Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Proton Transfer og Protein konformasjon Dynamics i Lysfølsomme Proteiner av Time-løst Step-skanne Fourier-transform infrarød spektroskopi

Published: June 27, 2014 doi: 10.3791/51622
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Molecular Biophysics, Freie Universität Berlin

Abstract

Overvåking dynamikken i protonering og protein ryggrad konformasjon endringer i funksjon av et protein er et viktig skritt mot å forstå mekanismen. Protonering og konformasjonsendringer påvirke vibrasjonsmønster av aminosyre-sidekjeder, og av peptidbinding, henholdsvis, som begge kan bli analysert ved infrarød (IR) spektroskopi forskjell. For proteiner hvis funksjon kan være gjentagelser og reproduserbart utløst av lys, er det mulig å oppnå infrarøde spektra med forskjellen (sub) mikro oppløsning over et bredt spektralområde ved hjelp av step-skann Fourier transform infrarød teknikk. Med ~ 10 2 -10 3 repetisjoner av photoreaction, til det minimale antall gjennomføre et søk til rimelig spektral oppløsning og båndbredde, kan støynivået i absorpsjon forskjellen spektra være så lav som ~ 10 - 4, er tilstrekkelig for å følge kinetikken protonering endringer fra en enkelt aminosyre. Nedrestøynivåer kan oppnås ved mer data i snitt og / eller matematisk behandling. Mengden av protein som er nødvendig for optimale resultater er mellom 5 til 100 mg, avhengig av samplingsteknikk som brukes. Angående ytterligere krav, må proteinet skal først konsentrert til en lav ionestyrke buffer og deretter tørket for å danne en film. Proteinet filmen er hydrert før forsøket, enten med små dråper av vann eller under kontrollert atmosfærisk fuktighet. Den oppnådde hydrering nivå (g vann / g av protein) er avleses fra en IR-absorpsjonsspektrum. For å vise frem teknikken, studerte vi PHOTO av lys-drevet proton-pumpe bacteriorhodopsin i sitt opprinnelige lilla membran miljø, og av lyset-gated ionekanal channelrhodopsin-2 oppløseliggjort i vaskemiddel.

Introduction

For å få fullt belyse hvordan proteiner utføre sin funksjon, er det nødvendig å måle dem når de arbeider, dvs. langs en ​​reaksjon bane som ofte innebærer en rekke mellomprodukter og strekker seg flere bestillinger av tid. Viktige skritt av protein funksjon ofte finne sted i mikrosekund til millisekund tidsområde 1, særlig ryggrad konformasjonsendringer og protonoverføringer reaksjoner i membran proteiner. Røntgenkrystallografi, uten tvil den søyle av strukturell biologi, danner statiske (gjennomsnittlig tids) elektrondensiteter fra godt diffracting protein krystaller, notorisk vanskelig å vokse med membran proteiner to. En 3D-atom modell kan opprettes basert på elektrontetthet, selv om det sjelden inkludert stedet for hydrogenatomer. Bemerkelsesverdig fremgang i tid-løst røntgenkrystallografi, stole enten på Laue diffraksjon tre eller på femtosecond X-ray pulser 4, legger tidsdimensjonen til høy strukturell informasjon ihørende til røntgenkrystallografi fem. Men å sette av tekniske og analytiske utfordringer, kan krystallgitteret svekke ryggrad konformasjonsendringer og endre protein dynamikk, en uunngåelig brist av metoder basert på protein krystaller fem. Følgelig er dynamiske aspekter av proteiner fortsatt best dekket av optiske metoder, som utviklet av flash fotolyse 6,7, men med den generelle ulempen med begrenset strukturell innsikt.

Fourier transformert infrarød spektroskopi (FT-IR) kombinerer tidsmessig oppløsning av optiske spectroscopies med en verdifull følsomhet for proteinstruktur, den siste funksjonen utnyttes i utallige statiske strukturelle og funksjonelle undersøkelser på membran proteiner 8-11. Spesielt har FT-IR forskjell spek vist seg å være et ideelt verktøy for å studere små spektrale endringer som et protein transporter fra en metastabil tilstand til en annen 12-19.

Studies på protein dynamikk, unntatt på ett molekyl-nivået 20,21, krever en utløsende fremgangsmåte for synkronisering. En reaksjon er praktisk innledet fast og ikke invasiv måte ved hjelp av lys som utløser, som utført i studiet av proteiner med cykliske fotoreaksjoner. En hovedutfordring i forbindelse med tid-løst studier er oppnåelse av tilstrekkelig tid til oppløsning og samtidig opprettholde god spektral oppløsning og passende signal-til-støy-forhold. Også viktig er å dekke et tilstrekkelig bredt spektral og temporal rekkevidde. Time-løst steg-scan FT-IR spektroskopi utmerker seg i alle disse aspektene 22, med publiserte eksempler dekker spektrale områder så bredt som 3,900-850 cm -1 og dynamikk som strekker ~ 9 bestillinger av gangen, med opptil 3,5 cm -1 spektral og 30 nsec tidsmessig oppløsning 23-28.

