Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Published: October 19, 2014 doi: 10.3791/51623
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Neurosurgery, University Medical Center Utrecht, 2Brain Center Rudolf Magnus, University Medical Center Utrecht

Summary

الحويصلات خارج الخلية تلعب دورا هاما في العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، وسرطان أو وكلاء العلاجية المحتملة كما في تسليم المخدرات أو الطب التجديدي. يعرض هذا البروتوكول أساليب لتقدير حجم وخصائص الحويصلات خارج الخلية المعزولة وغير المعزولة في السوائل المختلفة باستخدام الاستشعار عن الانضباطي مقاوم النبض.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية)، بما في ذلك "microvesicles 'و' exosomes، وفيرة للغاية في سوائل الجسم. وقد شهدت السنوات الأخيرة زيادة هائلة في الاهتمام المركبات الكهربائية. وقد ثبت المركبات الكهربائية للعب أدوار مهمة في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، والسرطان. بالإضافة إلى ذلك، المركبات الكهربائية المحتملة لها كعوامل علاجية، على سبيل المثال بوصفها وسائل إيصال المخدرات أو الطب التجديدي. بسبب صغر حجم (50 إلى 1،000 نانومتر) الكمي الدقيق وحجم التنميط من المركبات الكهربائية يمثل تحديا تقنيا.

يصف هذا البروتوكول كيف الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار (الحزب الراديكالي عبر الوطني) والتكنولوجيا، وذلك باستخدام نظام qNano، يمكن أن تستخدم لتحديد تركيز وحجم المركبات الكهربائية. الطريقة التي تعتمد على الكشف عن المركبات الكهربائية على نقلهم من خلال المسام نانو الحجم، سريع نسبيا، يكفي استخدام أحجام عينة صغيرة ولا تتطلب بورification وتركيز المركبات الكهربائية. ارتفعت عينات المقبلة لبروتوكول عملية منتظمة يوصف نهج بديل يستخدم مع الخرز البوليسترين من حجم معروف والتركيز. هذا في الوقت الحقيقي تقنية المعايرة يمكن استخدامها للتغلب على العقبات الفنية اجه عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السوائل البيولوجية.

Introduction

الحويصلات من أصل الخلوي وفيرة للغاية في سوائل الجسم 1. تتشكل - (1،000 نانومتر في حجم 50) إما الانصهار هيئات متعددة حويصلي مع الغشاء الخلوي أو عن طريق التبرعم الخارجي المباشر للغشاء الخلوي هذه يسمى الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية). في السنوات الأخيرة، والفائدة العلمية في المركبات الكهربائية ازداد الى حد كبير، مما أدى إلى عدد كبير من المطبوعات التي تركز على EV، التي تم وصفها وظائف وخصائص المركبات الكهربائية الجديدة 1. ويعتقد أن المركبات الكهربائية الآن أن تشارك في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل نقل الإشارة، وتنظيم المناعة، وتخثر الدم 1-4. في السرطان، يبدو أن السيارات الكهربائية للعب دور في تشكيل منافذ premetastatic 5،6، ونقل المحتوى الموالية لل7،8 السرطاني وتنشيط الأوعية الدموية 8. بالإضافة إلى ذلك، يتم استكشاف المركبات الكهربائية كوكلاء تسليم العوامل العلاجية 9.

على الرغم من هذه ديvelopments، الكمي موثوق بها من المركبات الكهربائية لا يزال تحديا. تقليديا، يتم استخدام أساليب القياس الكمي غير المباشرة، التي تعتمد على القياس الكمي لمحتوى البروتين الكلي أو بروتينات معينة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، وهذه التقنيات لا تشكل البروتين لكل EV الاختلافات، ولا تميز بين تلويث المجاميع البروتين والبروتينات في المركبات الكهربائية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات تتطلب عزل المركبات الكهربائية، مما يجعل المقارنة بين تركيزات EV في العينات البيولوجية مستحيلا في كثير من الحالات.

ولذلك، تبذل جهود لتطوير أساليب جديدة تسمح لقياس EV أكثر دقة ومباشرة 10. ويصف هذا التقرير استخدام الانضباطي الاستشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني) لتقدير موثوق بها وحجم التنميط من المركبات الكهربائية.

