Summary
Ekstracellulære vesikler spiller vigtige roller i fysiologiske og patologiske processer, herunder koagulering, immunrespons og kræft eller som potentielle terapeutiske midler i drug delivery eller regenerativ medicin. Denne protokol indeholder metoder til kvantificering og størrelse karakterisering af isolerede og ikke-isolerede ekstracellulære vesikler i forskellige væsker ved hjælp af justerbar resistiv puls sensing.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EVS), herunder 'mikrovesikler «og» exosomer «, er meget rigelige i kropsvæsker. De seneste år har der været en enorm stigning i interesse i elbiler. EVT har vist sig at spille vigtige roller i forskellige fysiologiske og patologiske processer, herunder koagulering, immunresponser, og kræft. Desuden elbiler har potentiale som terapeutiske midler, for eksempel som drug delivery køretøjer eller regenerativ medicin. På grund af deres lille størrelse (50 til 1.000 nm) nøjagtig kvantificering og størrelse profilering af elbiler er teknisk udfordrende.
Denne protokol beskriver, hvordan afstemmelige resistiv puls sensing (TRP) teknologi, ved hjælp af qNano system, kan anvendes til at bestemme koncentrationen og størrelsen af elbiler. Metoden, der bygger på påvisning af elbiler Ved overførslen gennem en nano mellemstore pore, er relativt hurtigt, tilstrækkeligt brugen af små prøvevolumener og kræver ikke, at PURverifikationsprogrammet og koncentration af elbiler. Næste til den almindelige drift protokollen en alternativ metode beskrives med prøver tilsat polystyrenkugler med kendt størrelse og koncentration. Denne realtid kalibrering teknik kan anvendes til at overvinde tekniske forhindringer stødt ved måling elbiler direkte i biologiske væsker.
Introduction
Vesikler fra cellulær oprindelse er meget rigelige i kropsvæsker 1. Disse såkaldte ekstracellulære vesikler (EVS) (50 - 1.000 nm i størrelse) er dannet af enten fusion af multi-vesikulære organer med cellemembranen eller ved direkte udad knopskydning for cellemembranen. I de senere år har videnskabelig interesse i elbiler steget kraftigt, hvilket resulterer i et væld af EV-fokuserede publikationer, hvor nye funktioner og egenskaber af elbiler er beskrevet 1. Elbiler er nu menes at være involveret i en bred vifte af fysiologiske og patologiske processer, såsom signaltransduktion, immun regulering, og blod koagulation 1-4. I kræft, synes elbiler til at spille en rolle i dannelsen af premetastatic nicher 5,6, overførsel af pro-kræft indhold 7,8 og stimulering af angiogenese 8. Ud over dette, er elbiler udforsket som levering agenter for terapeutiske midler 9.
Trods disse deviklingen, pålidelig kvantificering af elbiler er fortsat udfordrende. Traditionelt anvendes indirekte kvantificering, der er afhængige af kvantificering af det samlede proteinindhold eller specifikke proteiner. Selvom bredt anvendt, har disse teknikker ikke højde for protein-per-EV forskelle, og ikke diskriminerer mellem forurenende protein aggregater og proteiner i elbiler. Desuden disse teknikker kræver isolering af elbiler, som i mange tilfælde gør sammenligning af EV-koncentrationer i biologiske prøver umuligt.
Derfor arbejdes der på at udvikle nye metoder, der giver mulighed for mere præcis og direkte EV måling 10. Denne rapport beskriver brugen af tunable resistiv puls sensing (TRP) til pålidelig kvantificering og størrelse profilering af elbiler.