Fourier-trans IR spektrometre utvise redusert støy og forbedret fotometrisk nøyaktighet over dispersive seg 29. However, på vanlig hurtig-scan innspillingsmodus FT-IR-spektrometer lider av en tidsoppløsning begrenset til ≥ 5-10 msec som en konsekvens av den minste tid det mobile speil i interferometeret kreves for å fullføre en skanning. Med trinnskanning teknikk, i motsetning, er tidsavhengighet av den dynamiske arrangementet dekoblet fra skanningen varigheten av interferometeret. Kort fortalt, de mobile speilet beveger seg i diskrete trinn i stedet for kontinuerlig skanning for å fullføre en skanning. På hvert av disse trinnene (mobil) speil holdes fast og en forbigående er registrert. Dermed er tidsoppløsningen begrenset av stigningstiden av kvikksølv-kadmium-tellurid (MCT) detektor, som typisk er i området fra 10 til 100 nanosekunder. I praksis er det store dynamiske område interferogram (inneholdende et intenst signal i centerburst og små signaler i vingene), krever for riktig digitalisering av en analog / digital-omformer (ADC) med så mange som 16 til 24 biter, som fører til sampling prisene ikke høyere enn ~ 200 kHz(5 usekunder) 30. Nanosekund tidsoppløsning kan oppnås ved å måle bare de forandringer i interferogram, hvor en 8 til 12 bit ADC er tilstrekkelig 23,31-33. Tekniske aspekter 30,34,35 og applikasjoner 36-38 av tid-løst step-scan har vært diskutert i detalj andre steder.

Hensikten med strømbidrag er å tilveiebringe en protokoll som beskriver den praktiske tids løst trinnskanning FT-IR-spektroskopi på lysfølsomme membranproteiner. Her er resultatene av teknikken vist for to utvalgsmetoder: transmisjon og svekket total refleksjon (ATR). Bruken av ATR gjør det mulig å arbeide i nærvær av overskudd av vann, som ikke bare sikrer fulle væskebetingelser for protein, men også gjør det mulig for akutt kontroll av prøven pH og ionestyrke 49,50. Step-skanne eksperimenter er illustrert på to utvalgte systemer: bacteriorhodopsin og channelrhodopsin-2.

39,40, noe som gjør det best forstått membran protein så langt. Blant de mange teknikker som brukes på studiet av bR funksjonalitet FT-IR spektroskopi har uten tvil utøvde en av de største konsekvensene. Nemlig, har FT-IR-spektroskopi vært nøkkelen til å løse de gruppene som er involvert i proton overføring over membranen som stod andre steder 13,41,51.

Channelrhodopsin (CHR) er den første lys-gated ionekanal som finnes i naturen 42,43. Svak eksitasjon av CHR fører til forbigående åpning av en ionekanal. Dens oppdagelse avgjort veien for utviklingen av optogenetics, der molekylære prosesser er styrt av lys 44,45. CHR tilhører, som BR, til familien til mikrobielle rhodopsins men i motsetning til BR, er mye mindre kjent om sin funksjonelle mekanismen 52. CHR2 kombinerer sin funksjon som en ion kanal med protonpumpeaktiviteten 46,47. Nylig søkte vi tid-løst steg-scan FT-IR spektroskopi for å løse intra-protein protonoverføring reaksjoner og dynamikken i protein ryggrad konformasjon endringer i CHR2 48.

Protocol

En. Generelle aspekter av prøve og Instrument Forberedelse

  1. Bruk en kommersiell FT-IR spektrometer utstyrt for tid-løst step-scan målinger. For best resultat plassere FT-IR spektrometer på toppen av et vibrasjonsbord frikoplet.
  2. Evakuer optikk rommet til noen få mbar. Purge prøvekammeret med tørr luft eller nitrogen.
  3. Plasser en IR-transparent materiale opake for synlig stråling i fronten av detektoren MCT av FT-IR-spektrometer. Denne forholdsregel er avgjørende for å hindre gjenstander fra den spennende laserpuls under step-scan eksperimenter. Merk: Vi bruker en germanium (Ge) vindu mm diameter 25. Den høye brytningsindeks forårsaker uønsket intensitet taper, i stor grad unngått å bruke en Ge filter med antireflecting belegg.
  4. Avkjøl MCT detektor dewar med flytende nitrogen. Merk: Bruk av fotoelektrisk MCT detektorer er foretrukket over photoconductives grunn av deres lineær respons, og dermed overlegen photometric nøyaktighet og baseline pålitelighet 31,53.
  5. Pre-konsentrere prøven benyttet for eksperimentene i minst 2 mg protein / ml i en buffer med lav (<20 mM) ionestyrke for å forhindre dannelse av saltkrystaller, mens tørking av proteinsuspensjonen for å danne en homogen proteinfilm. For prøver som sediment, vaske / konsentrere dem ved å bruke ultracentrifugation (f.eks proteiner membran i en liposomer eller i cellemembranen patcher). Bruk centricons av riktig cutoff for proteiner som ikke sediment (f.eks vaskemiddel oppløseliggjorte membran proteiner).
  6. For optimale resultater bruk: a) proteinpreparater som ren og aktiv som mulig; b) lipid / protein forholdstall ≤ 3 i vekt for proteiner i cellemembranen patcher eller rekonstruert i liposomer; c) vaskemiddel / protein forholdstall ≤ 1 i vekt for vaskemiddel oppløseliggjøres proteiner. Unngå bruk av vaskemidler eller lipider som vibrasjonen band overlapper med de av protein (f.eks, karer).
    7. 2. Utarbeidelse av dempes total refleksjon Eksperimenter på Bacteriorhodopsin