حاليا، وqNano أداة (الشكل 1A) هو منصة فقط متاحة تجاريا للالحزب الراديكالي عبر الوطني. في الحزب الراديكالي عبر الوطني، تتخللها غشاء مرن غير موصل وايعشر المسام نانو الحجم وفصل خليتين السوائل. يتم تعبئة إحدى الخلايا السوائل مع عينة من الفائدة، في حين يتم تعبئة الخلايا الأخرى مع خالية من الجسيمات بالكهرباء. عن طريق تطبيق الجهد، يتم إنشاء ل/ تدفق التيار الكهربائي الأيونية، والتي يتم تبديل على نقل الجزيئات من خلال المسام (الشكل 1B). حجم هذا الحصار الحالي ('نبض مقاوم') يتناسب مع حجم الجسيمات 11 (الشكل 1C). مدة الحصار يمكن استخدامها لتقييم إمكانات زيتا من الجزيئات، التي تعتمد على خصائص الجسيمات مثل تهمة أو شكل 12. حجم الجسيمات التنميط غير معروفة يمكن أن يؤديها من خلال مقارنة النبضات مقاوم تسببها الجزيئات غير معروفة مع نبضات مقاوم الناجمة عن الجسيمات التي يبلغ قطرها المعايرة المعروفة. إلى جانب ضخامة الحدث الحصار، ويقاس معدل هذه التي تحدث. هذا RELI معدل عددوفاق على تركيز الجسيمات. حيث أن تركيز ومعدل الحصار هم خطيا النسبي 13، باستخدام عينة معايرة واحدة مع تركيز جزيئات معروفة وحجم الجسيمات يسمح لقياس تركيز 14 و 11 من توزيع حجم عينة مجهولة.

يتم تحديد حركة الجزيئات من خلال ثقب النانو من قبل قوات الكهربائية kinetic- (الكهربي والكهربائية التناضحي) والموائعية 15. باستخدام وحدة ضغط متغير (VPM) فرق الضغط بين الخلايا السوائل يمكن أن يتسبب كقوة إضافية. تطبيق الضغط الايجابي يزيد من معدل تدفق الجسيمات، والتي قد تكون ذات فائدة عندما يكون تركيز الجسيمات منخفضة. أيضا، يمكن تطبيق ضغط للحد من تأثير القوى الكهربائية الحركية. هذا مهم خصوصا عند استخدام نانوية بقطر النسبي مسام صغيرة (NP100، NP150 وربما NP200) وغالبا ما تستخدم للكشف عن المركبات الكهربائية.لهذه نانوية حتى عند تطبيق ضغط كبير وقوى الكهربائية الحركية يمكن، اعتمادا على الجسيمات تهمة السطح، تبقى nonnegligible 16. عن طريق قياس معدل الجسيمات في ضغوط متعددة، وهو كهربية تصحيح حركيا، وبالتالي أكثر دقة، يمكن حساب تركيز EV.

هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتحديد حجم التوزيع وتركيز المركبات الكهربائية. بجانب بروتوكول تشغيل منتظم، وصفت نهج بديل حيث ارتفعت العينات مع الخرز البوليسترين من حجم معروف وتركيز 17. هذه التقنية المعايرة في الوقت الحقيقي يمكن استخدامها للتغلب على بعض التحديات التقنية واجهتها عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السوائل البيولوجية، مثل البول، والبلازما وزراعة الخلايا طاف، أو عند استقرار ثقب النانو على مدى فترة طويلة من الزمن قياس لا يمكن أن يكون ضمان.

Protocol

1. بروتوكول التشغيل القياسية

1.1 إعداد صك وإعداد العينات

  1. قم بتوصيل أداة لجهاز كمبيوتر مع برنامج Izon جناح تحكم مثبتة.
  2. اختيار حجم ثقب النانو لاستخدام: لحجم وقياس تركيز المركبات الكهربائية على NP150 (الهدف حجم نطاق 85-300 نانومتر) - وغالبا ما تستخدم أو NP200 (400 نانومتر الهدف حجم نطاق 100). عند العمل مع المركبات الكهربائية التي تم عزلها باستخدام البروتوكول الذي ينطوي على إزالة المركبات الكهربائية الكبيرة، على سبيل المثال عن طريق تمرير العينة من خلال مرشح 220 نانومتر، والمسام NP100 (الهدف حجم نطاق 70-200 نانومتر) يمكن استخدامها. عند العمل مع المركبات الكهربائية في عينة بيولوجية أو المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام بروتوكول مختلف، وNP200 يمكن استخدامها، وسوف تحصل على انسداد كثير من الأحيان أقل. نانوية أخرى مثل NP300 (الهدف حجم نطاق 150-600 نانومتر) أو NP400 (الهدف حجم نطاق 200-800 نانومتر)، أو نانوية حتى أكبر، ويمكن استخدامها لأنواع كبيرة من المركبات الكهربائية.
  3. اختيار calibr البوليسترينأوجه الجسيمات التي تكمل ثقب النانو بتحديده في الخطوة 1.1.2. لNP100، NP150 NP200 وثقب النانو استخدام CPC100، CP100 وCPC200 الجسيمات، على التوالي. لحجم التقدير الدقيق، وضمان أن الجسيمات المعايرة لها حجم مماثل كما الجزيئات غير معروفة.
  4. لضمان تجانس الجزيئات المعايرة، لفترة وجيزة دوامة (30 ثانية). اختياريا، وتطبيق صوتنة لإزالة الركام.
  5. تمييع الجسيمات معايرة في برنامج تلفزيوني لتركيز الهدف في حجم لا يقل عن 40 ميكرولتر. ملاحظة: يختلف تركيز الهدف على أساس ثقب النانو بتحديده في الخطوة 1.1.2. يتم تزويد تركيزات الهدف مع نانوية.
  6. تطبيق وإزالتها مباشرة 78 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على الخلية السوائل أقل. هذه ترطيب الخلية أقل السوائل يقلل من خطر تكوين فقاعة الهواء تحت ثقب النانو عند تطبيق المنحل بالكهرباء إلى الخلية السوائل أقل عندما يكون ثقب النانو هو في الموقف.
  7. وضع ثقب النانو على 4 الأسلحة الصك. استخدامالفرجار الرقمية لقياس المسافة بين اثنين من الأسلحة المعاكس والدخول في المسافة ملم إلى "تمدد" حقل الإدخال وانقر فوق "معايرة تمتد" لمعايرة تمتد ثقب النانو.
  8. تمتد ثقب النانو إلى 47 مم، بواسطة تحريك العجلة الجانبية وبالتالي زيادة المسافة بين أحضان المعارضة الصك، قبل تطبيقه 78 ميكرولتر PBS إلى الخلية السوائل أقل.
    ملاحظة: تدخل الكهربائية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على جودة القياسات. عند استخدام جهاز كمبيوتر محمول لتشغيل البرنامج Izon جناح التحكم، تأكد من توصيل الكمبيوتر المحمول إلى شبكة الكهرباء باستخدام مقبس المكونات والارض. أبقت الهواتف النقالة بالقرب من الصك يمكن أيضا أن يكون مصدر التداخل الكهربائي. ويلاحظ التداخل الكهربائي وقمم تتكرر باستمرار في خط الأساس الحالية، في كثير من الأحيان مع الجذر يعني مربع (RMS) ضوضاء> 10 السلطة الفلسطينية.
    ملاحظة: تقريبا أي عازلة يمكن استخدامها لتخفيف الجزيئات والمركبات الكهربائية لمعايرة الحزب الراديكالي عبر الوطني characterization. وجود الأملاح هو شرط أساسي لإنشاء تيار كهربائي. لقياسات EV استخدام PBS كمنطقة عازلة. ينبغي دائما أن تضعف جزيئات المعايرة في نفس عازلة مثل المركبات الكهربائية لضمان قياسات دقيقة.

1.2. تحديد الإعدادات المثلى للقياس

ملاحظة: قبل التسجيل، من المهم تأسيس إعدادات القياس المثلى. حجم الحصار الناجمة عن الجسيمات التي تمر عبر ثقب النانو تعتمد على امتداد التطبيقية والجهد تطبيقها. لقياسات موثوقة ينبغي أن تكون الضوضاء RMS <10 السلطة الفلسطينية والحصار حجم وضع يجب أن يكون> ​​0.1 غ.

  1. وضع الخلية السوائل العليا ويحمي قفص على ثقب النانو وإدخال 40 ميكرولتر من الجسيمات معايرة مخففة في الخلية السوائل العليا. استخدام VPM لتطبيق الضغط الايجابي ≥0.8 كيلو باسكال.
  2. الحد من امتداد تطبيق ببطء نحو 44 ملم في حين تحليل الأحداث الناجمة عن الحصار معايرةالجسيمات. ملاحظة: عندما خفض قطر المسام حركة الجسيمات من خلال ثقب النانو يكون أقل احتمالا وبالتالي ستنخفض نسبة الجسيمات. ولكن نظرا لزيادة الحصار النسبي للمسام حدثا الحصار أكبر سيحدث مما أدى إلى تحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء. زيادة الجهد قد يزيد من حجم الحصار ولكن يمكن أيضا زيادة الضوضاء RMS.
  3. تقليل تمتد حتى ويلاحظ الأحداث الحصار المناسبة (الشكل 1C) في لوحة "الإشارات تتبع". (وضع> 0.1 غ)، و سعر الجسيمات المقابل> 100 / دقيقة. ملاحظة: معدل الجسيمات هو أقل صرامة قطع، ولكن كما قياسات لا يقل عن 500 الجسيمات مثالية، فإن معدلات الجسيمات من <100 / دقيقة تسجيل يسبب فترات من 5 دقائق على الأقل. معدلات أعلى من الجسيمات 2،000 / دقيقة يمكن أن يؤدي في القياسات أقل دقة (إذا كان موجودا، يجب أن يتم تنفيذ عينة التخفيف).

