Summary
En teknik för att isolera cholangiocytes från extrahepatiska gallgångarna av neonatala möss beskrivs. Kanalerna är noggrant dissekeras, och sedan cellerna isoleras genom utväxt i tjocka kollagengeler. Denna metod ger ett användbart verktyg för att studera extrahepatisk gallgången utveckling och patologi.
Abstract
Den intra-och extrahepatiska gallgångarna i levern är utvecklingsmässigt distinkta, och kan på olika sätt drabbas av vissa sjukdomar. Men skillnaderna mellan intra-och extrahepatiska cholangiocytes, samt mellan neonatala och vuxna celler, är inte väl förstådd.
Metoder för isolering av cholangiocytes från intrahepatiska gallgångar är väletablerade 1-4. Isolering av extrahepatiska duktal celler, särskilt från det nyfödda barnet, har ännu inte beskrivits, även om detta skulle vara till stor nytta för att förstå skillnaderna mellan olika cholangiocyte populationer och studera sjukdomar som gallgångsatresi som tycks rikta extrahepatiska kanaler. Beskrivs här är en optimerad teknik för att isolera både neonatala och vuxna mus extrahepatiska gallgångsceller. Denna teknik ger en ren cellpopulation med minimal kontamination från mesenkymala celler såsom fibroblaster.
Detta method bygger på att avlägsna de extrahepatiska ledningar och gallblåsan, följt av noggrann dissekering och skrapning för att avlägsna fett och fibroblast skikt. Konstruktioner är inbäddade i tjocka lager av kollagen och odlades under ca 3 veckor för att tillåta utväxt av cholangiocytes i monoskikt, vilka därefter kan trypsiniserade och åter pläterade för experimentell användning.
Introduction
Ursprung och utveckling av intra-och extrahepatiska cholangiocytes är markant annorlunda. Levern utvecklas från en divertikel av den ventrala tarmen endoderm 5. Den caudal regionen av divertikel bildar extrahepatisk biliär trädet, medan skallen genererar intrahepatisk galla träd 5. Intrahepatiska kanal cholangiocytes härrör från stamceller runt duktal plattan i de peri portal områdena 6. Dessa celler har förmågan att differentiera till antingen hepatocyter eller cholangiocytes 6. Detta har viktiga kliniska implikationer som ges att cholangiopathies specifikt kan rikta en kategori av cholangiocytes. Exempelvis gallgångsatresi påverkar initialt de extrahepatiska kanaler i det nyfödda barnet, medan Alagilles syndrom påverkar intrahepatiska kanaler.
Det finns flera beskrivningar av isolering av intrahepatiska cholangiocytes och gallgång enheter från mus och råtta. Ivestigators har isolerat enstaka celler genom kanalisolering och efterföljande utväxt, eller genom levern matsmältning och antikropp dra ner på cholangiocytes uttrycker specifika cellytemarkörer 1-4. Funktionella och polarise gallgången heter har isolerats från levern matsmältning och storleksfiltrering 7. Gallgången enheter är kapabla att svara på sekretoriska stimuli och demonstrera vätskeutsöndring 7, medan enstaka cholangiocytes har visat sig utveckla ductular strukturer in vitro 1,2. Begränsningar av dessa metoder är behovet av specialiserad teknisk kompetens och specialutrustning för leverperfusion med matsmältningsenzymer. Dessutom finns det en risk för kontaminering med mesenkymala celler 3.
En metod för att isolera extrahepatiska gallgången cholangiocytes, specifikt från neonatala extrahepatiska gallgångar, har inte tidigare beskrivits. Detta dokument beskriver en förenklad teknik för att isolera neonatal as liksom vuxna extrahepatiska gallgångsceller vid höga nivåer av renhet. Denna teknik kommer att underlätta studier av skillnader mellan intra-och extrahepatiska cholangiocytes och forskning om mekanismer för sjukdomar som gallgångsatresi som involverar de extrahepatiska kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hela proceduren genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges. Alla djur arbete bör utföras under humana förhållanden enligt ett protokoll som godkänts av den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Beredning av utrustning och lösningar
- Ställ upp musen operationsbordet i omedelbar närhet till den vävnadskultur huva och inkubator (Figur 1A). OBS: Obligatorisk utrustning inkluderar en dissekera mikroskop, en ljuskälla, 12,5 cm lång rak iris sax, 6 tums icke räfflade böjda pincett med fina spetsar, och 4 tum tandade pincett med böjda spetsar (Figur 1B).
- Placera steriliserade instrument i en glasbägare med 70% alkohol på operationsbordet.
- Fyll tre sterila 60 mm petriskålar med steril isolering medier (tabell 1); Placera två på operationsbordet och en i huven, allt på is.
- Placera råttsvanskollagen,steril 10x fosfat saltlösning (PBS), sterilt vatten, steril 1 N NaOH och galla epitelceller (BEC) media (tabell 1) i vävnadsodling huva. Obs: kollagen skall vara på is.
2. Bile Duct Isolering och kultur
- Euthanize neonatala möss mellan 0-3 dagar i livet, genom exponering för koldioxid tills medvetslös följt av halsdislokation, per IACUC riktlinjer (Figur 1C).
OBS: äldre möss kan användas beroende på specifika experimentella behov. - Placera djuret i ryggläge och gör ett litet horisontellt snitt som korsar mittlinjen i området av bäckenet. Förläng detta snitt i sidled och upp båda sidorna av buken, som bildar en U-formad flik. Vrid flik för att exponera bukorganen. När buken är öppen, noggrant flytta tarmarna ur bukhålan mot den högra sidan av djuret för bättre visualisering av levern och gallgången. Obs: Det kan vara nödvändigt att förlänga de laterala snitt i bröstkorgen för att få bättre identifiering av levern.
- Använda dissektionsmikroskop, identifiera den gemensamma gallgången, lever och tarmar. Identifiera den gemensamma gallgången först (figur 1D), med hjälp av försiktighet, eftersom strukturerna är mycket känslig. Med de tandade och icke tandade pincett, minutiöst rena och plocka bort den bindväv inklusive fett som omger gallan. Använd en pincett för att hålla kanalen och den andra att rengöra.
- Använd en liknande teknik för att rengöra gallblåsan.
- Placera de rengjorda ledningar och gallblåsan in i den första skålen i isoleringsmedia på is. Massera försiktigt strukturerna med de icke tandade pincett medan i media för att ytterligare ta bort bindväv och ta bort galla från gallblåsan.
- Överför produkter och gallblåsan till den andra skålen i isoleringsmedia.
- Efter isolering av ledningar och gallbladders från 5 djur, överförabitar till tredje petriskål, i huvan. Obs: Om cellerna skall isoleras från mer än fem djur, gör i omgångar, med användning av färska lösningar för varje grupp om fem djur.
- Förbered tjocka kollagengeler i vävnadsodling huva:
Notera: alla storlekar maträtt kan användas. En 60 mm odlingsskål med en slutlig volym av 3 ml kollagen för varje grupp om fem nyfödda fungerar bra. Detta bör beredas på nytt vid tidpunkten för inbäddning nyisolerade kanalerna.- Placera råttsvanskollagen, steril 10x fosfatbuffrad saltlösning (10x PBS), sterilt dH 2 O och steril 1 N NaOH på is.
- Beräkna volymen av dH 2 0, 10x PBS, NaOH, och kollagen som behövs för geler med en slutkoncentration av 2 mg / ml kollagen i 1 x PBS, med användning av en volym av 1 N NaOH lika med 0,023 gånger volymen av kollagen tillsätts. OBS: Om alternativ källa av kollagen används, följ tillverkarens anvisningar för neutralisering och gelbildning.
- Blanda ihop dH 2 0, 10x PBS, och 1 N NaOH, tillsätt sedan kollagen och pipett väl för att säkerställa jämn blandning.
- När kollagenlösningen har tjocknat till en gelliknande konsistens vid rumstemperatur, omedelbart bädda kanalerna i kollagen.
- Placera i inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 under 30 minuter för att göra det möjligt för kollagen för att stelna.
- När gelen har stelnat (ändrar färg från klar till vitt), overlay med 3,5 ml av BEC medium (tabell 1) och inkubera vid 37 ° C, CO 5% 2.
- Ta bort BEC media 3 gånger i veckan och ersätt med 3,5 ml färskt medium.
3. Isolerande Primära Cholangiocytes från Tjock kollagengeler
OBS: inom 3 veckor, kommer ark cholangiocytes (celler med stora kärnor sträcker direkt från inbyggda ledningar) att synas i den tjocka kollagen. Om det finns ett stort antal fibroblaster i skålen, ska det kasseras. Om några få regioner i skålen harfibroblasttillväxtfaktor kan dessa skäras ut med en skalpell och avlägsnas före dela upp cholangiocytes.
- Förbered tunna kollagengeler:
- Späd kollagen till en koncentration av 1 mg / ml med steril PBS. OBS: använd 1 ml för 100 mm plåt; justera detta för andra storlek rätter.
- Sprid kollagenlösningen jämnt med en cellspridare (tallrikar) eller pipettspetsen (smårätter), sedan låt stå i rumstemperatur i 10 min.
- Täck plattan med DMEM/F12 och inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 i 10 min.
- Ta bort plattan från kuvösen och tvätta med 1x PBS. Omedelbart aspirera 1x PBS.
- Coat med ett andra tunt skikt av kollagen, spridning genom att rotera plattan eller placera plattan på en skakapparat. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 10 min.
- När kollagen har stelnat, täckplatta med DMEM/F12 och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 30 min.
- Dela upp celler från thick kollagengeler:
- Med cellodling spatel eller cellskrapa, skrapa kollagengelen försiktigt av plattan så att den är flytande.
- Förbered genaslösning genom utspädning Typ XI kollagenas (se material listan) till 10 mg / ml med DMEM/F12. Blanda väl och sterilfilter.
- Tillsätt 1 ml kollagenas lösning (ovan) per 60 mm skål av celler i tjock kollagen. Avlägsna inte BEC media (som bör vara 3 ml). Inkubera skålen under 30 min vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ta lösning som innehåller celler, och placera i 15 ml koniska rör.
- Centrifugera ner vid 2200 xg under 5 min. Kassera supernatanten och åter suspendera pelleten i liknande volym DMEM/F12.
- Spin lösning igen vid 2200 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 3 ml av 0,5% trypsin och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 5 min. Efter inkubering pipettera lösningen upp och ner för att bryta upp ark cholangiocytes. Tillsätt 5 ml BEC medier ennd spin-lösning vid 1500 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i DMEM/F12, sedan snurra lösning vid 1500 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och åter suspendera pelleten i BEC medier (tabell 1). Tavla celler på tidigare gjorda tunna kollagengeler.
4. Passage och förvaring av celler
Obs: celler på tunna kollagengeler kan delas efter behov.
- Tvätta plattorna med steril PBS före inkubering i 0,25% trypsin vid 37 ° C under 10-15 min.
- Neutralisera med en lika volym av BEC media och pellet vid 1500 xg under 5 min. Skölj pellets med DMEM/F12, sedan pellets vid 1500 xg under 5 minuter.
- Slamma upp cellerna i BEC medier för distribution till kollagenbelagda cellodlingsskålar.
Anmärkning: Alternativt kan celler återsuspenderades i lagringsmedia och lagrades i en -80 ° C frys eller flytande kväve (tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användandet av denna protokoll resultat i isoleringen av en befolkning på neonatal mus extrahepatiska cholangiocytes med utmärkt renhet, vilket framgår av K19 immunofluorescensfärgning (fig. 2A och 2B); vi uppnå liknande resultat isolera celler från vuxna möss. Vi har observerat att det tar tre veckor för celler från nyligen isolerade gallgångarna att bilda monolager på tjocka kollagengeler. De cholangiocytes växa på ett linjärt sätt under hela den tjocka kollagen och bildar ark av celler från de isolerade ledningarna. Celler bör delas och åter klädd i tunna kollagengeler innan monolager växa igen, eftersom det hål i bladen av celler om kulturer inte delas före 3 veckor. För optimal celltillväxt och för att minimera kontaminering fibroblast, är det viktigt att avlägsna den bindväv som omger de ömtåliga extrahepatiska kanalerna omsorgsfullt och noggrant under dissektionen och reningssteg (2,3, 2,4). Om det finns en tillväxt på fibroblaster, avlägsnande av det drabbade området av tjocka kollagen med en skalpell eller varsam sugning kan minska överföringen av fibroblaster före klyvning celler. Dessa celler delar snabbt under de första tre passager men vid högre passagepunkter, bromsar tillväxten, och cellerna blir större och vakuoliserade. Vi har framgångsrikt frysta prover av cholangiocytes, och re-plated dem vid senare tillfällen med utmärkt lönsamhet; tinade cholangiocytes dock inte replikeras så snabbt som nyligen isolerade och dela celler.
Figur 1. Kirurgisk utrustning bör inrättas i anslutning till vävnadsodlingsapparat. (A) Ljuskälla placeras bakom dissekera mikroskop. (B) Kirurgisk utrustning innehåller skarp fmissors, hemostat, en krökt tandade pincett, och en böjd un-tandade pincett (C),.. Storlek på en 3 dagar gammal mus som används för isoleringar (D) Pincett håller i gallgången i neonatal musen.
Figur 2. Rena populationer av extrahepatiska cholangiocytes isoleras med minimal förorening med mesenkymala celler. Cholangiocytes färgades med K19 (grön) med DAPI nuclear imaging (blå). Skala barer, 25 | im.
| Media | Komponent | Mängd |
| Gentamicin | 0,5 ml | |
| Penicillin-streptomycin | 0,5 ml | |
| Fungizone | 0,5 ml | |
| DMEM/F12 (1:1) | 5 ml | |
| Biliär epitelceller (BEC) Media | FBS | 25 ml |
| DMEM/F12 (1:1) | 500 ml | |
| M EM icke-essentiella aminosyror | 5 ml | |
| Insulin-transferrin-selen | 5 ml | |
| Na Pyruvat | 5 ml | |
| Kemiskt definierade lipid koncentrat | 5 ml | |
| Penicillin-streptomycin | 5 ml | |
| Gentamicin | 0,2 ml | |
| Etanolamin | 0,13 ml | |
| 5 ml | ||
| Sojaböntrypsininhibitor * | 5 ml | |
| L-glutamin | 5 ml | |
| Bovint hypofysextrakt | 1,1 ml | |
| Dexametason * | 0,5 ml | |
| 3,3 ',5-trijod-L-tyronin * | 0,5 ml | |
| Epidermal tillväxtfaktor * | 0,5 ml | |
| 5 ml | ||
| Fungizone | 1 ml | |
| Lagringsmedia (för frysning celler) | Biliär epitelceller (BEC) medier | 7 ml |
| DMSO | 1 ml | |
| Steril FBS | 2 ml | |
| * Ingredienser måste vara beredd att lämpliga koncentrationer innan du lägger in i media. Se materiallista för vidare instruktioner. | ||
Tabell 1. Medie komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här är en teknik för att isolera rena cholangiocytes från de extrahepatiska gallgångarna av möss av möss i alla åldrar, inklusive nyfödda. Tekniken erbjuder fördelen att extrahepatiska cholangiocytes kan studeras separat från intrahepatiska cholangiocytes, och kan underlätta studier för att identifiera viktiga skillnader mellan dessa populationer av celler. Vi har nyligen publicerat en studie som visar minskad flimmerhår i extrahepatiska cholangiocytes isolerats med denna metod och infekterade med rhesus rotavirus 8. Nackdelar inkluderar att tekniken är arbetskrävande, och noggrann dissektion krävs för att förhindra kontaminering fibroblaster; Dessutom är utväxt och åtminstone 3 veckor i odling krävs för att erhålla tillräckligt med celler för de flesta experiment. Sålunda kan dessa celler spegla förändringar i samband med två dimensionella kultur. Det har ännu inte fastställts om cellpopulationer som erhållits omfattar betydande antal stamceller eller cellers från peribiliary körtlar 9,10.
Vi försökte använda den här metoden för att isolera extrahepatiska cholangiocytes från råttor; emellertid cellerna misslyckades med att växa i kultur. Oavsett om en viktig tillväxtfaktor saknas i odlingsmedia eller om andra villkor behöver ändras är för närvarande under utredning.
I slutändan kan den här metoden för att isolera extrahepatiska cholangiocytes bidra till förståelse skillnader i intra-och extrahepatiska former av biliär fibros, liksom skillnader mellan neonatala och vuxna celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för molekylär patologi och Imaging Core i UPenn NIDDK Center for Molecular Studies i Digestive och leversjukdomar (P30 DK50306) för hjälp med bildbehandling. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (R01 DK-092.111) och från Fred och Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (till RGW) och genom ett stipendium från Childhood Leversjukdom Forskning och utbildning Network (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 μg/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, used in BEC media, 25 μg/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml, used in BEC media and 500 μl in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 min |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 min |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