    1. Monter ATR tilbehør inn i prøvekammeret av FT-IR-spektrometer. Merk: Vi bruker en ZnSe / diamant ATR med fem aktive refleksjoner. Unngå halvledermaterialer som for eksempel germanium-eller silisium som intern refleksjonselement (IRE) av ATR tilbehør, som deres optiske egenskaper er påvirket av den spennende synlig laser.
    2. Mål en bredt spekter (ca. 4,000-800 cm -1) energispekteret på 4 cm -1 oppløsning av ren IRE overflaten ved konvensjonell hurtig-scan FT-IR-spektroskopi. Bruk av dette spektrum som en referanse-spektrum til å beregne absorpsjonsspektre på et senere stadium.
    3. Dekk IRE overflaten av ATR med 20 pl av buffer anvendes senere for å rehydrere prøven (f.eks, 4 M NaCl, og 100 mM Näpi ved pH 7,4). Mål IR absorpsjon av bufferen.
    4. Fjern buffer, og skyll den IRE overflaten with vann. Unngå å berøre overflaten. Fjern gjenværende væske fra IRE overflaten av en intens luftstrøm.
    5. Spre ~ 3 mL av bacteriorhodopsin (Br) i lilla membraner (~ 6 mg protein / ml i avionisert vann) på toppen av overflaten IRE (~ 0,2 cm 2 område). Tørk proteinsuspensjonen under en forsiktig strøm av tørr luft inntil en film er oppnådd.
    6. Mål absorpsjonen spekteret av den tørre film (se figur 1).
    7. Tilsett 20-40 pl av en buffer med høy ionestyrke for å rehydrere det tørre film (f. eks, 4 M NaCl, og 100 mM Näpi ved pH 7,4). Merk: Den høye ioniske styrken hindrer overdreven svelling av membranfilmen, slik at for å beholde så mye protein som mulig nær probet overflaten (figur 2).
    8. Dekk til ATR holderen med et lokk for å hindre at vann fordamper. Alternativt plasseres et deksel-jakke som er koblet til en sirkulasjons-bad satt til 25 ° C for temperaturkontroll. For proteiner med lange photocycles (& #62, sekunder), kan temperaturkontroll øke baseline stabilitet.
    9. Mål en Absorpsjonsspekteret. Beregn prosentandelen av gjenværende prøven ved overflaten etter rehydratisering av filmen ved å subtrahere absorpsjonsspektrum av buffer (figur 3).
    10. Kontroller stabilisering av filmen svelling ved opptak absorpsjonsspektre på 5-20 min intervaller etter rehydrering (figur 4). Dette trinnet er valgfritt, men anbefales.

    Tre. Utføre Sende Eksperimenter på vaskemiddel-oppløseliggjort channelrhodopsin-2

    1. Tilsett 10 pl av CHR2 (~ 10 mg protein / ml) oppløst i 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) og decyl-maltoside (DM) på midten av en BAF 2-vindu av 20 mm diameter. Fordel det ved hjelp av mikropipette spissen til en 6-8 mm diameter (protein overflatetetthet på ~ 200 mikrogram / ​​cm 2).
    2. Form en film USIng en svak strøm av tørr luft. For best resultat at filmen er homogen og har en diameter som omtrent samsvarer med størrelsen av den infrarøde strålen mot den største åpningen.
    3. Hydrat filmen ved tilsetning av 3-5 ul av en blanding av glycerol / vann fordelt i 3-5 dråper rundt den tørre film, og tett lukke det med et annet vindu ved å bruke en flat silikon O-ring av ≥ 1 mm tykkelse. Merk: Forholdet mellom glycerol / vann-blanding styrer den relative fuktighet mellom vinduene 54. For hydroskopiske prøvene bruker en 3/7, eller 2/8 glycerol / vann-forhold (w / w). Den glycerol / vanndråper skal aldri være i direkte kontakt med det proteinfilm.
    4. Sett BAF 2 klemt vinduer i en holder. Forhindre rett lys fra å nå frem til detektoren ved å dekke prøven vindu med en IR ugjennomsiktig materiale, slik som papir, med et hull som samsvarer med størrelsen av det hydratiserte film. Plasser holderen i prøvekammeret.
    5. Kontroll av temperaturen av holderen til 25 °C av en termojakke koplet til en temperaturstyrt sirkulasjons bad.
    6. Mål et absorpsjonsspektrum. Påse at den maksimale absorpsjon i amid I region (~ 1,700-1,620 cm -1) er i området fra 0,6 til 1,0.
    7. Estimer masse og molar-forhold av protein / vaskemiddel / vann fra absorbsjons-spekteret av den hydratiserte film (figur 5) ved hjelp av referanse ekstinksjonskoeffisient spektra for vann, DM, og representative membranproteiner (figur 6).
    8. Vent til hydrering nivået stabiliserer seg før du utfører trinn-skanningsforsøk (≥ 1 time).

    4. Justering og synkronisering av Spennende Laser

    For forsøk med bR bruke andre harmoniske utslipp av en pulset Nd: YAG laser (λ = 532 nm) for å utløse PHOTO. For forsøk med CHR2, bruke en eksitasjon av λ = 450 nm som tilbys av en optiske parametrisk oscillator (OPO) som drives av den tredje harmoniske (λ = 355 nm) av en Nd: YAG-laser. Kontroller at laserpuls er tilstrekkelig kort (~ 10 EFF) for å minimere sekundær foto-eksitasjon. Merk: energien av laserpulser bør være så konstant som mulig. I vår oppsett, svinger laserintensiteten ≤ 10% rundt middelverdien, som bekreftes ved å måle en refleks av laseren av en fotodiode som er koblet til en transient-opptaker, og integrering av responsen (figur 8).

    1. Par laseren til prøven. Juster energitetthet av laseren på prøven til 2-3 mJ / cm 2 per puls ved hjelp av en strøm-måler.
      1. For ATR oppsett, bruker en optisk fiber plassert på toppen av ATR lokket.
      2. For overføring eksperimenter, bruker speil for å bringe laseren til prøven og, hvis nødvendig, linser til enten collimate eller divergere laserstrålen til en diameter litt over prøvefilmstørrelsen.
    2. Synkroniser lasemed dataopptak r puls av spektrometeret. Bruk av Q-bryteren synkroniserings ut TTL-puls for elektronikken i Nd: YAG-laser for å utløse spektrometer. Sett magnetisering frekvensen av Nd: YAG-laser til 10 Hz for bR og 0,25 Hz for CHR2, respektivt.
    3. Bruk en pulsforsinkelsesgenerator (PDG) for å styre laser magnetisering hastighet hvis repetisjonsfrekvensen av Nd: YAG-laser ikke er lett justerbar.
      1. Koble lampe synk-out av Nd: YAG-laser med PDG ekstern trigger-inngang. Den PDG gir et ~ 190 usekunder forsinket puls TTL-utgang til Q-bryteren sync-in-inngangen på Nd: YAG-laser for å utløse lasing. Gate PGD å akseptere en ekstern trigger bare etter en viss tid etter den siste aksepterte trigger (100 msek for bR eller 4-sec for CHR2).

    5. Time-løst Step-scan Forberedelser og innstillinger

    1. Plasser en lav pasning optisk filter i den optiske banen. For å utføre tids løst step-scan målinger i 1,800-850 cm -1 Spektralområde, bruke et filter ugjennomsiktig over 1950 cm -1 og med god transmisjon (> 50-80%) under 1800 cm -1 (figur 7).
    2. Endre detektoren fra AC til DC-koblet modus. Merk: Når denne justering interferogram signalet ikke lenger vil svinge rundt null, men over en verdi som er kjent som DC-nivå.
    3. Bruk størst mulig stråleåpning på spektrometeret for høyere foton fluks og dermed bedre signal-til-støy, men innenfor rammen av linearitet detektoren.
    4. Ta med DC-nivået på interferogram til null og justere elektroniske gevinst å gjøre bedre bruk av dynamisk spekter av analoge digitale konverterte (ADC). Oppnå DC-nivå motvirket ved å påføre en spenning bias til signalet levert av pre-forsterker. Merk: Dette alternativet er inkludert i moderne FT-IR-spektrometre. Ellers kan en hjemmelaget eksterne enheten brukes i stedet, plassert mellom forforsterkeren og ADC 38. Care er danødvendig for å sikre at all elektronikk ved en slik enhet er rask og lineær.
    5. Start step-scan menyen i FT-IR spektrometer. Angi målet spektral båndbredde for trinn-scan måling til 1,975.3-0 cm -1. Juster den spektrale båndbredde til en brøkdel av He-Ne laser-bølgetall (1/8 th i foreliggende tilfelle), noe som overstiger den cutoff av det optiske filter.
    6. Deaktivere noen high-pass elektronisk filter for å hindre forvrengninger av kinetikken på senere tidspunkt. Et low-pass elektronisk filter kan være fordelaktig når det cutoff frekvens er i orden eller høyere samplingsfrekvensen ADC (reduserer støy aliasing).
    7. Sett spektral og fase oppløsning til 8 cm -1 og 64 cm -1, henholdsvis. Sett interferogram oppkjøpsmodus til single-siden fremover. Med disse alternativene en interferogram krever ca 500 poeng.
    8. Sett samplingsfrekvensen ADC til den mest tilgjengelige i spektrometeret (f.eks 160 kHz, eller 6,25 usekunder). Still "trigger for eksperimentet" til "External", det vil si, er laser master. Angi antall lineært linjeavstand datapunkter som skal tas opp: 7000 for BR (opp til 42 msek) og 20.000 for CHR2 (opp til 125 msek). Merk: Lengre tidsskalaer kan dekkes uten overfylte ADC minnet ved hjelp av en kvasi-logaritmisk tidslinjeavstand eksterne TTL pulser fra en bølge generator for å utløse datainnsamling 38, eller ved å bruke to parallelle forbigående opptakere som erstatning for den interne ADC 31, 32.
    9. Spar ca 100 pre-triggerpunkter som referanse for den mørke tilstanden av prøven. Legg merke til: I millisekund tidsskala datakvaliteten er ofte begrenset av svingninger i det mobile speil. Økning av pre-triggerpunkter over 100 er derfor ikke forventet å betydelig forbedre datakvaliteten.
    10. Angi antall co-tilleggene, dvs. antall gjennomsnitt av photoreaction per speil position. For bR, bruker 20 co-filer (20 min for å måle tid på 10 Hz eksitasjon sats). For CHR2 bruke to co-filer (70 min for å måle tid på 0,25 Hz eksitasjon sats)
    11. Gjenta eksperimentet 10x for BR, og 35x på tre forskjellige prøvefilmer for CHR2, å endelig ha ~ 200 co-tilleggene pr speil posisjon.

    6. Data Processing

    1. Bekrefte statusen for prøven ved å sammenligne lysindusert IR forskjell spektrum oppnådd fra den første og den siste måling. Vurder å forkaste målinger hvor intensiteten av forskjellen spektrum faller under 60% av den første målingen.
    2. Gjennomsnittlig de registrerte interferogrammer.
      1. Bruke OPUS programvaren fra FTIR spektrometer velge tids-løst interferogrammer til gjennomsnittlig og legge dem til "Spectrum Calculator".
      2. Klikk "=" for å få gjennomsnittet av interferogrammer.
        Merk: Når fase av interferogramer konstant under målingen det er likegyldig til gjennomsnittlig interferogrammer eller single-kanal spektra. En konstant fase kan bekreftes ved å beregne og sammenligne fasespekteret for den første og den siste registrerte interferogram.
    3. Utfører Fourier-transformasjon av de tidsgjennomsnitts-løst interferogrammer å oppnå gjennomsnittlig tid-løst enkelt kanal spektra.
      1. Bruker samme programvare som i trinn 6.2.1, velg gjennomsnitt tid-løst interferogram og klikk på ikonet for "interferogram til spektra". Bruk Mertz fasekorreksjonsmetode, en null-fylling faktor på 2 (to digitale poeng per instrumental oppløsning), og en apodization funksjon (f.eks, trekant, Blackmann-Harris 3-vilkår, etc.).
      2. Klikk nederst "konvertere" til å forvandle den tid-løst interferogram inn tid-løst spektra.
    4. Eksportere tid-løst enkeltkanal data som en "datapunkt bordet" eller en "; Matlab "fil ved å bruke" lagre som "-ikonet i OPUS programvare. Fortsett databehandlingen i et eksternt program.
      1. Gjennomsnittlig ettkanals spektra før laseren, og konvertere den tid-løst enkeltkanaldata til annen-løst absorpsjon forskjell spektra.
      2. Beregn en vektor for forventet støystandardavvik i forskjell-spektra som en funksjon av bølgetall (figur 12), ved hjelp av støy standardavvik, ε, og betyr, S 0 (ν), av 100 enkelt kanal spektra forut for laser: ε / S 0 (ν). Verdien av ε er beregnet å subtrahere sammenhengende enkeltkanal-spektra og beregne standardavviket korrigeres ved √ 2.
      3. Fjern spektrale regioner for mye støy til å være i bruk (for eksempel over 1825 cm -1 og under 850 cm -1).
      4. Utfør et kvasi-logaritmisk gjennomsnitt (f.eks 20 spektra / tid tiår). Den appearance av dataene vil forbedre og antall spektra blir redusert fra 10 ~ 4 til 10 ~ 2 uten noen vesentlig informasjon tapt (figur 9).
      5. Øk fire ganger spektral tetthet av punkter (til ett punkt / cm -1) ved hjelp av Fourier interpolering (post null-fylling).
        Merk: Vi utfører trinn 6.4.1 til 6.4.4 i en hjemmelaget program som kjører i MATLAB.
    5. Behandle fått tid-løst spektra (figur 10A) med singulærverdidekomposisjonen, SVD, (Figur 13). Oppnå data denoising ved å rekonstruere dataene med et begrenset antall betydelige SVD komponenter (Figur 10b). Merk: Vi utfører SVD i MATLAB, ved hjelp av den innebygde "SvD"-funksjonen.

Representative Results

Figur 1 viser et absorpsjonsspektrum av en tørr film av bR avsatt på overflaten av diamanten intern refleksjon element som brukes for ATR-spektroskopi. Karakteristiske bånd fra vibrasjoner av peptidbindingen (amid A, amid I og amid-II) er klart skjelnes. Den omtrentlige tykkelse av den tørre filmen kan estimeres som ~ 1 mikrometer, tatt i betraktning mengden av tilsatt protein (18 pg), og overflaten av ATR (~ 0.2 cm 2), og å ta tettheten av protein som ~ 1,4 g / cm 3, 58 og av lipider som 1,0 g / cm 3, 59 og en lipid / protein-forhold på 1/3 (v / v) i purpur membranen 60..

Den tørre film ble rehydrert med overskudd av 4 M NaCl, 100 mM Näpi ved pH 7,4 (figur 3). Hydratiseringen nivå og effektiv proteinkonsentrasjon i volumet probet med den flyktige bølge kan utledes fra skaleringsfaktoren nødvendig for å fjerne digitalt absorpsjonssporfra vann. Den optimale skaleringsfaktor var 0,87, noe som betyr at i dette tilfellet bufferen opptar 87% og prøven 13% av volumet i nærheten av overflaten. Å ta hensyn til protein-og lipid tetthet og lipid / proteinforholdet i lilla membraner (se ovenfor), kan vi utlede et effektivt protein-konsentrasjon på 125 mg / ml i volum probet med flyktige bølgen. Vi kan utlede fra hydration nivå som, i dette spesielle tilfellet, prøvefilmtykkelse utvidet ~ 6 ganger på rehydrering, fra ~ 1 til ~ 6 mikrometer. For en 45 ° vinkel hendelsen, typisk for vår og for de fleste ATR-ordninger, den inntrengningsdybde av det flyktige feltet (d p) for et hydratisert proteinfilm varierer mellom 0,3 og 0,6 mikrometer i det 1,800-850 cm -1 intervall 61.. Ettersom det flyktige feltet er nesten ufølsom for prøven plassert to ganger over d p 61, antyde vi at mengden av protein som brukes i eksperimentet ATR kan være i prinsippet reduseres 5x without noe betydelig tap av signal.

Ved bruk av buffere med lavere ionestyrke filmen ekspanderer mer, og mengden av protein i volumet probet med det flyktige feltet blir redusert (figur 2). Den nøyaktige avhengighet mellom film hevelse og ionestyrken av bufferen, vil avhenge, blant andre faktorer, av arten av lipidene. For eksempel ble en lignende film hevelse som oppnådd her for bR i purpur-membran ved anvendelse av 4 M NaCl erholdt for et membranprotein rekonstituert i polar E. coli lipider bruker bare 0,1 M NaCl 62. Hvis prøven opptar mindre enn 5% av volumet probet vurdere re-gjør hydrering trinn ved hjelp av en buffer med høyere ionestyrke. Film hevelse etter hydrering krever en viss tid for å nå stabilisering (fig. 4). For bR i lilla membran prosessen er monoexponential, med en tidskonstant på 12 min: det tar mer enn 30 til 60 min for å få en stabil film rehydratisert

Fig. 5 viser et IR-absorpsjonsspektrum av en hydratisert film av CHR2 erholdt ved overføring. Her ble hydrering oppnådd ved å utsette den tørre filmen i en atmosfære av kontrollert fuktighet levert av en blanding av glycerol / vann. Spekteret kan dekomponeres i bidragene fra vann, vaskemiddel og protein. Vi kunne anslå mengden av hvert av dem ved hjelp av utsluknings koeffisienten-spektra, skalert for å passe til den eksperimentelle spektrum. For vann tok vi ekstinksjonskoeffisient spektrum fra litteraturen 63, og for DM målte vi den fra en 100 mg / ml (figur 6). Vi har også benyttet ekstinksjonskoeffisientene for to representative membranproteiner: mitokondrie ADP / ATP transportør 64 og BR (figur 7). Skaleringsfaktoren angir et vann-og DM-masseoverflatetetthet på 260 mikrogram / ​​cm 2, og 200 mikrogram / ​​cm 2 i filmen, respektivt. De resterende absorpsjon (Figure 5, kommer rød linje) hovedsakelig fra protein, beregnet til å være ved en overflatetetthet på 250 mikrogram / ​​cm 2 ved hjelp av amid-II ekstinksjonskoeffisient fra to forskjellige membranproteiner (se figur 6). Det molare forhold til protein / vaskemiddel / vann ble beregnet til å være 1/60/2000 ved hjelp av en molekylvekt på 35 kDa, 480 Da, og 18. Da, respektivt.

En 3D-plott fra typiske tid-løst steg-scan FT-IR eksperiment på BR er presentert i figur 10A, innhentet av ATR og involverer 200 min av datainnsamling. Spectra kan utvinnes på bestemte tidspunkt, for eksempel når L-, er m og n mellomprodukter av den bR PHOTO forventes å nå sitt høyeste populasjon (figur 11). Deres spektrale funksjoner har blitt beskrevet omfattende 13,41,65 og vil bli ikke nærmere omtalt her. Figur 12 viser tids spor på noen utvalgte wavenumbers. Nemlig, økningen av kinetikken på 1762 cm -1 (t 1/2 ~ 60 usekunder) rapporterer om dynamikken i Asp85 protonering fra retinal Schiff basen 66, og dens forfall til null indikerer sin deprotonering på bakken-sate utvinning 67. Den negative økningen av kinetikken på 1740 cm -1 (t 1/2 ~ 1 msek) rapporterer om deprotonering av Asp96 sidekjede, proton donor til basen 68. Schiff. Nedbrytningen av intensiteten til null rapporter om sin reprotonation fra cytoplasma 67.. Dynamikken i protein konformasjonsendringer kan bli analysert ved absorpsjon endringer i amid I-og amid-II-region, som når en maksimal forandring i ~ 3 msek ved romtemperatur 67,69.

Anvendelsen av SVD til spektroskopiske problemer har blitt anmeldt før 55,56. I korthet factorizes SVD de eksperimentelle data, anordnet i en matrise A, som: A = U S T. Dette faktorisering kan endres for å ta høyde for støy avhengighet av bølgetall og å straffe Svingninger / fonner i referanse 57. Kolonnene av U og V inneholder ortonormal spektra og tids spor vektorer for SVD hver komponent, henholdsvis. S er en diagonal matrise som inneholder de såkalte enkeltverdier. De (Abstract) spektrofot-temporale komponenter i U og V vises i avtagende relevans for å beskrive de eksperimentelle data i det minste kvadraters forstand, kvantifisert ved deres tilhørende enkeltverdi. Figur 13A viser de singulære verdier som en funksjon av komponentnummer, og reproduserer de første åtte kolonner / komponenter av U (abstract spektra, figur 13B) og V (abstrakt tids spor, Figur 13C). Signalet blir konsentrert i de første fem komponenter (som forventet for et photocycle inneholder fem mellomliggende statene), med komponenter ovenfor i stor grad dominert av tilfeldig støy og andre feilkilder. Den eksperimentelle data ble rekonstruert ved hjelp av bare de første fem kolonner med U og V, og de ​​første fem kolonner og rader med S. Dataene rekonstruert av SVD representerer den beste minste kvadraters tilnærming av eksperimentelle data til en matrise av rang fem. Den rekonstruerte data viser økt kvalitet (Figur 10B). Nemlig, er støyen i stor grad redusert, samt noen knapt merkbare variasjoner og fonner i referanse (vanlig i tid-løst trinn-scan-spektroskopi 25). SVD behandling er spesielt gunstig for å forbedre kvaliteten av de eksperimentelle tids spor i millisekundområdet (røde linjer i figur 12).

Tids løst step-skannedata for CHR2 PHOTO ble innhentet ved hjelp av de ovenfor beskrevne protokollen for overførings sjonsforsøk (Figur 14A), omtrent som involverer 120 hr av akkumulerte målinger. Den tid-løst data samlet inn av step-scan strekker seg fra 6,25 usekunder til 125 msek. Den PHOTO av CHR2 krever omtrent 60 s for full gjenoppretting. Den siste delen av PHOTO kan dekkes ved hjelp av hurtig-scan FT-IR, og begge trinn-scan og hurtig-scan datasett fusjonert som presenteres andre steder 48. De spektrale endringer av CHR2 er ~ 10 ganger mindre enn de som får fra bR, noe som gjør målingene mer utfordrende. Spesielt, svingninger i referanse i millisekund serien blir tydelig på disse lave absorpsjon endringer. Dette er på grunn av små svingninger i det mobile speil i millisekundtidsskalaen 25.. Svingninger, sammen med en del av støy, kan i stor grad fjernet av SVD, bemerkelsesverdig forbedre utseendet på dataene (Figur 14B).

gure en "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Absorption spektrum av bR med fiolett membran tørkes på toppen av diamantflaten av en ATR tilbehør. Bånd fra vibrasjoner av peptidbindingen (amid I, II, og A) er angitt.

Fig. 2
Figur 2. Absorpsjonsspektrum av en film av bR etter utvanning ved hjelp av buffere med forskjellige ionestyrker (fortynninger av 4 M NaCl, 100 mM Na HPO 2 4 / NaH 2 PO 4 ved pH 7,4). Merke til reduksjon av amid-II-bånd, dvs. økt film svelling, med synkende ionestyrke av buffer. (Sett) Relativ mengde av protein i nærheten av overflaten, kvantifisert ved intensiteten av absorbans ved 1541 cm -1 (amid II maksimum) etter subtractipå av absorpsjon bidraget av buffer.

Figur 3
Fig. 3. Absorpsjonsspektrum av en film av bR rehydrert med bulk-buffer (4,3 M ionestyrke) og etter subtraksjon av buffer bidrag. Denne subtraksjon faktor, 0,87, ble valgt for å fjerne den sterke vannopptak mellom 3,700-3,000 cm -1 og for å skaffe en flat grunnlinje mellom 2,700-1,800 cm -1.

Figur 4
Fig. 4. Absorption spektrum av bR etter rehydratisering med en buffer av 4,3 M ionestyrke (buffer absorpsjon er blitt subtrahert for klarhet som i figur 3). Innsatsen viser utviklingen av filmen hevelse etter rehydration, fulgt av protein amid II absorbans ved 1541 cm -1. En tilpasning til en enkelt eksponensiell angir en tidskonstant for film svellende stabilisering av 12 min.

Figur 5
Figur 5. Absorpsjonsspektrum av en hydratisert film av CHR2 målt ved transmisjons (blå linje). The ekstinksjonskoeffisient spektrum av vann (stiplet linje orange) og DM (stiplet linje cyan) ble skalert og subtrahert (rød linje).

Figur 6
Figur 6. Gjen utryddelse massespektra koeffisient ved 25 ° C for flytende vann (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) og for en hydratisert film av ADP / ATP bærer (AAC) 64 . Trong> Utryddelse masse koeffisient-spektrum ble målt i en oppløsning for DM (100 mg / ml), og i en hydratisert film for bR.

Figur 7
Figur 7. Transmisjon av den optiske filter anvendes i de tid-løst scan-scan FT-IR-målinger.

Figur 8
. Figur 8 Utførelse av laser-pulser som leveres av den andre harmoniske (532 nm) av en Nd:. YAG laser Histogram av variasjonen av den relative energien i 1000 laserpulser, og passer til en Gaussisk fordeling med et standardavvik på 0,05.

1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 9. Light-indusert absorbans endringer av bR på tre representative wavenumbers på uniform tid avstandsintervaller (grønn, svart og blå linjer) og etter kvasi-logaritmisk gjennomsnitt til ~ 20 poeng / tiår (røde linjer). Legg merke til støyreduksjon etter logaritmisk midling, avslører oscillasjon av tiden Spor i millisekund serien.

Fig. 10
Figur 10. Fremstilling 3D i lys-induserte endringer i absorbansen til bR registrert av ATR ved pH 7,4 (4 M NaCl, 100 mM Näpi). A) Rådata. B) data rekonstrueres med fem SVD komponenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 11. FT-IR forskjell absorpsjonsspektra av bR PHOTO på tre valgte tidspunkter hvor L (12.5 usekunder), har M (300 usekunder), og N-(6 msek) mellomprodukter mest anriket.

Fig. 12
Figur 12. Proton overføring og protein ryggrad dynamikk i BR PHOTO som løses av tid-løst steg-scan FT-IR forskjell spektroskopi. Absorbans endringer på 1762 cm -1 rapporter på protonering / deprotonering dynamikken i Asp85, og på 1741 cm -1 på deprotonering / reprotonation dynamikken i Asp96 (inkludert H-binding endringer før 300 usekunder). Tids-spor på 1670 og 1555 cm -1rapportendringer amid I og II vibrasjoner såvel følsomme for konformasjon av peptidet ryggrad. Baksiden spor tilsvarer rådata, og de ​​røde til SVD-behandlede data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 13
Figur 13. Singulærverdidekomposisjonen (SVD) av de eksperimentelle tid-løst steg-scan FT-IR-data av BR PHOTO (se figur 10A). SVD ble utført etter veiing eksperimentelle data tar hensyn til støy standardavvik avhengighet av bølgetall (Figur 15); kombinert med den 1. deriverte for å redusere statistisk vekten av utgangssvingningen, som beskrevet tidligere 57. A) og #160; plott av de relative singulære verdier av de første 50 komponentene (svarte sirkler). De første fem komponenter er tilordnet signalkomponenter (røde sirkler). Resten av komponenter forfall eksponentielt som forventet for støy-komponenter (se stiplet grå linje). B) Først åtte abstrakt spektra (U 1 til U 8). C) Først åtte abstrakte tids spor (V 1 til V 8). Den abstrakte spektra og tids spor tildelt signal er avbildet i røde linjer, og med svarte linjer ellers. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 14
Figur 14. 3D-representasjon av lys-indusert IR absorbans endringer for CHR2 registrert for trinn-scani overføringsmodus. Trinnet-scan data strekker seg helt til 125 msek, bare dekker en del av PHOTO. A) Rådata. B) Data rekonstruert med fem SVD komponenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 15
Figur 15. Beregnet støynivå i en FT-IR. Difference absorpsjon spekteret på 6,25 usekunder timelig og 8 cm -1 spektral oppløsning for et eksperiment som involverer en co-addition/mirror stilling (500 fotoreaksjoner) eller ~ 200 co-addition/mirror stilling (10 5 fotoreaksjoner). Verdier vises for den dempes total refleksjon (ATR) og oppsett overføringen.

Discussion

En av de første aspekter som må vurderes ved utføring av tid-løst trinn-scan FT-IR-eksperimenter på en protein er fremstillingen av et eksempel på en egnet form for IR-spektroskopi. IR-absorpsjon fra andre kilder enn proteinet av interesse stoffer må reduseres, spesielt det fra vann. Den mest vanlige metode er å fordampe det meste vann av prøven for å danne en film. Filmen kan bli rehydrert enten ved å tilsette noen dråper av en vandig løsning, eller ved å utsette filmen for en atmosfære med kontrollert fuktighet. Vi har vist hvor i begge tilfeller er det mulig å beregne væskenivået oppnås ved hjelp av IR-absorpsjon-spektroskopi (se figur 3 og figur 5). Selv om de oppnådde fuktighetsnivået kan synes lavt sammenlignet med de i oppløsning, er de faktisk nær de man finner i levende celler 70, noe som gjør undersøkelsen av hydrerte filmer av proteiner funksjonelt relevante. Foruten vann, deter også viktig å vite og å kontrollere mengden av lipid eller vaskemiddel i prøven. Begge bør holdes lav nok til å ha en redusert spektroskopisk innvirkning i IR-absorpsjon, men høy nok til å opprettholde integriteten og funksjonen av proteinet av interesse.

Time-løst step-scan spektroskopi er bare aktuelt oversiktlig til proteiner som viser reversible reaksjoner som kan utløses reproduserbart av lys (men se fremgang i kopling trinn-scan med rask buffer utveksling) 71. I trinn-skann reaksjonen må være reproduserbar i minst ~ 500x, til det minimale antall fullføre et interferogram som dekker 1,800-850 cm -1 region på 8 cm -1 oppløsning. I praksis vil imidlertid ytterligere data i snitt er vanligvis nødvendig for å skyve støynivået ned. For 200 co-additions/mirror stilling (10 5 repetisjoner av reaksjonen) en 6,25 usekunder oppløsning absorbans forskjell spekteret kan vise en støy standard avvik mellom 2 x 10 -5 og 2 x 10 -4 til en ATR og mellom 5 x 10 -6 og 3 x 10 -5 for en transmisjon eksperiment (figur 15). Takket være sin høyere foton gjennomstrømning, transmisjonen gir for ~ 7 lavere støynivå enn ATR, et viktig aspekt for å lykkes med å studere prøvene gir svake absorpsjon endringer som CHR2. På den annen side, ATR krever 5 til 25 ganger mindre prøve enn en transmisjonseksperiment.

Anvendelsen av tid-løst steg-scan FT-IR spektroskopi er problematisk for proteiner viser langsomme photocycles: opptak en interferogram for trinn-scan kan bli upraktisk lang. Noen løsninger har blitt presentert for å håndtere slike saker 72,73, ofte basert på bruk av flere utskiftbare prøver å fremskynde målinger på bekostning av økt protein forbruk og eksperimentell kompleksitet 27,74. I noen tilfeller er det mulig å omgå dette problem ved exsiterer prøven før PHOTO er strengt gjennomført. For CHR2, med en PHOTO krever etter bilde-eksitasjon 60 sek for 99% gjenvinning, er oppgangen på 4 sek allerede på 80% 48. Med en eksitasjon virkningsgrad på 10% per laserpuls, 98% av CHR2-molekyler er i mørket tilstand 4 sekunder etter foto-eksitasjon, noe som gjør mulig å utføre forsøk med en laser repetisjonsfrekvens på 0,25 Hz.

Databehandling er en endelig tekniske aspektet som kreves for å oppnå best mulig resultater. Logaritmisk gjennomsnitt reduserer støy og, også viktig, reduserer størrelsen på data uten forvrengninger, en funksjon avgjørende for posteriore dataanalyse ved hjelp singulærverdidekomposisjonen eller global montering. Logaritmisk gjennomsnitt er imidlertid ikke særlig vellykket i snitt av svingninger i de tid-spor som forårsakes av svingninger i det mobile speil og andre 1 / f-støykilder under målingene (figur 9). Disse svingningene i referansekan overstige støyen i millisekundområdet og ødelegge kvaliteten på dataene. Singulærverdidekomposisjonen utnyttet redundans av data for å redusere støy, og med noen modifikasjoner 57 det kan redusere så vel svingninger i baseline.

Endelig er, desto vanskeligere og mest tidkrevende del av en tidsoppløst trinnskanning FT-IR forsøket tilsvarer tilordningen av båndene og til den spektrale og kinetisk tolkning av dataene. For bacteriorhodopsin mange av bandene som opptrer i IR forskjellen spektra har blitt tildelt, eller tolket takket være den akkumulerte arbeidet til mange forskergrupper over flere tiår. For en mye mindre studert protein, slik som channelrhodopsin-2, er de ovenfor presenterte tid-løst IR eksperimenter må være ledsaget av parallelle eksperimenter på mutanter site-directed, og i kombinasjon med informasjonen fra komplementære teknikker for å oppnå en mekanisk tolkning 48..

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
Diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
Thermostatic bath Julabo F25
Vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0 Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
MATLAB run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochemistry. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin's intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochemistry. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochemistry. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. , John Wiley and Sons. (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons. (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , CRC Press. 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. Handbook of vibrational spectroscopy. , John Wiley & Sons Ltd. (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochemistry. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochemistry. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin's intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

Biofysikk bacteriorhodopsin channelrhodopsin svekket total refleksjon proton overføring proteindynamikk infrarød spektroskopi tid-løst spektroskopi step-scan membran proteiner singulærverdidekomposisjonen
Proton Transfer og Protein konformasjon Dynamics i Lysfølsomme Proteiner av Time-løst Step-skanne Fourier-transform infrarød spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lórenz-Fonfría, V. A.,… More

Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter