкие гели коллагена:
- Развести коллагена в концентрации 1 мг / мл стерильной PBS. Примечание: используйте 1 мл для 100 мм пластины; настроить соответствующим образом для других блюд размера.
- Распространение раствора коллагена равномерно с сотовым разбрасывателя (большие блюда) или кончика пипетки (небольшие блюда), а затем оставить при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Накладка с DMEM/F12 и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 10 мин.
- Удалить пластину из инкубатора и мыть с 1x PBS. Сразу аспирации 1x PBS.
- Coat со вторым тонким слоем коллагена, распространяющейся путем вращения тарелки или размещения пластины на шейкере. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 10 мин.
- После коллаген укрепил, крышка с DMEM/F12 и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 30 мин.
- Сплит клетки от гоИк коллагеновые гели:
- С клеточной культуры шпателем или клеточным скребком, очистить геля коллагена мягко от пластины таким образом, чтобы он плавает.
- Подготовка коллагеназы решение путем разбавления Тип XI коллагеназы (см. список материалов) до 10 мг / мл с DMEM/F12. Хорошо перемешайте и стерильный фильтр.
- Добавьте 1 мл раствора коллагеназы (см. выше) на 60 мм блюдо клеток в толстой коллагена. Не извлекайте носитель BEC (который должен быть 3 мл). Выдержите блюдо в течение 30 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Удалить раствор, содержащий клетки, и поместить в 15 мл коническую трубку.
- Спин вниз на 2200 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в подобной объема DMEM/F12.
- Спин решение снова в 2200 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 3 мл 0,5% трипсина и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 5 мин. После инкубации пипетки решение вверх и вниз, чтобы разбить листы холангиоцитах. Добавить 5 мл БЭК ПРЕССЫй спин решение в 1500 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в DMEM/F12, затем спина раствор при 1500 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и вновь приостановить гранул в БЭК СМИ (табл. 1). Пластина клеток на ранее сделанных тонких гелей коллагена.
4. Прохождение и хранение клеток
Примечание: клетки на тонких коллагеновых гелей могут быть разделены по мере необходимости.
- Планшеты промывают стерильной PBS до инкубации в 0,25% трипсина при 37 ° С в течение 10-15 мин.
- Нейтрализовать с равным объемом БЭК информации, и осаждения на 1500 мкг в течение 5 мин. Промыть осадок с DMEM/F12, то осаждения при 1500 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в БЭК СМИ для распространения коллагена покрытием клеточных культур блюд.
Примечание: В качестве альтернативы, клетки могут быть повторно суспендируют в носителе и хранятся в -80 ° C морозильнике или жидкого азота (табл. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование этого результаты протоколов в изоляции населением новорожденных мыши внепеченочных холангиоцитах с отличной чистоты, о чем свидетельствует иммунофлуоресцентного окрашивания K19 (рис. 2А и 2В); мы достичь подобных результатов изолирующие клетки от взрослых мышей. Мы наблюдали, что он принимает 3 недели для клеток из недавно выделенных желчных протоков с образованием монослоев на толстых гелей коллагена. В холангиоцитов расти в линейном виде по всей толстой коллагена, образуя листы клетки из выделенных каналах. Клетки должны быть разделены и повторно высевали на тонких гелей коллагена до монослоя зарастают, поскольку дырки появляются в листах клеток, если культуры не расщепляются до 3 недель. Для оптимального роста клеток и для минимизации загрязнения фибробластов, важно, чтобы удалить соединительную ткань тщательно и скрупулезно окружающую тонкие внепеченочные протоки во время вскрытия и очистки шагов (2.3, 2.4). Если есть рост фиброзновзрывов, удаление пораженного участка толстой коллагена с помощью скальпеля или нежным санации может снизить передачу фибробластов перед расщепления клеток. Эти клетки быстро делятся в течение первых трех проходов, но при более высоких точках прохода, темп роста замедляется, и клетки становятся крупнее и вакуолизированы. Мы успешно заморожены образцы холангиоцитах и повторно высевали их на более позднее время с отличной жизнеспособности; размороженные холангиоцитов, однако, не копируют так быстро, как недавно выделен и расщепленные клетки.
Рисунок 1. Хирургическое оборудование должны быть созданы в непосредственной близости от аппарата культуры ткани. (А) Источник света расположен за вскрытии микроскопом. (В) Хирургическое оборудование включает в себя резкое подкожноissors, кровоостанавливающего, изогнутую зубчатые пинцет, и изогнутую ООН-зубчатые пинцет (C);.. Размер 3 день старого мыши, используемой для выделений (D) Пинцет держат общего желчного протока в неонатальном мыши.
Рисунок 2. Чистые популяции внепеченочных холангиоцитах изолированы с минимальным загрязнением с мезенхимальных клеток. Холангиоцитах окрашивали K19 (зеленый) с DAPI ядерной томографии (синий). Масштабные бары, 25 мкм.
| Средства массовой информации | Компонент | Количество |
| Гентамицин | 0,5 мл | |
| Пенициллин-стрептомицин | 0,5 мл | |
| Fungizone | 0,5 мл | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 мл | |
| Желчных эпителиальных клеток (БЭК) Медиа | FBS | 25 мл |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 мл | |
| М Е.М. не-незаменимых аминокислот | 5 мл | |
| Инсулин-трансферрин-селен | 5 мл | |
| На Пируват | 5 мл | |
| Химически определенные липидов концентрат | 5 мл | |
| Пенициллин-стрептомицин | 5 мл | |
| Гентамицин | 0,2 мл | |
| Этаноламин | 0,13 мл | |
| 5 мл | ||
| Соевый ингибитор трипсина * | 5 мл | |
| L-глютамин | 5 мл | |
| Бычий гипофизарный экстракт | 1,1 мл | |
| Дексаметазон * | 0,5 мл | |
| 3,3 ',5-трииодо-L-тиронина * | 0,5 мл | |
| Эпидермальный фактор роста * | 0,5 мл | |
| 5 мл | ||
| Fungizone | 1 мл | |
| Носитель (для замораживания клеток) | Желчных эпителиальных клеток (BEC) СМИ | 7 мл |
| ДМСО | 1 мл | |
| Стерильная FBS | 2 мл | |
| * Ингредиенты должны быть готовы к соответствующей концентрации перед добавлением в средствах массовой информации. См. списке материалов для дальнейшего обучения. | ||
Таблица 1. Компоненты носителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод, чтобы изолировать чистые холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков мышей мышей всех возрастов, в том числе новорожденных. Методика имеет то преимущество, что внепеченочных холангиоцитов можно изучать отдельно от внутрипеченочных холангиоцитах, и может облегчить исследования для определения ключевых различий между этими популяциями клеток. Мы недавно опубликовали исследование, демонстрирующее снизилась реснички в внепеченочных холангиоцитах изолированных этим методом и инфицированных резус ротавируса 8. К недостаткам можно отнести, что техника является трудоемким, и дотошный рассечение требуется для предотвращения загрязнения фибробластов; кроме того, следствием и по крайней мере 3 недели в культуре, должны получить достаточные клетки для большинства экспериментов. Таким образом, эти клетки могут отражать изменения, связанные с двумерной культуры. Это до сих пор не определено, что клеточные популяции, полученные включают ли значительное число стволовых клеток или клеткис от peribiliary желез 9,10.
Мы попытались использовать этот метод, чтобы изолировать внепеченочные холангиоцитах от крыс; Однако клетки не расти в культуре. Будь ключевым фактором роста отсутствует в культуральной среде или же другие условия должны быть изменены в настоящее время ведется расследование.
В конечном счете, этот способ изолировать внепеченочные холангиоцитах может способствовать пониманию различий в внутри-и внепеченочных желчных форм фиброза, а также различия между неонатальных и взрослых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Авторы благодарны молекулярной патологии и обработки изображений ядро UPenn NIDDK Центра молекулярных исследований в желудочно-кишечных и заболеваний печени (P30 DK50306) об оказании помощи визуализации. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья (R01 DK-092111) и от Фреда и Сюзанны Biesecker детской печени Центра (до RGW) и стипендией с детства Заболевания печени исследований и образования сети (к SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