Øjeblikket qNano instrument (figur 1a) er den eneste kommercielt tilgængelige platform for TRP. I TRP, en ikke-ledende elastisk membran præget with en nanostørrelse pore adskiller to fluidumceller. En af de flydende celler fyldt med prøven af interesse, mens den anden celle er fyldt med partikel-fri elektrolyt. Ved at anvende en spænding, der er etableret en ionisk strøm / elektrisk strøm, der er ændret ved overførsel af partikler gennem pore (1b figur). Størrelsen af denne aktuelle blokade ("resistiv puls") er proportional med mængden af partiklen 11 (figur 1c). Blokaden Varigheden kan bruges til at vurdere Zeta-potentialet af partikler, der bygger på partikel egenskaber såsom ladning eller forme 12. Størrelse profilering af ukendte partikler kan udføres ved at sammenligne de resistive impulser forårsaget af ukendte partikler med resistive impulser forårsaget af kalibrering partikler med en kendt diameter. Ud over omfanget af en blokade omstændigheder er hastigheden af hvor disse forekommer målt. Denne tæller sats relies på partikelkoncentrationen. Da koncentration og blokader er lineært proportional 13 med et enkelt kalibreringsprøve med partikler med kendt koncentration og partikelstørrelse giver mulighed for måling af koncentration 14 og størrelsesfordelingen 11 af en ukendt prøve.
Bevægelsen af partikler gennem nanopore bestemmes af elektro kinetic- (elektroforese og elektro-osmotisk) og fluidic kræfter 15. Ved hjælp af den variable tryk modulet (VPM) en trykforskel mellem de flydende celler kan induceres som en yderligere kraft. Påtrykning af positivt tryk forøger strømningshastigheden af partikler, som kan være af fordel, når partikelkoncentrationen er lav. Desuden kan tryk påføres for at reducere effekten af elektro-kinetiske kræfter. Dette er især vigtigt, når du bruger nanopores med en relativ lille porediameter (NP100, NP150 og muligvis NP200), som ofte bruges til påvisning af elbiler.For disse nanopores, selv når de anvender betydeligt pres, de elektro-kinetiske kræfter kan, afhængigt af partikel overflade afgift, forbliver nonnegligible 16. Ved at måle partikel hastigheden på mange belastninger, en elektromagnetisk kinetisk rettet, og dermed mere præcis, kan EV koncentrationen beregnes.
Her er detaljerede protokoller forudsat at bestemme størrelsesfordelingen og koncentrationen af elbiler. Ved siden af den almindelige drift-protokollen, er en alternativ metode, der er beskrevet, hvor prøverne tilsat polystyrenkugler med kendt størrelse og koncentration 17. Denne realtid kalibrering teknik kan anvendes til at overvinde nogle af de tekniske udfordringer opstår, når måling elbiler direkte i biologiske væsker, såsom urin, plasma og cellekultursupernatant eller når stabiliteten af nanopore over en lang måleperiode tid ikke kan være sikret.
Protocol
1. Standard Operating protokol
1.1 Instrumentopsætning og Prøveforberedelse
- Tilslut instrumentet til en computer med Izon Control Suite-softwaren installeret.
- Vælg den nanopore størrelse at bruge: for størrelse og koncentration måling af elbiler en NP150 (mål størrelsesorden 85-300 nm) eller NP200 (mål størrelsesorden 100 - 400 nm) der oftest anvendes. Når man arbejder med EVT, der er blevet isoleret ved hjælp af en protokol, der involverer fjernelse af større elbiler, for eksempel ved at lede prøven gennem et 220 nm filter, en NP100 pore (mål størrelsesområdet 70-200 nm) kan anvendes. Når man arbejder med elbiler i en biologisk prøve eller elbiler isoleret ved hjælp af en anden protokol, kan NP200 anvendes, da det vil få tilstoppet sjældnere. Andre nanoporer såsom NP300 (mål størrelsesområdet 150-600 nm) eller NP400 (mål størrelsesområdet 200-800 nm), eller endnu større nanoporer, kan anvendes til større typer af elbiler.
- Vælg polystyren Kalibration partikler, der supplerer den valgte i trin 1.1.2 nanopore. For en NP100, NP150 og NP200 nanopore bruge CPC100, CP100 og CPC200 partikler hhv. For nøjagtig størrelse estimering, sikre, at kalibreringen partikler har en lignende størrelse som de ukendte partikler.
- For at sikre ensartethed i de kalibreringspartikler, vortex kortvarigt (30 sek). Eventuelt anvendes sonikering for at fjerne aggregater.
- Fortynd kalibreringskurverne partikler i PBS til den tilsigtede koncentration i et volumen på mindst 40 ul. Bemærk: Koncentrationen mål varierer baseret på den valgte i trin 1.1.2 nanopore. Målkoncentrationer leveres med nanopores.
- Anvend og direkte fjerne 78 pi PBS på den nederste fluidumcelle; denne befugtning af lavere fluidumcelle reducerer risikoen for luft bobledannelse under nanopore ved anvendelsen af en elektrolyt til den nedre fluidumcelle når nanopore er i position.
- Placer nanopore på de 4 arme instrumentet. Brugde digitale calipre til at måle afstanden mellem to modstående arme og indtast afstanden i mm i "Stretch" input feltet og klik på "kalibrere strække" at kalibrere nanopore strækning.
- Stræk nanopore til 47 mm, ved at dreje sidehjul og dermed at øge afstanden mellem de modstående arme instrumentet, før genanvende 78 pi PBS til den nedre fluidumcelle.
Bemærk: Elektrisk interferens kan i væsentlig grad påvirke kvaliteten af målinger. Når du bruger en bærbar computer til at køre Izon Control Suite-softwaren, skal du sørge for den bærbare computer er sluttet til elnettet ved hjælp af en jordet stikdåse og stik. Mobiltelefoner opbevares i nærheden af instrumentet kan også være en kilde til elektrisk interferens. Elektrisk interferens observeret som konstant gentagne toppe i baseline strøm, ofte med geometriske middelværdi (RMS) støj> 10 Pa.
Bemærk: Næsten enhver buffer kan anvendes til at fortynde kalibrering partikler og elbiler til TRP håndvÃning. Tilstedeværelsen af salte er en forudsætning for etableringen af en elektrisk strøm. For EV målinger bruger PBS som en buffer. Kalibreringspartikler bør altid fortyndes i den samme buffer som elbiler for at sikre nøjagtige målinger.
1.2. Bestem de optimale indstillinger til måling
Bemærk: Før optagelse, er det vigtigt at etablere optimale indstillinger måling. Blokaden størrelsesorden forårsaget af en partikel passerer gennem nanopore er afhængig af den anvendte strækning og den anvendte spænding. For pålidelige målinger RMS støj bør være <10 Pa og mode blokade størrelsesorden skal være> 0,1 nA.
- Anbring den øverste fluidumcelle og afskærmning bur på nanopore og indføre 40 pi fortyndet kalibrering partikler i den øvre væske celle. Brug VPM at anvende ≥0.8 kPa overtryk.
- Reducer den anvendte strækning langsomt mod 44 mm, mens analysere blokaden hændelser forårsaget af kalibreringenpartikler. Bemærk: Når du reducere porediameteren bevægelsen af partikler gennem nanopore vil være mindre tilbøjelige og dermed partikel sats vil falde. Men på grund af øget relativ blokade af pore et større blokade begivenhed vil opstå resulterer i forbedret signal-støj-forholdet. Forøgelse af spænding kan yderligere øge blokade størrelse, men kan også øge RMS støj.
- Reducer strækning indtil passende blokade begivenheder (figur 1c) er observeret i "Signal Trace" panel. (Mode> 0,1 na) og den tilsvarende partikel sats er> 100 / min. Bemærk: Den partikel sats er en mindre streng cut-off, men som målinger af mindst 500 partikler er ideelle, vil partikel satser <100 / min forårsage optagelse varigheder på mindst 5 min. Partikel satser højere end 2.000 / min kan resultere i mindre nøjagtige målinger (hvis til stede, bør prøve fortynding skal udføres).
1.3 Måling af kalibreringPartikler, Vask af uper fluidumcelle og målesamplen
- I dette afsnit elbiler fra cellekultursupernatanten af glioblastom multiforme cellelinie U87-MG / EGFRvIII karakteriseres. Isoleringen og fremstillingen af disse elbiler er tidligere blevet beskrevet og visualiseret 18.
- Placer kalibrering partikler i den øvre væske celle. Påfør tryk (for eksempel 0,8 kPa) ved hjælp af VPM og Record> 500 partikler.
- Hvis der udføres en multi-trykmåling forøge det påførte tryk (for eksempel til 1,0 kPa), og optage en anden kalibrering fil. Bemærk: Et minimum på 0,2 kPa forskel er påkrævet.
- Fjern kalibreringsprøve fra den øvre væske celle. Vask øvre fluidumcelle 3 gange med 100 pi PBS for at fjerne resterende partikler. Før indførelsen af prøven i den øvre fluidumcelle bruge fnugfri væv at fjerne eventuelle PBS fra den øvre væske celle.
- Indførelse prøven til det øverste fluidumcelle. Sørg for, at baseline strøm er inden for 3% af baseline strøm observeret ved måling af kalibrering partikler. Hvis ikke inden for 3%, anvende den strategi, der er beskrevet nedenfor for at stabilisere baseline strøm. Anvend de nøjagtige pres som anvendt på de kalibreringspartikler og registrere eksempelfilerne.
Bemærk: Partiklen rate plot skal vise konstant afsløring partikel (figur 2a). I tilfælde af pludselig afbrydelse af afsløring partikel, et pludseligt fald i baseline strøm, eller en pludselig stigning i RMS støj kan pore tilstoppet; således, holde pause i optagelsen. For at genoprette grundlinjen, skal du trykke på eller vride afskærmningshætte gælder stemplet, eller helt fjerne nanopore og vask det med demineraliseret vand og sæt det på instrumentet.
Bemærk: Alternativt kan øge nanopore strækning til 47 mm i kombination med maksimal pres fra VPM i ca 5 min.
1.4 Dataanalyse
- Klik på "; Analyser datafane "for at indtaste analyse del af softwaren. Behandle kalibreringen og prøve filer ved at højreklikke på "uforarbejdet Files" og vælge "Proces filer".
- Klik på afkrydsningsfeltet ved siden af prøven i kolonnen "Kalibreret" til par eksempelfilerne til kalibrering optagelser. Vælg tilsvarende prøve og kalibrering filer og klik på "OK". Bemærk: når du bruger multi-tryk kalibrering option vælge "Multi-tryk kalibrering" fanen til venstre for at par flere prøver til flere kalibreringsfiler.
- Når succesfuldt koblet, vil Izon Control Suite-softwaren vise forskellige sample karakteristika såsom en størrelse-fordeling (2b figur), baseline varigheder, halvt maksimum fuld bredde (FWHM) og en koncentration analyse. Valgfrit: For hver prøve individuelle datapunkter kan eksporteres som en kommasepareret fil.
2. Enlternative Protokol - Spiking Prøver med kalibreringsperler
Bemærk: I almindelighed kan det standardprocedure, der anvendes, når der arbejdes med isolerede elbiler. Når man arbejder med ikke-isolerede elbiler i biologiske prøver, eller isolerede EV præparater forurenet med store proteinaggregater, der virker i instrumentet kan være udfordrende. Disse udfordringer består hovedsagelig af en høj nanopore blokering (pludseligt fald i baseline strøm), manglende evne til at inddrive baseline strømninger inden for 3% af måling kalibrering eller signifikante forskelle i partikel satserne mellem identiske prøver (figur 3A). For prøver, der viser disse vanskeligheder en alternativ protokol til at kvantificere elbiler blev udviklet 17. Denne metode bygger på indførelse af større polystyren kalibreringsperler i prøven af interesse (figur 3b). En detaljeret procedure for denne alternative protokol er beskrevet nedenfor.
2.1. PrøveForberedelse
Bemærk: Når du forbereder prøver ved hjælp af den alternative metode, er det ønskeligt at etablere en EV-til-perle ratio på omkring 1. Det er også vigtigt at medtage en "kalibrering perle kun 'prøve, at give mulighed for præcise" gating "af kalibreringsperler og til at bestemme antallet af baggrunden partikler (f.eks proteinaggregater) til stede i bufferen.
- Centrifuger 100 ul cellekultursupernatant for 7 minutter ved 300 xg
- Tilsæt 20 ul af supernatanten til 20 pi PBS og 10 pi 75 gange fortyndet 335 nm polystyren perler (lager 7e10 / ml).
2.2. Prøve Måling
- Brug strategi er beskrevet i afsnit 1.2 til at bestemme de optimale indstillinger af instrumenter.
- Mål 'kalibrering perle kun "prøve først. Sørg for at baggrunden detektering af små ikke-perle partikler er så lavt som muligt (<10% af kuglerne).
- Mål enkelte sample gang før optagelsen replikeres for at fordele udsving i nanopore betingelser ligeligt over de forskellige prøver. Måle mindst 3 gentagelser af hver prøve.
- En ny måling af 'kalibrering perle kun "prøve efter endt registrering af alle prøver.
2.3. Dataanalyse
Bemærk: Når du bruger den alternative protokol, er udelukkende til brug for Izon Control Suite-softwaren ikke tilstrækkeligt til koncentration beregning. Yderligere regneark software er påkrævet. Tabel 1 viser et eksempel på koncentrationen beregning af afbildet i figur 3 prøver.
- Åbn 'kalibrering perle kun "prøve og en eller flere prøveenheder filer.
- Bestem hvilken blokade begivenhed størrelse (i nA) kan anvendes som en cut-off for skelnen mellem elbiler og polystyrenkugler. Bestemmelse af blokade værdi (nA) svarende til den venstre bunden af polystyrenperler befolkning (
- Hent værdierne for den samlede partikel tæller for hver prøve ved at klikke på "Particle Analysis Summary" fanen af prøven.
- Filtreres datasæt ved hjælp af cut-off-niveau bestemt i trin 2.3.2. ved at vælge "Datafiltrering" pop-up. Display partikler alene mindre end cut-off.
- Hent værdier EV tæller for hver prøve fra "Particle Sammenfattende analyse".
- Fratræk mængden af elbiler fra de samlede partikler til at bestemme mængden af kalibreringsperler.
- Bestem EV-til-perle-forhold ved at dividere VE tæller ved kalibrering perle tæller.
- Bestem den gennemsnitlige baggrund ratio med gennemsnittet af de nøgletal der er fastsat for hver &# 8220; perle kun "kalibrering prøve. Fratræk denne værdi fra hver enkelt prøve.
- Multiplicer den justerede EV-til-perle ratio med koncentrationen af kalibreringsperler at bestemme koncentrationen af elbiler for hver prøve.
- Multiplicer koncentrationen fundet i trin 2.3.9 ved VE fortyndingsfaktoren indført ved tilsætning af kalibrering perler EV prøven. Bemærk: I setup eksempel, bestemmes den samlede fortynding af prøven i PBS og kalibrering perler er 2,5 gange, og dermed koncentrationen fundet i trin 2.3.9 skal ganges med 2,5 for at bestemme den rå EV prøve koncentration.
- Beregn statistik såsom gennemsnit, standardafvigelse og standardfejl af middelværdien for hver gruppe af gentagelser.
Bemærk: I nogle tilfælde overlapper mellem elbiler og spidse polystyrenkugler overholdes. Hvis korrektion for undervurdering af EV-koncentration er nødvendig, bør også måles prøver uden spidse polystyrenkugler. Brug samme udskæringenud som bestemt i trin 2.3.2 at bestemme en "perle-til-EV" forhold, at beregne forholdet mellem elbiler, der falder inden for området af spidse polystyrenkugler. Denne kugle-til-EV-forholdet bør føjes til EV-til-perle forholdet bestemt i trin 2.3.8.
2.4. Valgfrit: EV Size distribution via den alternative metode.
- Åbn en prøve optagelse to gange i Control Suite-softwaren.
- Indstil filter muligheder for en af prøverne til kun at vise partikler større end cut-off fastlagt ovenfor. Dette vil vise kun kalibreringspartikler.
- Indstil den filtrerede prøve til "kalibrering fil" og indtast funktionen størrelse kalibreringsperler.
- Par prøven filen og "kalibrering filen" oprettet i trin 2.4.3, som beskrevet i 1.4.2. Prøven fil vil nu vise en størrelse fordeling af både elbiler og kalibreringsperler baseret på spidse kalibreringsperler.
Bemærk: Det standard operaTing protokol vil oftest være tilstrækkeligt til bestemmelse af size-distributioner af elbiler. Sommetider dog, nøjagtige pufferkomponenter er ukendte (for eksempel i plasma eller urin), som gør det umuligt at udarbejde en prøve af kalibreringsperler i den samme buffer som EVS af interesse. En EV prøve tilsat kalibreringspartikler kan bruges til EV størrelse estimering i disse særlige omstændigheder.
Representative Results
For at bruge TRP instrument, et ikke-ledende nanopore skal placeres på de 4 arme maskinen (figur 1a) og en spænding (figur 1b) skal anvendes. Når en elektrisk baseline strøm er etableret, vil resistive impulser forårsaget af partikler, der passerer gennem pore detekteres som vist i figur 1c.
EVT blev oprenset fra cellekultursupernatanten af glioblastom cellelinie U87-MG / EGFRvlll ved ultracentrifugering. En stabil partikel rate-plot er observeret ved måling af de isolerede elbiler (figur 2A) på en NP100 nanopore. Denne stabile partikel sats-plot er nødvendige for en pålidelig EV koncentration måling. Efter parring af EV-prøve optagelse til en optagelse på 115 nm polystyren kalibrering perler, en størrelse fordeling (figur 2B) og koncentration estimat af EV-prøve kan opnås (data ikke vist).
(Figrue 3a). Dette resulterer i unøjagtige EV skønnede koncentrationer. Ved at tilsætte prøven med polystyrenperler af kendt koncentration og størrelse, kan et EV-til-perle-forhold bestemmes. 3b illustrerer resultaterne opnået efter spiking cellekultursupernatant med polystyrenperler af 335 nm i størrelse. To klare populationer overholdes. Partiklerne inducerer en blokade af mindre end 0,46 nA bestemmes elbiler, de større partikler bestemmes polystyrenkugler. Forholdet mellem elbiler til polystyrenperler anvendes til at beregne den rå koncentration af elbiler (tabel 1). Figur 3c illustrerer størrelsen estimering af de to populationer baseret på spidse polystyrenperler. Den nanopore opspændingssituationen rehøres i påvisning af elbiler> 140 nm i størrelse. Dette kan sænkes ved at reducere nanopore åbning, men det vil også resultere i mere tilstopningsproblemer arrangementer.
Figur 1: qNano instrument og driftsform. (A) Fotografi af instrumentet. En nanopore er placeret på instrumentet, at separere en lavere fluidumcelle fra en øvre væske celle. De fluidumceller er beskyttet mod miljømæssige elektrisk interferens ved afskærmningshætte. (B) Illustration skitserer tunable resistiv puls sensing (TRP). En ikke-ledende elastisk nanopore er adskiller to fluidumceller. Ved at anvende en spænding etableres en elektrisk strøm gennem pore punkteret i nanopore. Som ekstracellulære vesikler bevæger sig gennem nanopore er den ioniske strøm ændres, og påvist som en resistiv puls. I TRP åbning størrelse nanopore kan indstilles (reduceret eller forøget) ved at strække nanopore ved at øge afstanden mellem de modstående arme instrumentet eller reducere denne afstand. (C) Illustrativt eksempel på resistive impulser. Størrelsen af en enkelt resistiv impuls er proportional med mængden af partiklen:. Større pulser indikerer større partikler Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Particle tælle-plot og størrelse-fordeling opnået fra måling isolerede elbiler fra U87-MG / EGFRvlll cellekultursupernatant (A) Partikelfilter tælle-plot indikerer samlet konstant afsløring partikel.. Kortfattet reduktion af partikle afsløring blev observeret mellem 80 og 100 sekunder for optagelsen. Efter en pause i optagelsen og trykke på afskærmningshætte, partiklen stabiliseret hvorefter optagelsen blev genoptaget. (B) Størrelsen fordeling af isolerede elbiler er afbildet efter kalibrering af ukendt prøve (EVS) til 115 nm polystyren kalibreringsperler. (5 nm bin størrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: TRP kvantificering af elbiler i cellekultursupernatant ved hjælp af alternativ protokol. (A) Typisk partikel forrentede plots opnået ved måling af elbiler direkte i en biologisk væske. Pore tilstopning forårsager korte afbrydelser og udsving i opklaringsprocenten partikel. Hverplot repræsenterer en gengivelse måling af den samme prøve. (B) tredobbelte størrelse distribution grafer opnået efter spiking cellekultursupernatant med 335 nm polystyren kalibreringsperler. Alle partikler inducerer en resistiv puls på mindre end 0,46 nA vælges som elbiler. (C) spidse polystyren perler kan bruges til at opnå en størrelse-fordeling af prøven. (5 nm bin størrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Måling | Kun Kalibrering # 1 | Kun Kalibrering # 2 | Supernatant # 1 | Supernatant # 2 | Supernatant # 3 |
| Gennemsnitlig strøm (NA) | 117 | 120 | <td> 116118 | 120 | |
| Partikel sats | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| cutoff anvendes (Na) | 0,46 | 0,46 | 0,46 | 0,46 | 0,46 |
| Samlet partikler | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| Ekstracellulære vesikler | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| Spiked kalibreringsperler | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| EVS / kalibreringsperler | 0.01 | 0.003 | 0.772 | 0,788 | 0,884 |
| Prøve - baggrund | 0.765 | 0,781 | 0,877 | ||
| Extracelullar vesikler (10 7) / Ml | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| Prøve 2.5x udvandet | |||||
| Rå koncentrationslejre elbiler (10 7) / ml | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
Tabel 1:. Eksempel beregning af EV-koncentration ved hjælp af den alternative protokol En cut-off-værdien er fast besluttet på at skelne mellem elbiler fra kalibreringsperler. Derefter kan det samlede antal elbiler og perler hentes. For hver måling EV-til-kugle-forholdet beregnes. Mængden af baggrunden partikler i elektrolytten (f.eks proteinaggregater) beregnes ved at tage gennemsnittet af EV-til-perle-forhold for de enkelte målinger af »kalibreringsperler kun" prøve. For hver prøve baggrunden forhold subtraheres fra den opnåede forhold. Denne adjusted-forholdet ganges koncentrationen af kalibreringsperler i stikprøven (i dette eksempel: 9.33e7 / ml). For at bestemme den rå koncentration af elbiler den opnåede koncentration ganget med den samlede elbiler fortyndingsfaktor (i dette eksempel: 2,5).
Discussion
De er beskrevet i dette manuskript tilbyde metoder til kvantificering og størrelse karakterisering af elbiler ved hjælp af TRP protokoller. De store fordele ved TRP-platformen er den lille sample størrelse, relativ kort måling varighed og fraværet af krævede prøve manipulation.
Forudsætning for nøjagtig TRP måling er at holde identiske betingelser mellem kalibrering og prøve målinger. Dette omfatter brugen af ens buffere samt identiske indstillinger instrument, såsom nanopore størrelse, spænding og anvendt tryk. Den oprindelige VPM mangler en mekanisme til nøjagtig indstilling af det anvendte tryk, hvorved mindre forskelle i anvendt tryk mellem prøverne. Desuden kan fordampning af priming fluid i VPM fremkalde mindre trykforskelle ved måling på forskellige tidspunkter og VPM derfor ofte re primet. Disse begrænsninger har potentielt blevet løst ved indføring af VPM2, somhar et klik-baserede skalering og lufttryk baseret på.
Den alternative protokol er beskrevet i dette skrift er særlig velegnet til måling af elbiler i ikke oprensede biologiske prøver 17. Vi mener, at buffer komponenter, såsom sukkerarter, lipider, proteiner og andre større klippestykker, kan i nogle tilfælde påvirke måleforholdene for meget for den standard-protokol til at være anvendelig. Tilsætning af kalibreringsperler til prøven i stedet for at sammenligne to særskilte målinger introducerer "real tid kalibrering«. Denne metode er især velegnet, når man sammenligner prøver (fx blodplasma forskellige donorer), der har forskellige og / eller ukendte strømningstekniske baggrund indhold. Selv om der er forskelle mellem elbiler og polystyren partikler (f.eks partikel tæthed og overflade gebyr), teoretiske modeller samt eksperimentelle data understreger anvendeligheden af polystyrenkugler til kvantificering og størrelse profilering af elbiler,under forudsætning, at betydeligt pres påføres 15,19. For at minimere indflydelsen af elektrokinetiske kræfter, er brugen af den relativt større NP150 / NP200 nanopore og signifikant positiv pres tilrådes.
Elbiler og kalibreringsperler er kendetegnet ved størrelse. Følgelig nanopore skal åbnes ved strækning, til en diameter, hvor påvisning af såvel elbiler og større kalibreringspartikler overholdes. Siden åbningen af pore vil reducere følsomhed over for mindre partikler, elbiler kun større end en vis størrelse registreres (ofte elbiler> 120 nm ved brug af en 335 nm kalibrering perle). Den mindste detektionsgrænse for elbiler kan reduceres til cirka 90 nm, ved hjælp af 203 nm kalibreringsperler på en NP150 nanopore. Dog kan denne opsætning ikke være rentable når større elbiler fremkalde hyppige tilstopning af nanopore. Tilstedeværelsen af disse blokerer elbiler kan tvinge udnyttelsen af en opsætning, hvor en population af elbiler, for lille til at reach detektionsgrænsen, ikke vil blive opdaget.
Vanskeligheden at drive systemet stiger, når de forsøger at måle partikler mindre end 100 nm i størrelse. I sådanne tilfælde kan påvisning forbedres ved at øge saltkoncentrationen af elektrolytten. En øget ion fusion vil fremkalde relativt øget blokade størrelser til små partikler (større signal-støj-forhold). Levedygtigheden af denne teknik til måling af elbiler skal valideres dog, som forhøjede saltkoncentrationer kan påvirke mængden af elbiler.
Som konklusion kan det TRP-platformen bruges til direkte kvantificering og størrelse karakterisering af elbiler. Da ingen isolering eller VE manipulation (antistof bindende eller fluorescerende mærkning) er påkrævet, platformen er egnet til direkte VE kvantificering i biologiske væsker. En alternativ protokol er fastsat, at kan være gavnligt for prøver, hvor pufferkomponenter inducere signifikant pore clogging arrangementer, hvilket gør pålidelig udnyttelse af standard protokol urentabel.
Disclosures
Udviklingen af den skitserede protokol og skrivning af dette manuskript blev støttet økonomisk, dels ved den hollandske Brain Foundation, Schumacher Kramer Foundation, og Bohnenn fonden. Produktionen af denne video-artikel blev delvist sponsorted af Izon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
- Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
- Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
- Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
- Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
- Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
- Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
- Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).