1.3 قياس المعايرةالجسيمات، غسل خلية السائل UPER والقياس عينة

  1. في هذا القسم من المركبات الكهربائية طاف ثقافة خلية من خلايا ورم أرومي دبقي الأشكال خط الخلية U87-MG / EGFRvIII تتميز. وقد سبق وصف العزلة وإعداد هذه المركبات الكهربائية وتصور 18.
  2. وضع الجسيمات معايرة السوائل في الخلية العليا. الضغط (على سبيل المثال 0.8 كيلو باسكال) باستخدام VPM وسجل> 500 الجسيمات.
  3. إذا إجراء قياس ضغط متعددة، وزيادة الضغوط التي مورست (على سبيل المثال إلى 1.0 كيلو باسكال) وتسجيل ملف معايرة الثاني. ملاحظة: ما لا يقل عن 0.2 كيلو باسكال الفرق هو مطلوب.
  4. إزالة عينة المعايرة من الخلية السوائل العليا. غسل الخلية السوائل العليا 3 مرات مع 100 ميكرولتر PBS لإزالة جزيئات المتبقية. قبل إدخال العينة في الخلية العليا السوائل، واستخدام الأنسجة خالية من الوبر لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية من الخلية السوائل العليا.
  5. إدخال العينة إلى الخلية السوائل العليا. تأكد من أن خط الأساس الحالي هو ضمن 3٪ من خط الأساس الحالية لوحظ عند قياس الجسيمات المعايرة. إن لم يكن خلال 3٪، وتطبيق الاستراتيجية المبينة أدناه على استقرار خط الأساس الحالية. تطبيق الضغوط بالضبط كما ينطبق على الجسيمات المعايرة وتسجيل ملفات العينة.
    ملاحظة: معدل مؤامرة الجسيمات يجب أن يعرض كشف الجسيمات ثابت (الشكل 2A). في حال انقطاع مفاجئ للكشف عن الجسيمات، وانخفاض مفاجئ في التيار الأساسي، أو زيادة مفاجئة في RMS الضجيج، قد يكون انسداد المسام؛ وبالتالي، إيقاف التسجيل. من أجل استعادة الأساس، الصنبور أو تحريف الغطاء التدريع، وتطبيق المكبس، أو إزالة تماما ثقب النانو، وأغسلها بالماء منزوع الأيونات واستبدالها على الصك.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، زيادة ثقب النانو تمتد إلى 47 مم في تركيبة مع الضغط الأقصى من VPM لحوالي 5 دقائق.

1.4 تحليل البيانات

  1. انقر على "، تحليل البيانات "التبويب لدخول قسم تحليل البرمجيات. عملية معايرة وملفات العينة بالنقر بزر الماوس الأيمن على "الملفات غير المعالجة" واختيار "معالجة الملفات".
  2. انقر فوق خانة الاختيار بجانب العينة في عمود "معايرة" لزوجين ملفات العينة الى التسجيلات المعايرة. اختيار عينة المقابلة والمعايرة الملفات وانقر على "موافق". ملاحظة: عند استخدام خيار المعايرة متعددة الضغط اختيار "معايرة متعدد الضغط" علامة على اليسار لعينات متعددة الزوجين إلى ملفات المعايرة متعددة.
  3. مرة واحدة يقترن بنجاح، يقوم البرنامج Izon جناح تحكم عرض خصائص عينة مختلفة مثل حجم التوزيع (الشكل 2B)، فترات أساسية، العرض الكامل نصف كحد أقصى (FWHM) وتحليل التركيز. اختياريا: لكل عينة، ونقاط البيانات الفردية يمكن تصديرها كما فصلت فاصلة الملف.

2.بروتوكول lternative - التشويك عينات المعايرة مع الخرز

ملاحظة: بشكل عام، يمكن استخدام إجراءات التشغيل القياسية عند العمل مع المركبات الكهربائية المعزولة. عند العمل مع المركبات الكهربائية غير المعزولة في العينات البيولوجية، أو مستحضرات EV معزولة الملوثة مع المجاميع البروتين كبيرة، وتعمل الأداة يمكن أن يكون تحديا. تتكون هذه التحديات أساسا من ارتفاع معدل حجب ثقب النانو (انخفاض مفاجئ في التيار الأساسي)، وعدم القدرة على استرداد التيارات الأساسية داخل 3٪ من قياس المعايرة أو اختلافات كبيرة في معدلات الجسيمات بين عينات مماثلة (الشكل 3A). لعرض عينات من هذه الصعوبات بروتوكول بديل لقياس المركبات الكهربائية وضعت 17. وتعتمد هذه المنهجية على إدخال أكبر الخرز البوليسترين المعايرة في عينة من الفائدة (الشكل 3B). وتناقش إجراء مفصل لهذا البروتوكول البديل أدناه.

2.1. عينةإعداد

ملاحظة: عند إعداد العينات باستخدام طريقة بديلة، هو المطلوب لإنشاء EV نسبة إلى حبة من حوالي 1. أيضا، فمن الضروري أن تشمل "المعايرة حبة فقط" عينة، للسماح دقيقة "المحاصرة" لل الخرز المعايرة وتحديد عدد الجسيمات الخلفية (للالمجاميع سبيل المثال البروتين) موجودة في المخزن المؤقت.

  1. الطرد المركزي 100 ميكرولتر من خلية ثقافة طاف لمدة 7 دقائق في 300 x ج
  2. إضافة 20 ميكرولتر من طاف إلى 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 10 ميكرولتر من 75 مرات المخفف 335 نانومتر الخرز البوليسترين (الأسهم 7e10 / مل).

2.2. قياس عينة

  1. استخدام استراتيجية موضح في القسم 1.2 لتحديد الإعدادات الأداة المثلى.
  2. قياس "المعايرة حبة فقط" عينة الأولى. تأكد من أن الكشف عن خلفية من الجزيئات غير حبة صغيرة منخفضة قدر الإمكان (<10٪ من الخرز).
  3. قياس كل سا الفرديةmple مرة واحدة قبل يتطابق تسجيل من أجل توزيع التذبذب في ظروف ثقب النانو بالتساوي على عينات مختلفة. قياس لا يقل عن 3 مكررات من كل عينة.
  4. ويعيد قياس "المعايرة حبة فقط" عينة بعد الانتهاء من تسجيل جميع العينات.

2.3. تحليل البيانات

ملاحظة: عند استخدام بروتوكول بديل، الاستخدام الحصري من البرنامج Izon جناح مراقبة لا يكفي لحساب التركيز. مطلوب برنامج جداول البيانات إضافية. يبين الجدول 1 مثال على حساب تركيز العينات مبين في الشكل 3.

  1. فتح "المعايرة حبة فقط" عينة واحدة أو أكثر من ملفات العينة.
  2. تحديد الحصار الحدث الحجم (غير متوفر) يمكن أن تستخدم لمرة وقطع للتمييز بين المركبات الكهربائية والخرز البوليسترين. تحديد القيمة الحصار (NA) المقابلة لقاعدة اليسرى من السكان الخرز البوليسترين ( 3B). ملاحظة: تأكد من وضع متساو من بن الأحجام من جميع القياسات (يمكن تعديلها في "ViewSettings" التي يتم الوصول إليها عن طريق النقر على زر "المنبثقة" تحت "حصار تتبع الفردي").
  3. استرداد القيم من إجمالي عدد الجسيمات لكل عينة بالضغط على "تحليل الجسيمات ملخص" التبويب من العينة.
  4. تصفية مجموعات البيانات باستخدام مستوى قطع تحديدها في الخطوة 2.3.2. عن طريق اختيار "تصفية البيانات" المنبثقة. عرض فقط الجسيمات أصغر من قطع.
  5. استرداد قيم العد EV لكل عينة من "ملخص تحليل الجسيمات".
  6. طرح كمية من المركبات الكهربائية من مجموع الجسيمات لتحديد كمية من الخرز المعايرة.
  7. تحديد نسبة EV إلى حبة بقسمة عدد EV من قبل عدد المعايرة حبة.
  8. تحديد نسبة متوسط ​​الخلفية عن طريق حساب متوسط ​​النسب المقررة لكل و# 8220؛ حبة فقط "عينة المعايرة. طرح هذه القيمة من كل عينة على حدة.
  9. مضاعفة النسبة المعدلة EV إلى حبة من تركيز حبات المعايرة لتحديد تركيز المركبات الكهربائية لكل عينة.
  10. مضاعفة تركيز وجدت في الخطوة 2.3.9 من قبل عامل التخفيف EV الذي عرضته إضافة الخرز المعايرة للعينة EV. ملاحظة: في الإعداد سبيل المثال عينة، التخفيف الكلي للعينة في برنامج تلفزيوني والخرز المعايرة هو 2.5 مرة، وبالتالي يجب ضرب تركيز وجدت في الخطوة 2.3.9 2.5 لتحديد تركيز العينة الخام EV.
  11. حساب إحصاءات مثل المتوسطات والانحراف المعياري والخطأ المعياري للمتوسط ​​لكل مجموعة من مكررات.
    ملاحظة: في بعض الحالات تتداخل بين المركبات الكهربائية والخرز البوليسترين ارتفعت لوحظ. إذا كان مطلوبا لتصحيح التقليل من تركيز EV، كما ينبغي قياس العينات دون الخرز البوليسترين ارتفعت. استخدام نفس والمعالمقبالة كما تم تحديدها في الخطوة 2.3.2 لتحديد نسبة "حبة ل-EV"، لحساب نسبة المركبات الكهربائية التي تقع ضمن مجموعة من الخرز البوليسترين ارتفعت. ينبغي أن تضاف هذه النسبة حبة إلى EV EV لنسبة إلى حبة تحديدها في الخطوة 2.3.8.

2.4. اختياري: EV توزيع حجم باستخدام أسلوب بديل.

  1. فتح تسجيل العينة مرتين في جناح تحكم البرنامج.
  2. تعيين خيارات مرشح واحد من عينات لجسيمات عرض فقط أكبر من قطع تحديدها أعلاه. وهذا عرض الجسيمات المعايرة فقط.
  3. تعيين العينة التي تمت تصفيتها إلى "ملف معايرة" وأدخل وضع حجم من الخرز المعايرة.
  4. زوجين نموذج ملف و"ملف معايرة" بإنشائه في الخطوة 2.4.3 كما هو موضح في 1.4.2. سوف نموذج ملف الآن عرض توزيع حجم كل المركبات الكهربائية والخرز المعايرة على أساس الخرز المعايرة ارتفعت.
    ملاحظة: أوبرا القياسيةسوف بروتوكول تينغ غالبا ما تكفي لتحديد حجم التوزيعات من المركبات الكهربائية. لكن في بعض الأحيان، مكونات عازلة الدقيقة غير معروفة (على سبيل المثال في البلازما أو البول) مما يجعل من المستحيل لإعداد عينة من الخرز المعايرة في نفس عازلة مثل المركبات الكهربائية في المصالح. عينة EV ارتفعت مع جزيئات المعايرة يمكن استخدامها لEV-حجم تقدير في هذه الظروف محددة.

Representative Results

لاستخدام أداة الحزب الراديكالي عبر الوطني، وهو ثقب النانو غير موصل لابد من وضعها على 4 أحضان آلة (الشكل 1A) والجهد (الشكل 1B) لابد من تطبيقها. بمجرد تحديد خط أساس التيار الكهربائي، وسيتم الكشف عن نبضات مقاوم الناجمة عن الجسيمات التي تمر عبر المسام كما هو موضح في الشكل 1C.

تم تنقيته من المركبات الكهربائية طاف ثقافة الخلية من ورم أرومي دبقي خط الخلية U87-MG / EGFRvIII بواسطة تنبيذ فائق. ويلاحظ وجود الجسيمات مستقرة معدل مؤامرة عند قياس المركبات الكهربائية معزولة (الشكل 2A) على ثقب النانو NP100. هذا مطلوب مستقرة الجسيمات معدل مؤامرة لقياس تركيز موثوق EV. بعد الاقتران تسجيل EV-العينة إلى تسجيل 115 نانومتر الخرز البوليسترين المعايرة، توزيع حجم (الشكل 2B) وتقدير تركيز EV-عينة يمكن الحصول على (لا تظهر البيانات).

وتم قياس كمية = "jove_content"> المركبات الكهربائية أيضا مباشرة في ورم أرومي دبقي زراعة الخلايا طاف. عند قياس المركبات الكهربائية في العينات البيولوجية، ثقب النانو انسداد غالبا ما يؤدي إلى انقطاع و / أو تقلبات في مؤامرات معدل الجسيمات (Figrue 3A). وهذا يؤدي إلى عدم دقة تقديرات تركيز EV. بواسطة ارتفاعه العينة مع الخرز البوليسترين تركيز معروف والحجم، يمكن تحديد نسبة EV إلى حبة. يوضح الشكل 3B النتائج المتحصل عليها بعد ارتفاعه خلية ثقافة طاف مع الخرز البوليسترين من 335 نانومتر في الحجم. لوحظ اثنين من السكان واضح. الجسيمات الأمر الذي أدى إلى حصار أقل من 0.46 غ المركبات الكهربائية هي مصممة، يتم تحديد الجزيئات الكبيرة الخرز البوليسترين. يتم استخدام نسبة من المركبات الكهربائية لالخرز البوليسترين لحساب تركيز الخام من المركبات الكهربائية (الجدول 1). يوضح الشكل 3C تقدير حجم السكان اثنين بناء على الخرز البوليسترين ارتفعت. إعادة الإعداد ثقب النانو المستخدمةsulted في الكشف عن المركبات الكهربائية> 140 نانومتر في الحجم. هذا يمكن تخفيضها عن طريق الحد من فتح ثقب النانو، ولكن هذا سوف يؤدي أيضا إلى انسداد الأحداث أكثر.

الشكل 1
الشكل 1: qNano أداة وطريقة عملها. (A) صورة من الصك. يتم وضع وثقب النانو على الصك، وفصل خلية السوائل أقل من خلية السوائل العليا. محمية خلايا السائل من التداخل الكهربائي البيئي من خلال الغطاء التدريع. (B) رسم توضيحي يبين الانضباطي استشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني). وهناك ثقب النانو مرونة غير موصل وفصل خليتين السوائل. عن طريق تطبيق الجهد ينشأ تيار كهربائي من خلال المسام ثقب في ثقب النانو. كما الحويصلات خارج الخلية التحرك من خلال ثقب النانو، يتم تبديل تدفق الأيونية والكشف عن نبض مقاوم. في الحزب الراديكالي عبر الوطني يمكن ضبطها حجم افتتاح ثقب النانو (خفض أو زيادة) التي تمتد من ثقب النانو عن طريق زيادة المسافة بين أحضان المعارضة الصك، أو الحد من هذه المسافة. (C) مثال توضيحي من البقول مقاوم. حجم نبض مقاوم واحد يتناسب مع حجم الجسيمات: البقول أكبر تشير الجسيمات الأكبر حجما الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الجسيمات العد المؤامرة وحجم التوزيع تم الحصول عليها من قياس المركبات الكهربائية المعزولة من U87-MG / EGFRvIII زراعة الخلايا طاف (A) الجسيمات العد مؤامرة تشير كشف الجسيمات المستمر الشامل. تخفيض موجز لparticوقد لوحظ لو كشف ما بين 80 و 100 ثانية من التسجيل. بعد التوقف تسجيل والتنصت الغطاء التدريع، استقر معدل الجسيمات التي استؤنفت بعد التسجيل. (B) يتم رسم توزيع حجم المركبات الكهربائية المعزولة بعد معايرة عينة غير معروفة (السيارات الكهربائية) إلى 115 نانومتر الخرز البوليسترين المعايرة. (5 نانومتر بن حجم). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الشكل 3: الحزب الراديكالي عبر الوطني الكمي من المركبات الكهربائية في خلية ثقافة طاف باستخدام بروتوكول بديل. (A) المؤامرات معدل الجسيمات النموذجية التي تم الحصول عليها عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السائل البيولوجي. انسداد المسام يسبب انقطاع قصيرة والتقلبات في معدل كشف الجسيمات. كلتمثل مؤامرة قياس تكرار لنفس العينة. الرسوم البيانية (B) ثلاثة تكرار حجم التوزيع التي تم الحصول عليها بعد ارتفاعه خلية ثقافة طاف مع 335 نانومتر الخرز البوليسترين المعايرة. ويتم اختيار جميع الجزيئات الأمر الذي أدى إلى نبض مقاوم أقل من 0.46 غ والمركبات الكهربائية. يمكن استخدامها (C) والخرز البوليسترين ارتفعت للحصول على حجم توزيع العينة. (5 نانومتر بن حجم). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

<TD> 116
قياس المعايرة فقط # 1 المعايرة فقط # 2 طاف # 1 طاف # 2 طاف # 3
متوسط ​​الحالية (غير متوفر) 117 120 118 120
معدل الجسيمات 172 194 250 246 196
قطع يستخدم (NA) 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46
مجموع الجسيمات 303 317 489 488 454
الحويصلات خارج الخلية 3 1 213 215 213
ارتفعت الخرز المعايرة 300 316 276 273 241
المركبات الكهربائية / الخرز المعايرة 0.01 0.003 0.772 0.788 0.884
عينة - الخلفية 0.765 0.781 0.877
الحويصلات Extracelullar (10 7) / مل 7.14 7.29 8.18
عينة 2.5x و المخفف
المركبات الكهربائية تركيز الخام (10 7) / مل 17.85 18.22 20.46

الجدول 1: مثال لحساب تركيز EV باستخدام بروتوكول بديل قيمة قطع عازمة على التمييز بين المركبات الكهربائية من الخرز المعايرة. بعد ذلك، يمكن استرداد إجمالي عدد المركبات الكهربائية والخرز. لكل قياس يتم احتساب نسبة EV إلى حبة. يتم حساب كمية من الجسيمات الخلفية في الكهارل (للبروتين المجاميع سبيل المثال) عن طريق حساب متوسط ​​نسبة EV إلى حبة للقياسات الفردية من 'الخرز المعايرة فقط "عينة. لكل عينة وطرح نسبة من خلفية النسبة التي حصل عليها. هذا adjusteيتم ضرب نسبة د من تركيز حبات المعايرة في العينة (في هذا المثال: 9.33e7 / مل). لتحديد تركيز الخام من المركبات الكهربائية، يتم ضرب تركيز حصلت عليها عامل المركبات الكهربائية التخفيف الكلي (في هذا المثال: 2.5).

Discussion

البروتوكولات الموضحة في هذه المنهجيات عرض مخطوطة لتقدير حجم وخصائص المركبات الكهربائية باستخدام الحزب الراديكالي عبر الوطني. أهم مزايا منصة الحزب الراديكالي عبر الوطني هي صغر حجم العينة، النسبية قياس مدة قصيرة وغياب المطلوبة التلاعب العينة.

شرط أساسي لقياس دقيق الحزب الراديكالي عبر الوطني هو الحفاظ على ظروف مماثلة بين معايرة والعينة. هذا يشمل استخدام مخازن مماثلة وكذلك إعدادات أداة مماثلة، مثل حجم ثقب النانو، والجهد والضغوط التي مورست. وVPM الأصلي يفتقر الى آلية لتحديد الدقيق للضغط المطبق، مما يسبب اختلافات طفيفة في الضغوط التي مورست بين العينات. أيضا، تبخر السوائل في فتيلة VPM يمكن أن تحدث اختلافات طفيفة عند قياس الضغط عند نقاط زمنية مختلفة وVPM يجب بالتالي غالبا ما يعاد معبي. ويحتمل أن تكون هذه القيود تم حلها بواسطة إدخال VPM2، التيلديه القياس القائم على نقرة ويقوم ضغط الهواء.

بروتوكول بديل وصفها في هذه المخطوطة هي مناسبة خاصة لقياس المركبات الكهربائية في العينات البيولوجية غير المنقى 17. ونحن نعتقد أن مكونات العازلة، مثل السكريات والدهون والبروتينات وغيرها من الحطام أكبر، ويمكن في بعض الحالات تؤثر على الكثير من شروط القياس لبروتوكول قياسي لتكون قابلة للتطبيق. إضافة الخرز المعايرة للعينة بدلا من المقارنة بين اثنين من القياسات منفصلة يقدم "المعايرة في الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة عند مقارنة عينات (مثل بلازما الدم من مختلف الجهات المانحة) التي لديها مختلفة و / أو غير معروفة محتويات خلفية الموائعية. على الرغم من وجود اختلافات بين المركبات الكهربائية وجزيئات البوليستيرين (مثل كثافة الجسيمات وتهمة السطحية)، والنماذج النظرية وكذلك البيانات التجريبية تؤكد على قابليتها للاستخدام من الخرز البوليسترين لتقدير حجم والتنميط من المركبات الكهربائية،تحت شرط أن يتم تطبيق ضغط كبير 15،19. للحد من تأثير القوى حركي كهربي، وينصح استخدام من أكبر نسبيا NP150 / NP200 ثقب النانو وضغط إيجابي كبير.

وتتميز السيارات الكهربائية والخرز المعايرة من حيث الحجم. وبالتالي، فإن ثقب النانو لابد من فتح طريق تطبيق تمتد، إلى قطر حيث لوحظ الكشف عن كل من المركبات الكهربائية ومعايرة جزيئات أكبر. منذ افتتاح المسام وتقلل من حساسية تجاه جسيمات أصغر، المركبات الكهربائية فقط أكبر من حجم معين يتم تسجيلها (غالبا المركبات الكهربائية> 120 نانومتر عند استخدام 335 نانومتر المعايرة حبة). يمكن انخفض الحد الأدنى لكشف المركبات الكهربائية إلى حوالي 90 نانومتر، وذلك باستخدام 203 نانومتر الخرز المعايرة على ثقب النانو NP150. ومع ذلك، قد يكون هذا الإعداد غير مجدية عندما المركبات الكهربائية الكبيرة تحفز انسداد المتكرر للثقب النانو. وجود هذه المركبات الكهربائية عرقلة قد يجبر الاستفادة من الإعداد حيث يبلغ عدد سكانها المركبات الكهربائية، صغير جدا لالجرميةCH يقع عتبة الكشف، لن يتم الكشف عنها.

صعوبة لتشغيل يزيد النظام عند محاولة قياس جسيمات أصغر من 100 نانومتر في الحجم. في مثل هذه الحالات، يمكن تحسين الكشف عن طريق زيادة تركيز ملح بالكهرباء. ومن شأن زيادة تركيز أيون تحفز زيادة نسبيا مقادير الحصار عن جزيئات صغيرة (أكبر نسبة الإشارة إلى الضوضاء). جدوى هذه التقنية لقياس المركبات الكهربائية لابد من التحقق من صحتها على الرغم، كما زاد تركيز الملح قد يؤثر على حجم المركبات الكهربائية.

في الختام، ومنصة الحزب الراديكالي عبر الوطني يمكن استخدامها لتقدير حجم المباشر وتوصيف المركبات الكهربائية. منذ لا يلزم العزلة أو التلاعب EV (الضد ملزمة أو وضع العلامات الفلورية)، ومنصة مناسبة لتقدير EV المباشر في السوائل البيولوجية. يتم توفير بروتوكول بديل يمكن أن تكون مفيدة للعينات حيث مكونات عازلة تحفز cloggin المسام الكبيرةز الأحداث، مما يجعل استخدام موثوق لبروتوكول قياسي غير مجدية.

Disclosures

تطوير بروتوكول الواردة وكتابة هذه المخطوطة وقد تم دعم ماليا، في جزء منه، من قبل مؤسسة الهولندية الدماغ، مؤسسة شوماخر كرامر، وصندوق Bohnenn. تم sponsorted إنتاج هذا المقالة الفيديو جزئيا Izon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qNano instrument Izon Science Ltd. N/A
Variable pressure module Izon Science Ltd. N/A
Nanopore Izon Science Ltd. NP100, NP200 Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.
Calibration Particles Izon Science Ltd. CPC100, CPC200, CPC400 Calibration particles are available in different sizes.
Sonication bath Multiple available Basic sonication bath is sufficient
(Mini) vortexer Multiple available
Lift-free tissues Multiple available
Phosphate Buffered Saline (PBS) Multiple available
Windows based computer
Izon Control Suite 2.2 Izon Science Ltd. N/A
Spreadsheet Software Multiple available N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
  2. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
  3. Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
  4. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
  5. Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
  6. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
  7. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
  8. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
  9. Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
  10. Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
  11. Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
  12. Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
  13. Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
  14. Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
  15. Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
  16. Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
  17. Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
  18. Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
  19. Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 92، exosomes، microvesicles، الحويصلات خارج الخلية، الكمي، وتوصيف، الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار، qNano
الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maas, S. L. N., De Vrij, J.,… More

Maas, S. L. N., De Vrij, J., Broekman, M. L. D. Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. J. Vis. Exp. (92), e51623, doi:10.3791/51623 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter